鄒 歡,韓 帥,范中菡,陳慶華,胡容平,李洪浩

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,成都 610066;2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所,成都 610066;3.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,成都 610066)

【研究意義】丹參(SalviamiltiorrhizaBge)為雙子葉植物唇形科鼠尾草屬多年生草本植物,別名赤身、紫丹參、紅根等,其藥用成分為丹參酮、隱丹參酮、丹參素、丹酚酸B、迷迭香酸等活性物質(zhì)[1]。丹參具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩的功效[2]。四川省中江縣是中國丹參主產(chǎn)區(qū)之一,中江丹參歷史悠久、品質(zhì)優(yōu),被列為川產(chǎn)道地藥材,在四川道地藥材中有著較高地位,也是中國中藥丹參出口的主要品種之一[3]。由于丹參的需求量日益增多,野生資源不斷減少,目前丹參多以人工栽培為主。隨著種植面積逐年擴(kuò)大,丹參的病蟲害日益增多。葉斑病是為害丹參的主要病害之一,其癥狀為初期葉片出現(xiàn)不規(guī)則病斑,之后病斑變?yōu)樯詈稚?最后病葉干枯、脫落,整株枯死,嚴(yán)重影響丹參產(chǎn)量?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】葉斑病主要危害植物的葉片,發(fā)生程度與病原菌種類、環(huán)境條件和寄主抗病性相關(guān)。目前,對丹參葉斑病病原菌的研究較少。部分學(xué)者認(rèn)為是由AlternariazinniaePape[4]或CercosporasalvicolaTharp[5]侵染導(dǎo)致。Garibaldi等[6]在總苞鼠尾草(S.involucrata)葉斑病病部組織中分離到大量病原菌,通過形態(tài)特征觀察、ITS測序分析和致病性試驗,該病原菌被鑒定為鏈格孢菌(A.alternata)。2016年葉斑病在臺灣省花蓮縣丹參種植區(qū)普遍發(fā)生,Lu等[7]根據(jù)分生孢子梗和分生孢子形態(tài)特征將其鑒定為多主棒孢霉(Corynesporacassiicola),并通過ITS測序進(jìn)一步驗證形態(tài)鑒定。【本研究切入點】目前,國內(nèi)外對引起鼠尾草屬植物葉斑病的病原菌報道較少,主要為多主棒孢霉和鏈格孢菌,但由果生炭疽菌(C.fructicola)侵染丹參引起葉斑病的研究未見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以中江丹參葉斑病病葉為材料進(jìn)行病原菌的分離鑒定,結(jié)合致病性測定、形態(tài)特征觀察和分子生物學(xué)明確丹參葉斑病病原菌種類,并針對性篩選有效藥劑,以期為該病害的科學(xué)防控和促進(jìn)中江丹參產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試病樣 丹參葉斑病病葉于2021年8月采自四川省德陽市中江縣輯慶鎮(zhèn)永遠(yuǎn)村,裝于塑料自封袋中,帶回實驗室進(jìn)行分離鑒定。

1.1.2 生化試劑 Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒、10×Loading Buffer、引物ITS1/ITS4等均購于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.3 供試藥劑 5種市面上常用的殺菌劑被用于室內(nèi)藥劑篩選,分別是80%代森錳鋅可濕性粉劑(利民化學(xué)有限責(zé)任公司生產(chǎn))、80%乙蒜素乳油(南陽新臥龍生物化工有限公司生產(chǎn))、250 g/L嘧菌酯懸浮劑(英國先正達(dá)有限公司生產(chǎn))、50%醚菌酯水分散粒劑(巴斯夫歐洲公司生產(chǎn))、500 g/L氟啶胺懸浮劑(日本石原產(chǎn)業(yè)株式會社生產(chǎn))。

1.2 試驗方法

1.2.1 丹參葉斑病病原菌的分離與純化 采用組織分離法進(jìn)行病原菌分離。將具有典型癥狀的病葉用無菌水清洗干凈并拭去表面水分,取病健交界處0.5 cm×0.5 cm大小的病組織置于75%酒精中消毒2次,經(jīng)無菌水漂洗3次后,用已滅菌濾紙拭去表面水分后轉(zhuǎn)至PDA培養(yǎng)基平板中央,并將平板置于25 ℃黑暗條件下恒溫培養(yǎng),待菌絲生長、產(chǎn)生分生孢子后,通過單孢分離獲得葉斑病病原菌的單孢純化菌株。

