董 毅 徐貴穎 馬牧松 劉 濤（吉林省腫瘤醫(yī)院乳腺外二科，長春 132000）

乳腺癌是最常見的癌癥類型，也是全球女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因［1］。雌激素受體α（estrogen receptor α，ERα）過度表達是ERα+乳腺癌的特征之一，且ERα+乳腺癌是一種主要的乳腺癌亞型［2］。ER是一種激素轉(zhuǎn)錄因子，通過與雌激素結(jié)合而被激活，促進細胞周期進程［3］。內(nèi)分泌治療是ERα+乳腺癌患者的常規(guī)治療方法［4］。他莫昔芬（tamoxifen，TAM）是一種常用的激素治療藥物，通過與雌激素競爭與ER蛋白的結(jié)合抑制ER轉(zhuǎn)錄程序［5］。TAM雖然大大改善了乳腺癌患者的預(yù)后，但在臨床治療過程中經(jīng)常觀察到新發(fā)和獲得性的TAM耐藥，導致乳腺癌復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，最終導致患者死亡［6］。PI3K/Akt通路是癌癥中最頻繁激活的通路之一，也是癌細胞產(chǎn)生耐藥性的最重要原因之一［7］。PI3K蛋白具有絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）激酶和磷脂酰肌醇激酶雙重活性。細胞內(nèi)PI3K的激活因子通過招募銜接蛋白促進p110和p85結(jié)合以激活PI3K?；罨腜I3K可將3，4-二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）轉(zhuǎn)化為3，4，5-三磷酸（PIP3），PIP3作為第二信使可與磷酸肌醇依賴性激酶-1（PDK1）結(jié)合，在Thr308處磷酸化Akt。Akt也可在Ser473處被mTORC2磷酸化。Akt是關(guān)鍵的信號轉(zhuǎn)導蛋白，可磷酸化多種底物和下游效應(yīng)物，并使癌細胞產(chǎn)生耐藥性?；诖?，本研究將以乳腺癌細胞HCC1937和MCF7為研究對象，通過高通量測序和siRNA篩選鑒定乳腺癌細胞TAM耐藥的關(guān)鍵分子。

1 材料與方法

1.1 材料PI3K/Akt通路抑制劑Pectolinarin（貨號：S3056）和Miltefosine（貨號：S9054）、TAM（貨號：S1238）購自Selleck公司；人乳腺癌細胞HCC1937、MCF7（貨號：CL-0093、CL-0149）購自Procell公司、Li‐pofectamine 3000（貨號：L3000001）購自北京索萊寶科技有限公司；siRNA、miR-5003-3p inhibitor、miR-5003-3p mimics和miRNA模擬物的適當陰性對照購自南京金斯瑞；TRIzol RNA Kit（貨號：16096040）購自北京華威銳科化工有限公司；SuperScriptⅡ逆轉(zhuǎn)錄酶（貨號：18064022）購自北京冬歌博業(yè)生物科技有限公司；iTaq Universal Probes Supermix（貨號：1725131）購自武漢佰法生物科技有限公司；AO/EB染色試劑盒（貨號：E607308-0200）購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與處理 人乳腺癌細胞HCC1937和MCF7培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）、50活性單位/ml青霉素和50 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中。TAM抗性細胞系HCC1937/TR和MCF7/TR通過與濃度逐步增加的TAM孵育衍生而來。處理HCC1937和MCF7細胞的TAM劑量從0.001 μmol/L增加到0.1μmol/L，處理12個月以上。處理過程中，每輪處理后，當存活細胞達到>70%匯合時，進行胰酶消化傳代，并增加TAM劑量。根據(jù)制造商說明書，將HCC1937/TR和MCF7/TR細胞接種于12孔板孵育24 h以達到30%~40%的匯合度，并使用Lipofectamine3000以HSP90α siRNA或?qū)φ誷iRNA siGFP瞬時轉(zhuǎn)染細胞。

