張前勇,趙采芹,石海英,邢靜如,段志強(qiáng)

(1. 貴州大學(xué)高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗室,貴陽 550025;2. 貴州省動物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗室,貴陽 550025;3. 貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,貴陽 550025)

【研究意義】腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子相互作用的具有叉形頭相關(guān)結(jié)構(gòu)域蛋白[Tumor necrosis factor receptor associated factor (TRAF)-interacting protein with a Forked-associated (FHA) domain,TIFA]是一種與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(Tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)具有相互作用的細(xì)胞免疫相關(guān)蛋白,其在白細(xì)胞介素1(Interleukin 1,IL-1)刺激下可介導(dǎo)IL-1 受體相關(guān)激酶1(IL-1 receptor-associated kinase 1,IRAK1)與TRAF6發(fā)生相互作用[1],在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、先天性免疫應(yīng)答、抗病毒感染等方面發(fā)揮重要作用[2-3]。因此,開展雞TIFA和TRAF6的分子特征及其基因在免疫器官中的表達(dá)特性研究,對了解兩者參與的免疫應(yīng)答在相關(guān)病毒復(fù)制的作用機(jī)制研究方面具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】TIFA和TRAF6相互作用調(diào)控核因子-κB(Nuclear factor-kappa B,NF-κB)信號通路介導(dǎo)的炎性免疫應(yīng)答受到了越來越多研究人員的關(guān)注。如,TIFA通過促進(jìn)TRAF6的寡聚化和泛素化來激活NF-κB信號通路上的κB抑制因子激酶(Inhibitor of κB kinase,IKK)與鋅指結(jié)構(gòu)蛋白11(Zinc finger CCHC-type containing 11,ZCCHC11),并調(diào)節(jié)Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)信號通路的傳導(dǎo),進(jìn)而對NF-κB信號通路起到反饋?zhàn)饔肹2,4]。有研究證實(shí),α-蛋白激酶1(alpha-protein kinase 1,ALPK1)的N-端結(jié)構(gòu)域可以特異性識別脂多糖合成的前體糖分子二磷酸腺苷庚糖(ADP-heptose),通過蛋白構(gòu)象變化誘導(dǎo)ALPK1 C-端激酶結(jié)構(gòu)域活化,進(jìn)而磷酸化TIFA;磷酸化后的TIFA發(fā)生寡聚化,并進(jìn)一步與TRAF6相互作用激活下游NF-κB通路,進(jìn)而誘發(fā)炎癥反應(yīng)[5-6]。另外,Maubach等[7]研究發(fā)現(xiàn),TRAF6和TRAF2是TIFA的結(jié)合蛋白,有助于在幽門螺旋桿菌感染時形成TIFAsomes;同時,TIFA/TRAF6的相互作用還能結(jié)合轉(zhuǎn)化生長因子β激活激酶-1(Transforming growth factorβactivated kinase-1,TAK1),導(dǎo)致NF-κB信號通路的激活,而TIFA/TRAF2相互作用導(dǎo)致細(xì)胞凋亡抑制劑1(Cellular inhibitor of apoptosis 1,cIAP1)從TRAF2中瞬時遷移以及cIAP1的蛋白酶體降解,促進(jìn)NF-κB替代通路的激活。最近,Duan等[8]利用定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)感染幼倉鼠腎細(xì)胞后的差異表達(dá)蛋白發(fā)現(xiàn),病毒M蛋白在細(xì)胞質(zhì)中以劑量依賴的方式降低TIFA表達(dá),并通過降低TIFA/TRAF6/NF-κB信號通路產(chǎn)生的細(xì)胞因子來促進(jìn)NDV的復(fù)制和致病性。以上研究對深入認(rèn)識TIFA和TRAF6相互作用調(diào)控的先天性免疫應(yīng)答提供了重要參考。目前,有關(guān)TIFA在機(jī)體組織中的表達(dá)特征研究相對較少,僅門萬夫[9]研究報道,TIFA基因在人肺癌組織中呈高表達(dá),降低其表達(dá)可抑制肺癌細(xì)胞的增殖和遷移;同時,TIFA基因在雞胚不同發(fā)育階段的多種組織中均有表達(dá),其可能參與雞肺臟和肝臟的發(fā)育[10]。但是關(guān)于TRAF6基因的組織表達(dá)特征研究則相對較多,如TRAF6基因在人和不同動物的組織中廣泛表達(dá),特別是在肺臟、肝臟、心臟和脾臟中高表達(dá)[9,11-12];TRAF6基因在家蠅的蛹和成蠅階段表達(dá)量高,其在家蠅發(fā)育中發(fā)揮了重要的免疫防御作用[13]。另外,駱磊[14]研究發(fā)現(xiàn),在正常雞的脾臟、肺臟和胸腺中TRAF6基因的表達(dá)顯著高于其他組織,且在NDV感染雞后的免疫器官中的表達(dá)均顯著上調(diào)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】由于TIFA和TRAF6蛋白相互作用共同參與機(jī)體免疫應(yīng)答,二者在正常雞的免疫器官及NDV感染雞后的免疫器官中的共同表達(dá)特征尚不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問題】首先采用生物信息學(xué)結(jié)合實(shí)時熒光定量PCR(RT-qPCR)方法,通過分析雞TIFA和TRAF6蛋白的分子特征,1～6月齡白來航雞及NDV感染和未感染的4周齡SPF雞免疫器官(脾臟、胸腺、法氏囊)中TIFA和TRAF6基因的表達(dá)水平,探明二者在雞免疫器官中的表達(dá)特征,以期為后期深入研究雞TIFA和TRAF6相互作用調(diào)控NDV復(fù)制的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 白來航雞(White Lehang chicken),購自貴州大學(xué)種雞場,1～6月齡。SPF雞,購自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司,4周齡。