1.2.2 丹參葉斑病病原菌的致病性測定 選擇健康無病斑丹參葉片洗凈,75%酒精消毒后用無菌水沖洗,再用已滅菌濾紙拭干表面水分。病原菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～7 d后,取菌落邊緣直徑5 mm菌餅作為接種體。刺傷接種:使用已滅菌接種針輕輕刺傷丹參葉片背面并做好標(biāo)記,將菌餅接種于傷口處;不刺傷接種:直接將菌餅接種于丹參葉片背面,以接種無菌PDA作為對照。每片葉接種1個菌餅,每個處理重復(fù)接種3片葉,接種后將葉片置于25 ℃、12 h光周期條件下保濕培養(yǎng),每日定時觀察并記錄葉片發(fā)病情況。丹參葉片發(fā)病后,從病斑處再次進(jìn)行病原菌分離培養(yǎng),并與原接種體進(jìn)行比較。

1.2.3 丹參葉斑病病原菌的形態(tài)觀察 供試菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后,觀察菌落形態(tài)并挑取適量菌絲于載玻片上,在顯微鏡下觀察菌絲、分生孢子、子囊及子囊孢子形態(tài)。參考Yang等[8]的方法,觀察孢子附著胞的產(chǎn)生情況。

1.2.4 丹參葉斑病病原菌的分子生物學(xué)鑒定 刮取已在PDA培養(yǎng)基上生長7 d的病原菌菌絲,使用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取菌絲DNA。利用真菌rDNA-ITS序列通用引物ITS1/ITS4、ACT-512F/ACT-783R和GDF/GDR[9]對病原菌相應(yīng)的rDNA-ITS、ACT和GDPH基因分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。25 μL PCR反應(yīng)體系為:10×PCR Buffer 2.5 μL,dNTP(10 mmol/L)1 μL,Tag Plus DNA Polymerase(5 U/μL)1 μL,MgSO4(50 mmol/L)1 μL,上下游引物(10 μmol/L)和DNA模板各1 μL,ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,57 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,進(jìn)行30個循環(huán);72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。將測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對,下載同源性較高的同屬分離物序列(表1),利用MEGA軟件,使用鄰接法(Neighbor joining)構(gòu)建基于rDNA ITS、ACT和GDPH聯(lián)合的系統(tǒng)進(jìn)化樹,進(jìn)行親緣關(guān)系分析,確定病原菌的分類地位。

1.2.5 丹參葉斑病的抑菌藥劑篩選 采用菌絲生長速率法測定殺菌劑的抑菌活性:根據(jù)預(yù)備試驗確定代森錳鋅[10]、乙蒜素[11]、嘧菌酯[12]、醚菌酯[13]和氟啶胺[14]的最高濃度分別為5000、1000、1250、1250和800 μg/mL,并采用二倍稀釋法梯度稀釋,再用移液器分別吸取1 mL不同濃度藥液加入9 mL PDA培養(yǎng)基中混勻制成含藥培養(yǎng)基,以1 mL無菌水替代藥液作為對照。用直徑5 mm打孔器在已培養(yǎng)7 d的菌落邊緣打孔,并將菌餅置于培養(yǎng)基平板中央,每個處理重復(fù)4次。在25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)10 d,采用十字交叉法測量菌落直徑,計算病原菌菌絲生長的抑制率(I,%)以及毒力回歸方程、EC50值、相關(guān)系數(shù)r。

式中,A0為對照組菌落直徑,At為處理組菌落直徑。

表1 同屬分離物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 丹參葉斑病的病害癥狀和病原菌分離

2021年8月在四川省中江縣丹參種植區(qū)進(jìn)行田間病害調(diào)查,發(fā)現(xiàn)丹參植株下部有大量葉片出現(xiàn)褐色病斑。病斑初為褐色小點,周圍有黃色暈圈,隨后病斑擴(kuò)大至圓形或近圓形,有時受葉脈限制呈多角形或不規(guī)則形,病斑轉(zhuǎn)為深褐色,病健交界處明顯,之后相連成片,整片葉呈褐色干枯(圖1-A)。通過組織分離法從病斑處分離獲得3株真菌,選擇1株生長速度快的菌株進(jìn)行試驗,編號為DS-3。

