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        侵染廣西辣椒的兩種單組分菜豆金色花葉病毒屬病毒的分子特征

        2023-03-13 02:55:44李金哲湯亞飛莫翠萍羅婉笛陳錦清蔡健和鄧清超章松柏李戰(zhàn)彪
        關(guān)鍵詞:登錄號(hào)花葉病毒進(jìn)化樹(shù)

        李金哲,湯亞飛,莫翠萍,羅婉笛,陳錦清,蔡健和,鄧清超,章松柏,李戰(zhàn)彪

        (1.農(nóng)林病蟲(chóng)害預(yù)警與調(diào)控湖北省工程技術(shù)研究中心/長(zhǎng)江大學(xué),湖北 荊州 434025;2.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南果蔬綠色防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣西作物病蟲(chóng)害生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南寧 530007;3.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510640)

        【研究意義】辣椒(CapsicumannuumL.)是重要的蔬菜作物,年播種面積在1.5×106~2.0×106hm2,辣椒產(chǎn)業(yè)已成為蔬菜的第一大產(chǎn)業(yè)[1-2]。隨著辣椒種植面積和種植區(qū)域的逐步擴(kuò)大,辣椒病毒病日益嚴(yán)重。因此,明確侵染辣椒的病毒種類(lèi)及病毒分離物間的遺傳進(jìn)化關(guān)系有助于辣椒病毒病的防控,同時(shí)為辣椒抗病毒育種提供理論指導(dǎo)。【前人研究進(jìn)展】世界上已報(bào)道侵染辣椒的病毒有70種以上[3-5],國(guó)內(nèi)報(bào)道33種[6-9]。由于氣候、環(huán)境等因素影響,不同地區(qū)辣椒感染的病毒種類(lèi)也有差異,王少立等[10]發(fā)現(xiàn)侵染山東辣椒的主要病毒為黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)和辣椒輕斑駁病毒(Pepper mild mottle virus,PMMoV),湯亞飛等[11]通過(guò)對(duì)廣東省辣椒病毒種類(lèi)進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn),侵染廣東辣椒的優(yōu)勢(shì)病毒為辣椒輕斑駁病毒(PMMoV)、甜椒脈斑駁病毒(Pepper veinal mottle virus,PVMV)和辣椒脈斑駁病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)。付尚松[12]對(duì)貴州辣椒病毒病調(diào)查檢測(cè)中發(fā)現(xiàn),黃瓜花葉病毒(CMV)、煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)和辣椒輕斑駁病毒(PMMoV)為侵染辣椒的主要病毒。嚴(yán)婉榮等[13]在對(duì)侵染海南省辣椒的病毒種類(lèi)進(jìn)行調(diào)查檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn),侵染海南辣椒的優(yōu)勢(shì)病毒為黃瓜花葉病毒(CMV)和煙草花葉病毒(TMV)。龔明霞等[14]則證實(shí)侵染廣西辣椒的優(yōu)勢(shì)病毒為小米椒內(nèi)源 RNA 病毒 1(Capsicumfrutescens endornavirus 1,CFEV 1)、辣椒脈斑駁病毒(ChiVMV)、黃瓜花葉病毒(CMV)和甜椒脈斑駁病毒(PVMV)。近年來(lái),雙生病毒侵染辣椒的現(xiàn)象也日益嚴(yán)重,范曉堃[15]在西南地區(qū)采集辣椒樣品進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)樣品中存在番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)。劉晨等[16]在對(duì)陜西不同地區(qū)辣椒病毒進(jìn)行調(diào)查檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn),各地區(qū)辣椒均攜帶TYLCV,胡明鑫等[17]在天津辣椒樣品中鑒定出TYLCV。迄今為止,尚未有雙生病毒侵染廣西辣椒的相關(guān)報(bào)道?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來(lái),廣西農(nóng)科院植保所植物病毒課題組持續(xù)關(guān)注茄科作物病毒病的發(fā)生情況,2022年3月,該課題組在調(diào)查中發(fā)現(xiàn),廣西百色市的辣椒葉片呈現(xiàn)皺縮、黃化、葉片上卷等癥狀,疑似受到雙生病毒侵染,但具體病原種類(lèi)尚不明確?!緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】擬通過(guò)分子生物學(xué)手段,利用PCR、分段克隆、序列比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建等方法對(duì)疑似感染雙生病毒的辣椒樣品進(jìn)行鑒定,并對(duì)各病毒分離物進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析,研究結(jié)果將為辣椒病毒病的高效防控提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 樣品來(lái)源