1.1.2 試劑 Total RNA Kit Ⅱ提取試劑盒購自美國OMEGA公司;2×RealStar Green Fast Mixture和StarScript II反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自江蘇康潤生物科技有限公司;膠回收試劑盒購自AxyGen公司;DNA Marker、TAE緩沖液、無水乙醇和瓊脂糖等均購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 NANODROP 2000超微量紫外分光光度計和MaxQ 4000恒溫?fù)u床均購自美國Thermo Fisher公司;C1000 TouchTM PCR擴(kuò)增儀、Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)和CFX 96熒光定量PCR 儀均購自美國BIO-RAD公司;DYY-2C型電泳儀和WD-2105B微量瞬時離心機(jī)均購自北京六一生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 材料預(yù)處理 1～6月齡白來航雞每個月齡挑選3只生長狀況相似的試驗用雞,屠宰后分別取其脾臟、胸腺和法氏囊備用。4周齡SPF雞采用滴鼻點(diǎn)眼的方式以106.0EID50/mL劑量接種NDV強(qiáng)毒株rSS1GFP[15],以接種PBS的SPF雞作為對照,在感染NDV后的第3 、4和5天分別采集雞脾臟、胸腺和法氏囊,保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.2 雞TIFA和TRAF6蛋白的生物信息學(xué)分析 對前期克隆的雞TIFA和TRAF6基因CDS區(qū)編碼的蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析[10],利用DNAStar軟件的EditSeq和MegAlign分別對雞TIFA和TRAF6蛋白的理化性質(zhì)、氨基酸同源性和結(jié)構(gòu)域保守性進(jìn)行分析;利用SOPMA(http://npsapbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和AlphaFold(http://swissmodel.expasy.org/)分別進(jìn)行雞TIFA和TRAF6蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測,并利用PyMOL 2.5.4軟件對雞TIFA和TRAF6蛋白的表面電荷進(jìn)行分析。

1.2.3 引物設(shè)計與合成 在NCBI官網(wǎng)上查詢雞TIFA和TRAF6基因的核苷酸序列,根據(jù)GenBank中雞TIFA基因的登錄號(XM_015276339.2)和TRAF6基因的登錄號(XM_015287208.2),利用Primer Premier 5.0分別設(shè)計擴(kuò)增雞TIFA和TRAF6基因的實(shí)時熒光定量PCR特異性引物(表1)。以GAPDH作為內(nèi)參基因,所有引物合成均由成都擎科生物技術(shù)有限公司完成。