2.2 丹參葉斑病病原菌的致病性測定

刺傷丹參葉片接種菌株DS-3,接種部位72 h后出現(xiàn)褐色斑點,并伴有黃色暈圈,之后病斑不斷擴(kuò)大,6 d后病斑面積約占葉片的10%,呈深褐色(圖1-B);未刺傷接種的葉片在6 d后也出現(xiàn)褐色病斑,但病斑較小(圖1-C);未接種葉片無癥狀(圖1-D)。對接種后發(fā)病組織進(jìn)行病原菌分離,獲得與DS-3菌落形態(tài)和微觀特征一致的菌株。通過柯赫氏法則驗證,該病原菌DS-3為引起丹參葉斑病的致病菌。

2.3 丹參葉斑病病原菌的形態(tài)學(xué)特征

供試菌株DS-3在PDA培養(yǎng)7 d后菌落呈灰綠色,邊緣菌絲為白色(圖2-A)。菌株培養(yǎng)18 d后產(chǎn)生黑色的子囊殼,子囊孢子以束狀螺旋的方式環(huán)繞于子囊內(nèi)(圖2-B),子囊孢子呈彎月形(圖2-C)。分生孢子無色,無隔或有隔,長橢圓形,孢子附著胞深灰色,近圓形或梨形(圖2-D)。

2.4 丹參葉斑病病原菌的分子生物學(xué)鑒定

對病原菌DS-3的rDNA-ITS、ACT和GDPH基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,分別獲得長度為534、262、259 bp的目的片段,上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫并獲得登錄號,分別為OR538885、OR545810和OR545811。將ITS序列進(jìn)行BLAST比對,發(fā)現(xiàn)DS-3與番木瓜炭疽病菌(C.chrysophilum)、果生炭疽菌(C.fructicola)和膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)的相似度均為100%,不能區(qū)分。將DS-3的3個基因進(jìn)行線性拼接,使用MEGA 7.0,以Alternariaalternata為外群,與17條同屬分離物的相應(yīng)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹可知(圖3),DS-3以100%的支持率與果生炭疽菌的分離物C-517、JZB330267和YJMB4.2聚為一支,與炭疽菌屬的其它種親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。

A:丹參葉斑病田間癥狀;B:刺傷葉片后接種DS-3的發(fā)病癥狀;C:未刺傷葉片接種DS-3的發(fā)病癥狀;D:空白對照。A: Field symptoms of leaf spot disease on S.miltiorrhiza; B: Stab-inoculation symptoms of strain DS-3; C: Inoculation symptoms of strain DS-3; D: Blank control.

A:培養(yǎng)7 d后病原菌菌落形態(tài);B:子囊;C:子囊孢子;D:分生孢子和孢子附著胞。A: Morphology of pathogen colony after 7 days of culture; B: Asci;C:Ascospores;D: Conidia and appressorium.

圖3 基于rDNA-ITS、ACT和GDPH基因聯(lián)合構(gòu)建的丹參葉斑病菌與相關(guān)菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of S.miltiorrhiza leaf spot pathogen and related strains based on the combination of rDNA-ITS, ACT and GDPH genes

2.5 5種供試藥劑對丹參葉斑病菌的抑制作用

從表2可知,不同藥劑對丹參葉斑病菌的抑制效果差異明顯。80%乙蒜素乳油的EC50值最低,為19.18 μg/mL;其次為500 g/L氟啶胺懸浮劑與80%代森錳鋅可濕性粉劑,EC50值分別為125.53和159.47 μg/mL,250 g/L嘧菌酯懸浮劑和50%醚菌酯水分散粒劑的抑菌效果相對較差,EC50值分別為171.71和217.65 μg/mL,說明供試菌株對乙蒜素較為敏感。