        毒源:2022年采自廣西百色田間出現(xiàn)黃化、皺縮、上卷等癥狀的辣椒葉片樣品(圖1),編號(hào)為BS64、BS65、BS66、BS67,樣品于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2 辣椒總DNA提取

        取100 mg辣椒葉片樣品,選擇上海生工生物工程股份有限公司的Ezup 柱式植物基因組 DNA 提取試劑盒進(jìn)行總DNA提取,具體操作按試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,最終加入50 μL去離子水溶解DNA沉淀,將得到的DNA溶液置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.3 廣西辣椒樣品中菜豆金色花葉病毒屬病毒的PCR檢測(cè)

        利用菜豆金色花葉病毒屬病毒通用簡(jiǎn)并引物AV494:GCCYATRTAYAGRAAGC,CMAG/CoPR:GA NGSATGHTRCADGCCATATA[18-19]對(duì)采集到的辣椒葉片總DNA進(jìn)行PCR檢測(cè),以辣椒葉片總DNA為模板,對(duì)4份疑似病樣進(jìn)行PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系(25 μL):2×DreamTaqPCR Master Mix[生工生物工程(上海)股份有限公司]12.5 μL,10 μmol/L AV494和CoPR 引物各 0.5 μL,辣椒葉片總DNA 1 μL,滅菌水10.5 μL。反應(yīng)程序:95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s;52 ℃ 45 s;72 ℃ 30 s,35 個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。所得的PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè),檢測(cè)為陽(yáng)性的辣椒樣品保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.4 廣西辣椒樣品中菜豆金色花葉病毒屬病毒全基因組序列擴(kuò)增

        為獲得侵染辣椒的雙生病毒的全基因序列,參考已登錄GenBank的TYLCV(GenBank登錄號(hào):MG904859和KY783940)、中國(guó)番木瓜曲葉病毒(Papaya leaf curl China virus, PaLCuCNV)(GenBank登錄號(hào):KU892661和MW779523)設(shè)計(jì)2對(duì)背靠背引物,TYLCV-F:TTGGTGGGCCCTCTGGAATG/TYLCV-R:TAACTGTAGCATGAAATTTCCTCATC,PaLCuCNV-F:ACTGTTACTGGTGGTCAGTATGCTAGT/Pa LCuCNV-R:GCGTTTCTTAAGAGTATTTAGGG。以辣椒葉片總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR 反應(yīng)程序:95 ℃ 3 min;95 ℃ 15 s,52 ℃ 45 s,72 ℃ 3 min,35 個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。反應(yīng)體系(50 μL):DNA模板2 μL,正反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL,2×Phata Max Master Mix 25 μL,ddH2O 22 μL。

        將PCR擴(kuò)增獲得的靶標(biāo)條帶利用DNA凝膠回收試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]進(jìn)行分離純化。純化后的PCR產(chǎn)物克隆至pMD18T載體得到連接產(chǎn)物,將得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α,獲得的菌液涂布含有Amp抗生素的LB培養(yǎng)基平板,平板倒置培養(yǎng)過(guò)夜。委托生工生物工程(上海)股份有限公司對(duì)確定為陽(yáng)性克隆的菌落進(jìn)行測(cè)序。

        1.5 廣西辣椒樣品中菜豆金色花葉病毒屬病毒的序列分析及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

        利用SeqMan軟件對(duì)從辣椒樣品中擴(kuò)增獲得的序列進(jìn)行拼接,獲得病毒基因組全長(zhǎng)序列,將獲得的病毒全基因序列在NCBI中利用在線軟件ORF finder 和blastn分別進(jìn)行ORF預(yù)測(cè)和序列比對(duì)分析。進(jìn)一步利用SDT軟件對(duì)獲得的病毒基因組全長(zhǎng)序列進(jìn)行核苷酸相似性比對(duì)分析;通過(guò)MEGA 7.0軟件進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建,選擇最大似然法為最優(yōu)樹(shù),步值設(shè)置為1000。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 辣椒葉片樣品的 PCR 檢測(cè)結(jié)果