表1 熒光定量PCR引物序列信息

1.2.4 雞免疫器官總RNA提取及cDNA第一鏈合成 根據(jù)Total RNA Kit Ⅱ提取試劑盒說明書,分別提取雞的不同免疫器官(脾臟、胸腺和法氏囊)的總RNA,進(jìn)行總RNA濃度和OD值測定后,按照Star-Script Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA第一鏈。

1.2.5 實(shí)時熒光定量PCR檢測雞TIFA和TRAF6基因表達(dá) 利用實(shí)時熒光定量PCR法,以提取的1月齡雞脾臟總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,首先研究雞TIFA和TRAF6基因及內(nèi)參基因GAPDH在脾臟中的擴(kuò)增效率。以上述合成的cDNA產(chǎn)物為模板,分別檢測雞TIFA和TRAF6基因在脾臟、胸腺和法氏囊中的表達(dá)。反應(yīng)體系總體積為20.0 μL:2×Realstar Green Fast Mixture 10.0 μL,上游引物和下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,cDNA模板1.0 μL,ddH2O 8.0 μL。將反應(yīng)體系加入到八連管中,每個免疫器官3次重復(fù),震蕩混勻離心后使用2步法進(jìn)行熔解曲線擴(kuò)增,擴(kuò)增反應(yīng)程序設(shè)置:95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃變性15 s,52 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,40次循環(huán),熔解曲線由儀器自動分析。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2021對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析后,采用2-ΔΔCt法計算雞TIFA和TRAF6基因的相對表達(dá)量,并通過SPSS 26.0進(jìn)行單因素統(tǒng)計分析,結(jié)合Duncan(D)進(jìn)行比較;采用GraphPad Prism 9.0軟件繪制雞TIFA和TRAF6基因在免疫器官中的表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞TIFA和TRAF6蛋白的生物信息學(xué)特征

2.1.1 雞TIFA和TRAF6蛋白的理化性質(zhì) 通過EditSeq軟件分析發(fā)現(xiàn),組成雞TIFA蛋白的187個氨基酸殘基分別是強(qiáng)堿性氨基酸(K和R)21個,強(qiáng)酸性氨基酸(D和E)29個,疏水性氨基酸(A、I、L、F、W和V)53個,極性氨基酸(N、C、Q、S、T和Y)57個;蛋白相對分子量約為21.8 kDa,理論等電點(diǎn)(pI)為5.15,pH 7.0條件下所帶電荷為-7.53。組成雞TRAF6蛋白的545個氨基酸殘基分別是強(qiáng)堿性氨基酸55個,強(qiáng)酸性氨基酸69個,疏水性氨基酸150個,極性氨基酸165個;蛋白相對分子量約為61.9 kDa,理論等電點(diǎn)(pI)為6.13,pH 7.0條件下所帶電荷為-11.28。

2.1.2 雞TIFA和TRAF6蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu) 雞TIFA和TRAF6蛋白二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果表明,雞TIFA蛋白包含的無規(guī)則卷曲、α-螺旋、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角分別占51.87%、27.81%、16.58%和3.74%;雞TRAF6蛋白包含的無規(guī)則卷曲、α-螺旋、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角分別占47.08%、38.14%、11.86%和2.92%。由此可見,雞TIFA和TRAF6蛋白的二級結(jié)構(gòu)均以無規(guī)則卷曲和α-螺旋為主。AlphaFold在線網(wǎng)站預(yù)測的雞TIFA和TRAF6蛋白三級結(jié)構(gòu)與二級結(jié)構(gòu)基本相符(圖1)。另外,PyMOL 2.5.4軟件對雞TIFA和TRAF6蛋白表面電荷進(jìn)行分析結(jié)果表明,雞TIFA和TRAF6蛋白表面含有豐富的正電荷(藍(lán)色)和負(fù)電荷(紅色),但均以負(fù)電荷居多(圖2),與雞TIFA和TRAF6蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測結(jié)果一致,表明二者在細(xì)胞內(nèi)主要帶負(fù)電。

2.1.3 TIFA和TRAF6蛋白的氨基酸同源性 利用MegAlign軟件對人和不同動物的TIFA和TRAF6蛋白氨基酸同源性進(jìn)行分析結(jié)果表明,雞與其他禽類TIFA和TRAF6蛋白的氨基酸同源性分別為83.3%～97.3%和94.0%～98.2%,而雞與人和哺乳動物TIFA和TRAF6蛋白的氨基酸同源性分別為51.1%～54.9%和74.7%～77.1%。其中,雞與火雞TIFA和TRAF6蛋白的氨基酸同源性均最高,分別為97.3%和98.2%,而與豬TIFA及小鼠TRAF6蛋白的氨基酸同源性最低,分別為51.1%和74.7%(圖3)。