1.2.2 RNA提取與實時熒光定量PCR TAM處理48 h后，使用TRIzol RNA Kit提取總RNA?？俁NA使用SuperScriptⅡ逆轉(zhuǎn)錄酶生成cDNA。PCR使用iTaq Universal Probes Supermix以20 μl的最終反應(yīng)體積進行3次重復(fù)，使用基因特異性引物/探針組和標準熱循環(huán)程序（35個循環(huán)）在Bio-Rad CFX96TM實時PCR系統(tǒng)上進行。通過比較Ct方法（ΔΔCt）確定目標轉(zhuǎn)錄物的相對定量。在沒有逆轉(zhuǎn)錄的情況下進行對照實驗以確認總RNA沒有被基因組DNA污染。以GAPDH為HSP90α的內(nèi)參，U6為miRNA的內(nèi)參。

1.2.3 蛋白免疫印跡 過表達或敲低miR-5003-3p 48 h后（或過表達或敲低HSP90α 48 h后），以細胞裂 解 液（0.1%SDS、1%NP-40、150 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris-HCl）裂解。采用BCA蛋白定量試劑盒對蛋白質(zhì)進行定量。蛋白質(zhì)樣品通過10%SDSPAGE電泳分離，并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜（0.45μm）。室溫下用含5%牛血清白蛋白（BSA）的PBS-Tween-20（PBST）封閉膜60 min。與GAPDH、HSP90α、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt抗體4℃孵育60 min。進一步與二抗在室溫下孵育60 min。隨后進行化學發(fā)光反應(yīng)。

1.2.4 細胞周期檢測TAM處理48 h后，采用流式細胞術(shù)進行細胞周期分析。使用FACS CantoⅡ流式細胞儀在405 nm下分析含胰蛋白酶化黏附物的樣品，并使用450/50帶通濾光片收集細胞發(fā)射物。進一步使用FlowJo V10軟件分析結(jié)果，確定細胞周期分布。

1.2.5 細胞凋亡水平檢測TAM處理48 h后，AO/EB法檢測細胞凋亡。然后根據(jù)制造商說明書，以AO/EB染色細胞，于200倍放大的FV300/FV500激光掃描共聚焦顯微鏡下檢查。凋亡細胞表現(xiàn)為核凝結(jié)和碎裂。

1.2.6 細胞活力檢測TAM處理48 h后，MTT法檢測細胞活力。將8×103個細胞接種于96孔板培養(yǎng)24 h，然后用不同濃度的藥物處理。孵育48 h后，使用3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯四唑溴化銨（0.5 mg/ml）和Bio-Tec酶標儀在562 nm波長下檢測細胞活力。

1.2.7 高通量測序TAM處理48 h后，使用TRIzol RNA Kit提取總RNA；使用NuGEN Ovation RNA System V2和NuGEN Ultra Low library System V2制備RNA-seq文庫；使用RNA-Seq系統(tǒng)（NuGEN）對RNA-seq文庫進行測序；使用Qubit和Agilent Bioan‐alyzer 2100分析評價擴增文庫的質(zhì)量和數(shù)量。

1.2.8 熒光素酶報告實驗HSP90α-γ基因的3′-非翻譯區(qū)（UTR）在與GV126熒光素酶基因融合前進行PCR擴增。HSP90α基因和miR-5003-3p的結(jié)合位點通過定點突變切除作為對照。胸苷激酶啟動子和表達海參熒光素酶的質(zhì)粒用于調(diào)整轉(zhuǎn)染效率。采用熒光素酶報告載體將miR-5003-3p mimics和對照共轉(zhuǎn)染至MCF7細胞，并進行熒光素酶實驗。

1.3 統(tǒng)計學分析 所有實驗重復(fù)3次。采用學生t檢驗和單因素方差分析（One-Way ANOVA with post-hoc Tukey's test）比較不同組的數(shù)據(jù)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 TAM抗性的人乳腺癌細胞HCC1937和MCF7的構(gòu)建TAM處理可顯著抑制親本細胞的增殖并誘導細胞凋亡，但不能抑制抗性細胞，見圖1A~C。此外，經(jīng)TAM處理后，HCC1937/TR和MCF7/TR細胞周期階段的分布發(fā)生顯著變化。TAM處理可在HCC1937和MCF7細胞中顯著誘導G1期停滯，但在HCC1937/TR和MCF7/TR中則不然，見圖1D、E。提示已成功篩選出TAM抗性細胞（HCC1937/TR和MCF7/TR）。