        采用菜豆金色花葉病毒屬病毒的簡(jiǎn)并引物 AV494/CoPR對(duì)辣椒葉片樣品的總 DNA進(jìn)行PCR檢測(cè), 健康的辣椒葉片樣品為陰性對(duì)照,確定感染TYLCV的番茄葉片樣品為陽(yáng)性對(duì)照。PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,4份樣品均可擴(kuò)增出長(zhǎng)度為570 bp的特異目的片段,而健康的辣椒葉片未擴(kuò)增出任何條帶。

        圖1 田間被雙生病毒侵染的辣椒葉片癥狀Fig.1 Symptoms of the leaves of pepper infected by begomoviruses in filed

        將所得的PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行測(cè)序,所得序列在GenBank中進(jìn)行blastn分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),所得序列分別與TYLCV、PaLCuCNV等病毒分離物具有較高的核苷酸相似性。以上結(jié)果證實(shí)4份辣椒樣品中均存在菜豆金色花葉病毒屬病毒。

        2.2 廣西辣椒樣品中菜豆金色花葉病毒屬病毒分離物基因組克隆及序列分析

        為獲得辣椒中菜豆金色花葉病毒屬病毒全長(zhǎng)基因組,從檢測(cè)為陽(yáng)性的辣椒總DNA中挑選2個(gè)樣品(編號(hào):BS66、BS67)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以辣椒葉片總DNA為模板,參考已登錄GenBank的TYLCV(GenBank登錄號(hào):MG904859和KY783940)、PaLCuCNV(GenBank登錄號(hào):KU892661和MW779523)設(shè)計(jì)2對(duì)背靠背引物:TYLCV-F/TYLCV-R、PaLCuCNV-F/PaLCuCNV-R。對(duì)檢測(cè)為陽(yáng)性的2個(gè)辣椒樣品分別擴(kuò)增后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析(圖2)發(fā)現(xiàn),BS66利用2對(duì)引物均可擴(kuò)增出約2.7 kb的PCR條帶,而B(niǎo)S67僅TYLCV-F/R可以擴(kuò)增出約2.7 kb的PCR條帶。切取PCR擴(kuò)增獲得的靶標(biāo)條帶進(jìn)行分離純化、連接、轉(zhuǎn)化等,經(jīng)菌落PCR檢測(cè)后,挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。經(jīng)克隆、序列測(cè)定和BLAST比對(duì)分析發(fā)現(xiàn),從辣椒樣品BS66、BS67中共獲得3條全基因序列,分別為BS66-1、BS67-1、BS66-2。其中,BS66-1與TYLCV分離物的核苷酸相似性均在91%以上,BS67-1與大部分用于分析TYLCV分離物的核苷酸相似性均在91%以上,但與TYLCV韓國(guó)、伊拉克、西班牙分離物(GenBank登錄號(hào):ON982201、MT583814、AF071228)則在90%以上。BS66-1與番茄黃化曲葉病毒中國(guó)分離物(GenBank登錄號(hào):MT969010)相似性最高在99.67%,與TYLCV中國(guó)北京、廣東、福建等地分離物(GenBank登錄號(hào):KT338296、MW779534、MN842311)的相似性為92.69%、92.86%、92.79%,與TYLCV墨西哥分離物(GenBank登錄號(hào):EF523478)相似性也在92%以上。BS67-1與TYLCV廣西分離物(GenBank登錄號(hào):MW389934)相似性最高達(dá)98%,與TYLCV中國(guó)山西、廣東、遼寧等地的分離物(GenBank登錄號(hào):OM677619、MW735449、KJ754191)相似性達(dá)93.98%、91.84%、91.88%。序列BS66-2與PaLCuCNV廣西分離物(GenBank登錄號(hào):MW779523、JX12 8102)相似性最高達(dá)99.67%,其中與中國(guó)重慶、河南分離物(GenBank登錄號(hào):OL310479、EU8 74386)相似性達(dá)92.49%、95.68%,與越南分離物(GenBank登錄號(hào):KC878474)相似性達(dá)92.06%。

        M.DL 2000 DNA標(biāo)記;1.陽(yáng)性對(duì)照;2~5.樣品BS64-67;6.CK(健康對(duì)照樣品)。M.DL 2000 DNA Marker(TaKaRa);1.Tomato leaf sample infected by TYCD(CK+);2-5.Diseased pepper leaf samples;6.CK(Control sample).