2.1.4 TIFA和TRAF6蛋白的結(jié)構(gòu)域保守性 根據(jù)已有報道[2-3],雞TIFA蛋白中僅存在1個FHA結(jié)構(gòu)域(47～104 aa),而雞TRAF6蛋白中存在3個結(jié)構(gòu)域,分別為RING結(jié)構(gòu)(67～124 aa)、Zinc finger結(jié)構(gòu)域(204～261 aa)和MATH結(jié)構(gòu)域(373～522aa)。利用MegAlign軟件對雞與其他禽類、人和哺乳動物TIFA和TRAF6蛋白的功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行比對分析發(fā)現(xiàn),雞與火雞TIFA蛋白的FHA結(jié)構(gòu)域完全保守,而與其他禽類、人和哺乳動物TIFA蛋白的FHA結(jié)構(gòu)域存在多處位點(diǎn)差異。其中,與人TIFA蛋白的FHA結(jié)構(gòu)域相比,雞的FHA結(jié)構(gòu)域在47～48(MA/VV)、60～62(NLV/TFQ)、75～77(FYR/LFK)、83～85(EFC/VLS)和98～102(TVDQT/IVDSR)等區(qū)域存在明顯的氨基酸差異(圖4-A)。此外,雞與火雞、綠頭鴨、鵝和鴿子TRAF6蛋白的RING和Zinc finger結(jié)構(gòu)域完全保守,而與人和哺乳動物TRAF6蛋白的RING和Zinc finger結(jié)構(gòu)域存在多處特異性氨基酸位點(diǎn)變異,如92(G/A)、95(V/I)、214(F/I)、233(N/L)、243(F/T)、250(P/H)(圖4-B)。此外,除綠頭鴨和鵝TRAF6蛋白MATH結(jié)構(gòu)域中有1個位點(diǎn)變異外(506 K/E),其他禽類與雞TRAF6 的MATH結(jié)構(gòu)域氨基酸位點(diǎn)完全一致,并且與人和哺乳動物存在幾處特異性的氨基酸差異,如385～387(GLQ/MHL)、463～465(GPE/A(P/L)(V/I)、488(H/P)等氨基酸區(qū)域或位點(diǎn)(圖4-B)。上述結(jié)果說明,雞與其他禽類TIFA和TRAF6蛋白的功能結(jié)構(gòu)域保守性高,與蛋白的氨基酸同源性分析結(jié)果一致。

圖1 雞TIFA和TRAF6蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.1 The tertiary structure prediction of chicken TIFA and TRAF6 proteins

藍(lán)色代表正電荷,紅色代表負(fù)電荷。Blue indicates positive charge, and red indicates negative charge.

表格右上角數(shù)據(jù)為氨基酸序列相似性,左下角數(shù)據(jù)為變異度。Data in the upper right corner of the table are amino acid similarity, and data in the bottom left corner are divergence.

2.1.5 TIFA蛋白與TRAF6蛋白相互作用區(qū)域的氨基酸保守性 前期有研究報道,人TIFA蛋白第174～181位氨基酸殘基是與TRAF6蛋白MATH結(jié)構(gòu)域發(fā)生相互作用的區(qū)域,并且S174Q/M179D雙突變能顯著增強(qiáng)二者的相互作用[16]。從圖5看出,雞與其他禽類,以及人與小鼠、大猩猩、黑猩猩和家兔TIFA蛋白的該區(qū)域保守性高。雖然禽類TIFA蛋白未出現(xiàn)S174Q和M179D的突變位點(diǎn),但是研究證實(shí),雞TIFA蛋白與TRAF6蛋白同樣存在相互作用[17]。

圖4 不同物種TIFA (A) 和TRAF6 (B) 蛋白功能結(jié)構(gòu)域的保守性分析Fig.4 The domain conservation analysis of TIFA (A) and TRAF6 (B) proteins from different species