圖1 TAM抗性的人乳腺癌細胞構(gòu)建Fig.1 Construction of TAM-resistant human breast cancer cells

2.2 HSP90α激活PI3K/Akt通路引起乳腺癌細胞TAM耐藥 將TAM處理和未處理的HCC1937/FR細胞進行高通量測序，發(fā)現(xiàn)TAM處理后，多個基因的表達水平被調(diào)節(jié)（圖2A）；通過siRNA篩選，發(fā)現(xiàn)當敲低HSP90α時，HCC1937/FR細胞凋亡水平升高（P<0.05，圖2B）；過表達HSP90α后，HCC1937/TR和MCF7/TR細胞凋亡水平降低（P<0.05，圖2C、D）；敲低HSP90α后，MCF7/TR細胞凋亡水平顯著升高（P<0.05，圖2E）；在HCC1937和MCF7細胞中過表達HSP90α后采用TAM處理，HCC1937和MCF7顯示出對TAM抑制增殖的抵抗（P<0.05，圖2F、G）；敲低HSP90α后，PI3K/Akt通路受到抑制（圖2H）；過表達HSP90α后，PI3K/Akt通路 激活（圖2I）；使 用PI3K/Akt通路抑制劑Pectolinarin或Miltefosine處理后，再用TAM處理，HCC1937/TR和MCF7/TR細胞凋亡水平顯著升高（P<0.05，圖2J）。

圖2 HSP90α激活PI3K/Akt通路引起乳腺癌細胞TAM耐藥Fig.2 HSP90α activates PI3K/Akt pathway to cause TAM resistance in breast cancer cells

2.3 miR-5003-3p靶 向HSP90α介導 乳 腺癌細胞TAM耐 藥TAM處 理HCC1937/TR和MCF7/TR細胞 后，HSP90α mRNA水 平 均 升 高（P<0.05），但HSP90α轉(zhuǎn)錄水平無明顯變化（P>0.05，圖3A、B）；miRDB在線分析發(fā)現(xiàn)，有多個miRNAs靶向HSP90α，TAM處理后，MCF7/TR細胞中miR-5003-3p表達水平降低（P<0.05，圖3C）；TAM處理后，HCC1937/TR細胞中miR-5003-3p表達水平降低（P<0.05，圖3D）；在HCC1937/TR和MCF7/TR細胞中過表達miR-5003-3p后，HSP90α表達水平降低（P<0.05）；敲低miR-5003-3p后，HSP90α表達水平升高（P<0.05），見圖3E；TAM處理后過表達miR-5003-3p，HCC1937和MCF7凋亡水平升高（P<0.05）；TAM處理后并敲低miR-5003-3p，HCC1937和MCF7細胞凋亡水平降低（P<0.05），見圖3F、G；同時，miR-5003-3p靶向HSP90α的3'UTR區(qū)（圖3H）；此外，敲低miR-5003-3p后，PI3K/Akt通路激活（圖3I）；過表達miR-5003-3p后，PI3K/Akt通路受到抑制（圖3J）。

圖3 miR-5003-3p靶向HSP90α介導乳腺癌細胞TAM耐藥Fig.3 miR-5003-3p targeting HSP90α mediates TAM resistance in breast cancer cells

3 討論

在過去的幾十年，TAM是ER陽性乳腺癌最常見、最有效的內(nèi)分泌治療藥物，顯著提高了乳腺癌患者生存率［1］。然而，有30%~40%接受抗雌激素治療的患者最終對TAM產(chǎn)生耐藥性并導致復(fù)發(fā)，這是乳腺癌死亡的主要原因之一［8］。