表2 5種藥劑對菌株DS-3菌絲生長的抑制作用

3 討 論

本研究通過柯赫氏法則、形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法,明確引起中江丹參葉斑病的病原菌為果生炭疽菌。果生炭疽菌的寄主廣泛,包括咖啡、蘋果、沙梨、補(bǔ)血草、草莓、鱷梨、無花果、薯蕷、可可、辣椒、白黃麻、番荔枝、杧果、香樟等[15-16]。在草莓上引起炭疽病[17],發(fā)病初期在葉片和葉柄上可見病斑,后期可致草莓整株枯死。果生炭疽菌也是油茶炭疽病[18-21]的主要病原菌之一,在湖南、湖北、重慶和福建等地均有發(fā)生,引起油茶落葉、落果。趙飛飛等[22]從2種癥狀類型的梨病葉上分離到2株菌落形態(tài)有差異的果生炭疽菌,兩者的子囊孢子均可形成2種類型的菌落,一種為正型(+)單孢系,菌絲密集、較白,子囊殼聚生,另一種為負(fù)型(-)單孢系,菌絲為灰色,子囊殼散生。本研究分離獲得的菌株DS-3的菌落形態(tài)與后者相似,為負(fù)型(-)單孢系,其分生孢子為長橢圓形,子囊孢子為彎月形,與李河等[21]報道一致。

炭疽菌屬真菌的分類主要依據(jù)分生孢子、附著胞的形態(tài)特征和菌落的培養(yǎng)性狀等指標(biāo),但某些近緣種種間的培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征差異小,且某些種的形態(tài)特征不穩(wěn)定,因此,僅依靠微觀形態(tài)來區(qū)分炭疽菌屬的近緣種較困難[9]。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展,基于ITS等序列的分子技術(shù)已廣泛應(yīng)用于炭疽菌屬真菌的分類鑒定中,但I(xiàn)TS序列存在局限性,Wire等[23]對C.gloeosporioide復(fù)合群進(jìn)行基于ITS的系統(tǒng)進(jìn)化分析,發(fā)現(xiàn)有13個種不能被準(zhǔn)確識別,表明ITS序列不能有效區(qū)分炭疽菌屬的近緣種。本研究僅依靠ITS序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,不能區(qū)分香木瓜炭疽菌、果生炭疽菌和膠孢炭疽菌,加入ACT和GDPH基因進(jìn)行聯(lián)合建樹可準(zhǔn)確鑒定到種。

本研究中,5種常用殺菌劑對果生炭疽菌的菌絲生長均有不同程度抑制效果,其中,果生炭疽菌對乙蒜素和氟啶胺較敏感,以乙蒜素為甚。氟啶胺是唯一的線粒體氧化磷酸化解偶聯(lián)劑,具有廣譜殺菌活性,抗性風(fēng)險較低。氟啶胺對炭疽菌屬中的膠孢炭疽菌C.gloeosporioides、果生炭疽菌(C.fructicola)、博寧炭疽菌(C.boninense)和尖孢炭疽菌(C.acutatum)的菌絲生長具有明顯的抑制作用,EC50值介于0.028～0.53 μg/mL[24],顯著低于本研究的結(jié)果,這可能與針對的病原菌不同有關(guān)。乙蒜素是我國自主研發(fā)的一款植物仿生殺菌劑,其通過滲透溶解病原體的細(xì)胞膜,干擾蛋白質(zhì)合成,進(jìn)而抑制病原菌的生長,可防治多種病害[25-26]。中國農(nóng)藥信息網(wǎng)農(nóng)藥登記數(shù)據(jù)顯示,乙蒜素已登記用于防治大豆紫斑病、油菜霜霉病、水稻爛秧病、甘薯黑斑病、蘋果葉斑病、棉花枯萎病等多種病害。同時,乙蒜素在作物中消解速度較快,在土壤中半衰期短,屬于易降解農(nóng)藥。為進(jìn)一步提升丹參葉斑病綜合防控水平,保障道地中藥材丹參產(chǎn)量和品質(zhì),可推薦乙蒜素用于丹參葉斑病的防控。

4 結(jié) 論

從德陽市中江縣丹參葉斑病病組織中分離出1種病原菌,結(jié)合形態(tài)學(xué)、致病性測試和分子生物學(xué)鑒定,首次明確該病原菌為果生炭疽菌。5種常用殺菌劑中80%乙蒜素乳油對該病原菌的抑菌活性好,可用于該病害的防控。