圖5 TIFA蛋白與TRAF6蛋白相互作用區(qū)域的氨基酸保守性分析Fig.5 The amino acid conservation analysis of TRAF6 interaction region with TIFA protein

2.2 雞TIFA和TRAF6基因的實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增效率

從圖6看出,雞TIFA與TRAF6基因及內(nèi)參基因GAPDH的PCR擴(kuò)增曲線平滑且整體呈明顯的S型;熔解曲線是明顯的單峰,且無二聚體和雜峰,說明設(shè)計合成的熒光定量PCR引物特異性較好,可以用于后續(xù)試驗研究。

2.3 TIFA和TRAF6基因在不同月齡雞免疫器官中的表達(dá)水平

2.3.1TIFA基因 從圖7看出,雞TIFA基因在1～6月齡白來航雞的脾臟、胸腺和法氏囊中均存在表達(dá),以6月齡雞脾臟的表達(dá)量作為對照,雞TIFA基因在不同月齡雞脾臟、胸腺和法氏囊中的表達(dá)存在明顯差異。其中,在脾臟中,雞TIFA基因在6月齡的相對表達(dá)量最低(為1.01),1月齡最高(為14.70),分別是2～6月齡的2.8、1.4、1.2、3.2和14.6倍;在胸腺中,雞TIFA基因在6月齡的相對表達(dá)量最低(為0.08),1月齡最高(為4.55),分別是2～6月齡的4.1、2.7、2.1、11.3和64.3倍;在法氏囊中,雞TIFA基因在6月齡的表達(dá)量最低(為0.02),5月齡最高(為2.90),分別是1、2、3、4和6月齡的1.1、2.9、1.3、1.5和145倍。對雞TIFA基因在不同月齡雞免疫器官中的表達(dá)變化趨勢分析發(fā)現(xiàn),TIFA基因在雞脾臟中的變化較大,而在胸腺和法氏囊中的變化相對較小,但均呈先降后升再降趨勢,至6月齡時降至最低,基因的整體表達(dá)變化趨勢均呈倒“N”型模式。

2.3.2 雞TRAF6基因 從圖8看出,雞TRAF6基因在1～6月齡白來航雞的脾臟、胸腺和法氏囊中均存在表達(dá),以6月齡脾臟中的基因表達(dá)量作為對照,雞TRAF6基因在脾臟中的表達(dá)量最高(為10.84),而在胸腺和法氏囊中的表達(dá)量相對較低(分別為2.60和2.01)。在脾臟中,雞TRAF6基因在2月齡的相對表達(dá)量最低(為0.72),4月齡最高(為4.41),分別是1、2、3、5和6月齡的2.2、6.3、2.4、4.9和4.4倍;在胸腺中,雞TRAF6基因在5月齡的相對表達(dá)量最低(為0.08),4月齡最高(為1.46),分別是1、2、3、5和6月齡的3.0、15.0、5.0、18.8和7.5倍;在法氏囊中,雞TRAF6基因在5月齡的表達(dá)量最低(為0.06),4月齡最高(為1.26),分別是1、2、3、5和6月齡的2.6、13.0、2.6、21.7和13.0倍。對其表達(dá)變化趨勢進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),TRAF6基因在雞脾臟、胸腺和法氏囊中的變化趨勢相同,均呈先降后升再降再升趨勢,在4月齡時表達(dá)量達(dá)最大,基因的表達(dá)變化趨勢均呈“W”型模式(圖8)。

圖6 雞TIFA、TRAF6和GAPDH基因的qRT-PCR擴(kuò)增曲線和熔解曲線Fig.6 qRT-PCR amplification curve and dissolution curve of chicken TIFA, TRAF6 and GAPDH genes

**表示與6月齡雞脾臟相比差異極顯著(P<0.01);ns表示與6月齡雞脾臟相比差異不顯著。下同。** indicates that the difference is extremely significant in comparison to spleen of 6-month-old chickens (P<0.01); ns indicates that the difference is not significant. The same as below.