        使用SDT軟件對(duì)獲得的3條全基因序列進(jìn)行核苷酸相似性分析,發(fā)現(xiàn)TYLCV廣西辣椒分離物BS66-1、BS67-1與本研究用于分析的其他TYLCV各分離物的核苷酸相似性大部分在91%以上(圖3)。PaLCuCNV廣西辣椒分離物BS66-2與本研究用于分析的其他PaLCuCNV各分離物核苷酸相似性達(dá)到91%以上(圖4)。依據(jù)目前國(guó)際雙生病毒分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn),侵染廣西辣椒的雙生病毒分別屬于TYLCV和PaLCuCNV的分離物,各序列在GenBank的登錄號(hào)為:BS66-1(GenBank登錄號(hào):OQ190458)、BS67-1(GenBank登錄號(hào):OQ383543)、BS66-2(GenBank登錄號(hào):OQ383309)。

        圖3 TYLCV廣西辣椒分離物BS66-1、BS67-1與其他19個(gè)TYLCV分離物相似性比對(duì)Fig.3 Sequence identity comparison of TYLCV Guangxi pepper BS66-1,BS67-1 isolates and other 19 isolates of TYLCV

        圖4 PaLCuCNV廣西辣椒分離物BS66-2與其他16個(gè)PaLCuCNV分離物相似性比對(duì)Fig.4 Sequence identity comparison of PaLCuCNV Guangxi pepper BS66-2 isolates and other 16 isolates of PaLCuCNV

        2.3 TYLCV廣西辣椒分離物的遺傳進(jìn)化分析

        為了解本研究中得到的2個(gè)TYLCV廣西辣椒分離物與已登錄Genkbank的19個(gè)TYLCV分離物的進(jìn)化關(guān)系,利用MEGA 7.0軟件進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建,最大似然法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)為最優(yōu)樹(shù)(圖5)。本研究獲得的2個(gè)序列處于不同分支,其中BS66-1與TYLCV中國(guó)SG1分離物(GenBank登錄號(hào):MT969010,寄主:番茄)處于同一個(gè)小分支,說(shuō)明兩者具有較近的親緣關(guān)系;而B(niǎo)S67-1則與中國(guó)廣西的GX分離物(GenBank登錄號(hào):MW389934,寄主:番茄)和BS3分離物(GenBank登錄號(hào):MT375610,寄主:番茄)處于相同分支,說(shuō)明三者具有較近的親緣關(guān)系,但BS67-1又處于1個(gè)獨(dú)立的分支,可能又具有相對(duì)獨(dú)立的進(jìn)化。

        圖5 TYLCV廣西辣椒分離物BS66-1、BS67-1與其他19個(gè)分離物的全長(zhǎng)核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of TYLCV Guangxi pepper BS66-1,BS67-1 and other 19 isolates based on full-length sequence

        2.4 PaLCuCNV 廣西辣椒分離物的遺傳進(jìn)化分析

        將PaLCuCNV廣西辣椒分離物和已登錄GenBank的16個(gè)PaLCuCNV分離物用MEGA 7.0軟件中的最大似然法進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建(圖6),了解本研究中得到的1個(gè)PaLCuCNV廣西辣椒分離物與已報(bào)道的PaLCuCNV分離物的進(jìn)化關(guān)系。PaLCuCNV廣西辣椒分離物BS66-2與PaLCuCNV中國(guó)廣西3個(gè)分離物處于同一個(gè)大分支,并且PaLCuCNV廣西辣椒分離物BS66-2與PaLCuCNV GX01(GenBank登錄號(hào):MW779523,寄主:番茄)處于同一個(gè)小分支,說(shuō)明三者親緣關(guān)系較近,但廣西辣椒分離物與PaLCuCNV GX01具有更近的親緣關(guān)系。

        圖6 PaLCuCNV廣西辣椒分離物BS66-2與其他16個(gè)分離物的全長(zhǎng)核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.6 Phylogenetic tree of PaLCuCNV Guangxi pepper BS66-2 and other 16 isolates based on full-length sequence