本研究通過TAM梯度處理成功獲得HCC1937/TR和MCF7/TR細胞。通過高通量測序和siRNA篩選鑒定了與乳腺癌細胞耐TAM的關(guān)鍵分子HSP90α。當敲低HSP90α時，HCC1937/FR細胞凋亡水平升高。過表達HSP90α后，HCC1937/TR和MCF7/TR細胞凋亡水平顯著降低。敲低HSP90α后MCF7/TR細胞凋亡水平顯著升高。在HCC1937和MCF7細 胞 中 過 表 達HSP90α并 用TAM處 理，HCC1937和MCF7顯示出對TAM抑制增殖的抵抗（P<0.05）。HSP90α蛋白被稱為癌癥伴侶蛋白，是參與增殖、分化、凋亡、血管生成、轉(zhuǎn)移、腫瘤發(fā)生、遺傳變異等必要信號轉(zhuǎn)導通路的蛋白質(zhì)分子伴侶［9］。有研究報道，HSP90α在乳腺癌中的表達增加與細胞存活增加和預(yù)后不良相關(guān)［10］。此外，HSP90α抑制劑作為乳腺癌治療的臨床試驗正在進行中［11］。因此，HSP90α抑制劑與TAM聯(lián)合使用可能改善乳腺癌患者的預(yù)后。

據(jù)報道，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)突變、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)共激活因子上調(diào)、致癌途徑激活等機制可導致內(nèi)分泌治療的耐藥性［12-13］。尤其是TAM耐藥乳腺癌細胞可能通過激活PI3K/Akt/mTOR和EGFR-MAPK信號通路克服藥物誘導的細胞生存和增殖抑制［14］。敲低HSP90α后，PI3K和Akt的總體表達水平無明顯變化，但磷酸化的PI3K和Akt表達水平降低，說明PI3K/Akt通路受到抑制；PI3K/Akt通路抑制劑Pectolinarin或Miltefo‐sine處理后，再用TAM處理，HCC1937/TR和MCF7/TR細胞凋亡水平顯著升高。提示HSP90α通過激活PI3K/Akt通路引起乳腺癌對TAM的抗性。PI3K/Akt通路包括具有三個關(guān)鍵調(diào)控節(jié)點的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導酶家族：PI3K、Akt和mTOR［15］。PI3K可被多種信號激活，隨后活化Akt［16］。激活后，p110 PIK3CA磷酸化磷脂酰肌醇PIP2以形成磷脂酰肌醇PIP3。Akt與PIP3的結(jié)合導致Akt從細胞質(zhì)易位到質(zhì)膜，其中3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1（PDK1）和Akt的共定位允許PDK1在蘇氨酸308處磷酸化Akt。Akt的完全激活需要其在S473處被mTOR/Rictor復(fù)合物2（mTORC2）磷酸化。激活后，Akt磷酸化大量下游底物，這些底物通過調(diào)節(jié)mTOR/Raptor復(fù)合物1（mTORC1）活性調(diào)節(jié)細胞生長和蛋白質(zhì)合成，隨后增加增殖/細胞周期進程，抑制細胞凋亡，促進乳腺癌對TAM的抵抗。

miRNAs是真核生物中具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達功能的一類非編碼小RNA［17］。本研究中，TAM處理后MCF7/TR和HCC1937/TR細胞中miR-5003-3p表達水平降低（P<0.05）。在HCC1937/TR和MCF7/TR細胞中，過表達miR-5003-3p后HSP90α表達水平降低；敲低miR-5003-3p后，HSP90α表達水平升高。TAM處理后過表達miR-5003-3p，HCC1937和MCF7凋亡水平升高（P<0.05）；TAM處理后并敲低miR-5003-3p，HCC1937和MCF7凋亡水平降低。此外，敲低miR-5003-3p后，PI3K/Akt通路激活。過表達miR-5003-3p后，PI3K/Akt通路受到抑制。越來越多的證據(jù)表明，miRNA在腫瘤起始和惡性進展過程中發(fā)揮重要作用［18-19］。因此，基于miR-5003-3p的新抗癌療法能夠改善如乳腺癌患者TAM耐藥問題。

綜上所述，在受到持續(xù)化療藥物TAM處理后，乳腺癌細胞HCC1937和MCF7中靶向HSP90α mRNA的miR-5003-3p表達水平降低，HSP90α表達水平上升后激活PI3K/Akt通路，最終引起乳腺癌細胞對TAM的耐藥。