圖8 TRAF6基因在不同月齡雞免疫器官中的表達(dá)水平 (A) 和表達(dá)趨勢 (B)Fig.8 The expression level (A) and expression trend (B) of TRAF6 gene in chicken immune organs with different months of age

2.4 雞TIFA和TRAF6基因在NDV感染SPF雞后免疫器官中的表達(dá)水平

2.4.1 雞TIFA基因 從圖9看出,雞TIFA基因在NDV感染后第3～5天的脾臟、胸腺和法氏囊中的表達(dá)量均明顯高于同期對照。脾臟,感染組在第3天和第4天TIFA基因的表達(dá)量極顯著高于對照,第5天的表達(dá)量顯著高于對照,分別是對照的4.6、3.3

*和** 分別表示感染組與對照組間的差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01) 。下同。* and ** indicate that the differences between the infected group and the control group are significant (P<0.05) and extremely significant(P<0.01). The same as as below.

和1.7倍;胸腺,感染組在第3～5天的表達(dá)量均極顯著高于對照,分別是對照的2.2、3.2和3.1倍;法氏囊,感染組在第3～5天的表達(dá)量也均極顯著高于對照,分別是對照的1.8、2.4和4.3倍。同時,從TIFA基因表達(dá)的變化趨勢看, 其在雞脾臟中的表達(dá)量呈逐漸降低趨勢,而在雞胸腺和法氏囊中均呈先增后減趨勢。

2.4.2 雞TRAF6基因 從圖10看出,NDV感染組與對照的TRAF6基因在第3～5天的脾臟、胸腺和法氏囊中的表達(dá)存在明顯差異。脾臟中感染組第3～5天的表達(dá)量極顯著高于對照,分別是對照的3.1、2.3和2.3倍;胸腺中感染組第3天的表達(dá)量顯著高于對照,但在第4天和第5天則極顯著高于對照,分別是對照的1.9、3.6和3.7倍;法氏囊中感染組第3～5天的表達(dá)量均極顯著高于對照,分別是對照的2.2、2.7和4.3倍。同時,從TRAF6基因的表達(dá)變化趨勢看,其在雞脾臟中的表達(dá)量呈先減后穩(wěn)定趨勢,而在雞胸腺和法氏囊中則呈逐漸增加趨勢。

3 討 論

近年來,TIFA和TRAF6蛋白的相互作用在小鼠[1]、雞[17]、人[18]和非洲爪蟾[18]中已經(jīng)得到證實(shí)。Inoue等[18]研究發(fā)現(xiàn),人的TIFA蛋白C端具有與TRAF6相互作用的結(jié)合位點(diǎn),二者共同參與NF-κB的激活,并且TIFA/TRAF6/NF-κB信號通路的活化是細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子的關(guān)鍵通路。Huang等[16]進(jìn)一步研究證實(shí),人的TIFA蛋白第171～184位氨基酸殘基與TRAF6蛋白的第350～501位氨基酸殘基是相互作用的區(qū)域,且TIFA蛋白的第174位氨基酸Q和第179位氨基酸D能顯著增強(qiáng)與TRAF6蛋白之間的相互作用。Weng等[19]發(fā)現(xiàn),在腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)的刺激下,TIFA的Thr9位點(diǎn)發(fā)生磷酸化,通過pThr9-FHA結(jié)構(gòu)域觸發(fā)TIFA寡聚化并激活NF-κB。同時,TIFA形成的六聚體以及TIFA低聚化是介導(dǎo)其與TRAF6相互作用的基礎(chǔ),六聚體磷酸化后促使TIFA-TRAF6低聚復(fù)合物形成[20]。此外,研究還發(fā)現(xiàn),TIFA與TRAF6相互作用共同參與的信號通路,如TIFA/TRAF6/NF-κB、TIFA/TRAF6/IKK和ALPK1/TIFA/TRAF6等[1-2,21],在機(jī)體先天性免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用。因此,TIFA和TRAF6相互作用調(diào)控機(jī)體免疫應(yīng)答的研究得到廣泛關(guān)注。