        3 討 論

        本研究對(duì)廣西百色市葉片表現(xiàn)出黃化、皺縮、葉片上卷等癥狀的辣椒進(jìn)行鑒定后證實(shí),辣椒受到雙生病毒的侵染,進(jìn)一步利用分段克隆、核苷酸序列比對(duì)分析、進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建等方法,從2個(gè)辣椒陽(yáng)性樣品中共獲得3條雙生病毒的全基因序列,這3條序列分別與番茄黃化曲葉病毒不同分離物的序列和中國(guó)番木瓜曲葉病毒不同分離物序列的核苷酸相似性均在91%以上,根據(jù)國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)對(duì)菜豆金色黃花葉病毒的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)[20],病毒DNA-A的核苷酸相似性大于91%則認(rèn)為是同種病毒的不同分離物。因此,侵染廣西辣椒的病毒分別屬于TYLCV和PaLCuCNV分離物。本研究是TYLCV和PaLCuCNV侵染廣西辣椒的首次報(bào)道。

        通過(guò)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)的方式對(duì)本研究中獲得的3條序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn),本研究獲得的TYLCV BS66-1與TYLCV中國(guó)分離物SG1(GenBank登錄號(hào):MT969010)處于同一個(gè)小分支,說(shuō)明其親緣關(guān)系較近;而TYLCV BS67-1則與TYLCV中國(guó)廣西分離物GX(GenBank登錄號(hào):MW389934)處于同一個(gè)小分支,說(shuō)明其親緣關(guān)系較近。PaLCuCNVBS66-2則與PaLCuCNV中國(guó)河南、廣西分離物處于相同大分支,親緣關(guān)系較近。

        TYLCV和PaLCuCNV均屬于雙生病毒科的菜豆金色花葉病毒屬病毒,TYLCV最早于1934—1946年在以色列被發(fā)現(xiàn),1964年被正式命名[21-22]。在中國(guó),TYLCV自2006年在浙江、上海等地發(fā)現(xiàn)以來(lái),快速蔓延至山東、河南、北京、廣東等地[23-24]。TYLCV于2019年傳入廣西,在番茄上得到鑒定[25],2年后又被再次確認(rèn)侵染廣西的辣椒,證實(shí)該病毒正在廣西區(qū)內(nèi)擴(kuò)散蔓延。PaLCuCNV以番木瓜為自然寄主,首次在廣西被Wang等[26]發(fā)現(xiàn),主要分布在云南、廣西、廣州等地[27-29],本研究則證實(shí)辣椒是PaLCuCNV的自然寄主。

        廣西是我國(guó)重要的冬種蔬菜生產(chǎn)基地,承擔(dān)著南菜北運(yùn)的重要使命。辣椒是廣西蔬菜生產(chǎn)中重要的品種,辣椒產(chǎn)業(yè)也是廣西部分地區(qū)收入增長(zhǎng)的主要來(lái)源[30]。本研究在百色市田陽(yáng)區(qū)的調(diào)查中發(fā)現(xiàn),番茄與辣椒混合種植較為普遍,栽種模式增加了不同作物間病毒互相傳染的概率。而田陽(yáng)種植的番茄種苗大多為本地生產(chǎn),但也存在從福建、云南、四川等多地調(diào)苗的現(xiàn)象,番茄種苗區(qū)外調(diào)運(yùn)的現(xiàn)象則加劇了區(qū)域間蟲(chóng)媒病毒的傳播,適宜的傳播環(huán)境更易造成病毒病害的擴(kuò)散蔓延。因此,應(yīng)加強(qiáng)檢疫,防止病毒通過(guò)種苗傳播蔓延,另外,也應(yīng)加強(qiáng)對(duì)該類(lèi)病毒的監(jiān)測(cè),及時(shí)了解病毒種類(lèi)動(dòng)態(tài)變化。同時(shí),生產(chǎn)中應(yīng)種植抗病品種,控制煙粉虱的數(shù)量,以此達(dá)到控制病毒傳播,防范病毒蔓延的目的。

        4 結(jié) 論

        廣西百色市辣椒呈現(xiàn)葉片上卷、黃化、皺縮等癥狀的病毒病原為T(mén)YLCV和PaLCuCNV。通過(guò)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn),本研究獲得的TYLCV和PaLCuCNV辣椒分離物與GenBank已報(bào)道的TYLCV和PaLCuCNV番茄分離物均具有較近的親緣關(guān)系,說(shuō)明這2種病毒可能是經(jīng)番茄傳播至辣椒,今后應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)測(cè)。

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