本研究對雞TIFA和TRAF6蛋白的分子特征進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),二者在二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)組成上均主要以無規(guī)則卷曲和α-螺旋為主,且蛋白表面均以負(fù)電荷為主。由于蛋白質(zhì)中的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)可作為配體和受體結(jié)合的部位,其側(cè)鏈的改變能影響其空間結(jié)構(gòu)組成[22],因此,此結(jié)構(gòu)可能對TIFA和TRAF6蛋白的結(jié)合并發(fā)生相互作用具有重要意義。對不同物種TIFA和TRAF6蛋白的氨基酸同源性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),雞與其他禽類TIFA和TRAF6蛋白的氨基酸同源性高于人和哺乳動物,且TIFA和TRAF6蛋白的功能結(jié)構(gòu)域在禽類中保守性也較高,與物種之間的親緣關(guān)系研究結(jié)果一致[23]。一般而言,蛋白結(jié)構(gòu)域通常決定該蛋白的活性和功能[24],序列比對發(fā)現(xiàn),家禽TIFA和TRAF6蛋白功能結(jié)構(gòu)域保守性高,而與人和哺乳動物保守性低且存在多處明顯的氨基酸位點(diǎn)差異,提示家禽與人和哺乳動物TIFA和TRAF6蛋白之間可能存在不同的功能。因此,雞TIFA和TRAF6蛋白的生物學(xué)功能注釋以及在抗家禽病毒感染方面的作用機(jī)制需要進(jìn)一步探究。值得注意的是,雖然TIFA蛋白與TRAF6蛋白發(fā)生相互作用的區(qū)域并不在其功能結(jié)構(gòu)域中,且雞和其他家禽與人TIFA蛋白第174～181位氨基酸殘基差異較大,但是雞TIFA蛋白仍能與TRAF6蛋白發(fā)生相互作用[17],說明發(fā)生相互作用的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)應(yīng)該是不同物種TIFA蛋白中的保守氨基酸位點(diǎn),如S177、P178、E180、D182和E183。因此,TIFA蛋白中與TRAF6蛋白相互作用的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)還有待進(jìn)一步驗證。

圖10 雞TRAF6基因在NDV感染組不同免疫器官中的表達(dá)水平Fig.10 The expression level of chicken TRAF6 gene in different immune organs of NDV infection group

目前,有研究報道TRAF6基因在人[25]、小鼠[26]和鴨[27]的免疫細(xì)胞中高表達(dá),而關(guān)于TIFA和TRAF6基因在人或動物免疫器官中的表達(dá)特征報道較少,僅發(fā)現(xiàn)TIFA基因在小鼠脾臟中高表達(dá),而在其他組織呈中度表達(dá)[1]。有研究表明,TIFA基因在人造血干細(xì)胞(HSC)和髓系祖細(xì)胞中的表達(dá)較多,在B淋巴細(xì)胞中表達(dá)量高[28],而脾臟是B淋巴細(xì)胞正常發(fā)育至關(guān)重要的場所[29],因此,結(jié)果暗示TIFA基因在人脾臟中同樣表達(dá)豐富。在家禽研究方面,趙采芹等[10]發(fā)現(xiàn),TRAF6和TIFA基因在貴州黃雞不同發(fā)育階段的多個組織中均有不同程度表達(dá),其中以內(nèi)臟組織的相對表達(dá)量高,但是缺少相關(guān)免疫器官的表達(dá)結(jié)果。本研究發(fā)現(xiàn),雞TIFA和TRAF6基因在1～6月齡的白來航雞3個免疫器官中均有表達(dá),其在脾臟中表達(dá)量最高,其次是胸腺和法氏囊,與駱磊等[14,27]的研究結(jié)果一致。對雞TIFA和TRAF6基因在免疫器官中的表達(dá)趨勢進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),二者的表達(dá)變化趨勢略有不同,其中,在1～5月齡時的表達(dá)趨勢相同,均在2月齡時表達(dá)水平下降,但在4月齡時表達(dá)水平又上升。然而,從1～6月齡整體表達(dá)變化看,雞TIFA基因表達(dá)的變化趨勢呈倒“N”型,而雞TRAF6基因表達(dá)的變化趨勢呈“W”型。有研究證實(shí),在免疫系統(tǒng)中,TRAF6對B細(xì)胞、T細(xì)胞和骨髓細(xì)胞(包括巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和破骨細(xì)胞)的活化,以及胸腺和繼發(fā)性淋巴組織等免疫細(xì)胞或器官的發(fā)育十分重要[30]。TIFA是一種在造血系統(tǒng)中普遍表達(dá)的細(xì)胞質(zhì)蛋白,且主要于淋巴細(xì)胞中表達(dá)[31],而脾臟和胸腺作為造血器官之一,TIFA的高表達(dá)是否對其造血功能有影響還未見報道。因此,TIFA和TRAF6基因在雞免疫器官中的表達(dá)變化差異與免疫器官發(fā)育及功能之間的關(guān)系還有待探究。

本研究結(jié)果表明,雞感染NDV后3～5 d感染組雞免疫器官中TIFA和TRAF6基因的表達(dá)水平均顯著高于對照。有研究報道,通過人工感染雞白痢、腸炎沙門氏菌及Poly (I:C)等病原刺激狼山雞后,核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體5(NLR family CARD domain containing 5,NLRC5)相關(guān)通路中基因在狼山雞免疫器官中均顯著上調(diào)表達(dá),且TRAF6和NF-κB基因在感染組胸腺中的表達(dá)顯著高于對照[32]。另外,駱磊[14]研究證實(shí),NDV感染10日齡SPF雞后,TRAF6基因及其下游細(xì)胞因子基因在胸腺、脾臟和法氏囊中均顯著上調(diào)。Jin等[33]發(fā)現(xiàn),在雞感染NDV后,在體外和體內(nèi)均能檢測到TRAF6基因的表達(dá)水平增加。此外,Guo等[34]研究發(fā)現(xiàn),TRAF6基因在揚(yáng)州大白鵝脾臟中廣泛表達(dá),且在感染沙門氏菌后TRAF6基因和下游炎性細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)。本研究結(jié)果與上述發(fā)現(xiàn)一致,表明,TIFA和TRAF6共同介導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)生對抵抗細(xì)菌或病毒感染具有重要作用。但是值得注意的是,如果機(jī)體天然免疫應(yīng)答反應(yīng)過于強(qiáng)烈會誘發(fā)“細(xì)胞因子風(fēng)暴”,造成更嚴(yán)重的免疫器官損傷,進(jìn)而促進(jìn)病毒的復(fù)制效率,這是某些病毒致病性增強(qiáng)的原因[35-36]。TIFA通過觸發(fā)NF-κB介導(dǎo)的胞質(zhì)監(jiān)視途徑感知細(xì)菌中間代謝副產(chǎn)物[37],將免疫細(xì)胞募集到細(xì)菌感染部位,因而TIFA的高表達(dá)也反映出機(jī)體免疫應(yīng)答情況。本研究發(fā)現(xiàn),在雞感染NDV后第3～5天,TIFA和TRAF6基因在雞免疫器官中持續(xù)保持高表達(dá)水平,在此情況下可能會造成NF-κB信號通路持續(xù)激活,從而產(chǎn)生更多的炎性細(xì)胞因子,可能是當(dāng)前NDV強(qiáng)毒株造成雞免疫器官嚴(yán)重?fù)p傷的一個重要原因[38-39]。另外,在NDV感染后,TLR2和TLR4的表達(dá)量會增加,從而激活MyD88/TRAF6/NF-κB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路協(xié)同調(diào)節(jié)宿主防御病毒[40]。同時,NDV具有病毒免疫逃避的特性,如NDV M蛋白以未知的方式降低TIFA和IRAK4的表達(dá),導(dǎo)致促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生減少,從而抵消細(xì)胞炎癥反應(yīng)[41],促進(jìn)NDV在體內(nèi)的快速增殖并增強(qiáng)其致病性。由于TIFA蛋白是TRAF6/NF-κB通路的上游接頭分子,但是目前關(guān)于雞TIFA的生物學(xué)功能研究仍相對薄弱,并且其在家禽相關(guān)病毒復(fù)制和致病性中的作用研究也相對較少。因此,本研究后續(xù)將開展與雞TIFA蛋白相互作用細(xì)胞蛋白的篩選和功能分析,并深入解析TIFA和TRFA6相互作用調(diào)控NDV復(fù)制的作用機(jī)制。

4 結(jié) 論

雞TIFA和TRAF6蛋白在禽類中的氨基酸同源性和結(jié)構(gòu)域保守性高于人和哺乳動物,二者在不同月齡雞免疫器官中均有表達(dá),且以脾臟中的表達(dá)量最高;在NDV感染雞的免疫器官中表達(dá)水平顯著高于對照,二者參與的先天性免疫應(yīng)答可能在NDV復(fù)制中具有重要作用。