李加鳳，王興武，王京群，李蘊(yùn)慧，金忠元，陳玉霞，張慧慧

（青島易邦生物工程有限公司 266114）

貓杯狀病毒是杯狀病毒科杯狀病毒屬成員之一，該科成員還包括水皰疹病毒屬、兔嵌杯病毒屬、諾如病毒屬和沙波病毒屬[1]，為單股正鏈RNA病毒，是引起貓科動(dòng)物疾病的一種重要病原體，對(duì)環(huán)境耐受力較差，不易保存，在-10℃條件下只能保存2～3周，在-80℃條件下，保存2～3年，凍干毒可以長(zhǎng)期保存。病毒無(wú)囊膜，病毒粒子大小35～40nm，正二十面體對(duì)稱。FCV主要在胞漿中合成、成熟，呈晶格狀排列[2]。主要引起上呼吸道癥狀，臨床表現(xiàn)為精神沉郁、發(fā)熱、眼鼻分泌物增多且多為膿性，結(jié)膜炎、口腔潰瘍、支氣管炎等，嚴(yán)重者還會(huì)引起患病動(dòng)物的跛行，表現(xiàn)為不愛運(yùn)動(dòng)，關(guān)節(jié)腫大，頭擱置于前腿，用手觸摸可感受到關(guān)節(jié)處有液體，杯狀病毒不僅可混合感染貓皰疹病毒，也常與其他病毒或寄生蟲混合感染，使得診斷更加困難，病毒分離培養(yǎng)與RT-PCR以及電鏡都是比較常用的方法。

2021年我們從嶗山區(qū)一家寵物醫(yī)院疑似感染杯狀病毒的貓鼻腔試子中分離到一株貓杯狀病毒FCV-LH，現(xiàn)將其分離、純化、鑒定結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料

1.1 病料

采集嶗山區(qū)一寵物醫(yī)院疑似感染杯狀病毒的貓鼻腔試子。

1.2 細(xì)胞

F81細(xì)胞購(gòu)自ATCC。

1.3 試劑

DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；新生牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；瓊脂糖，0.5%中性紅購(gòu)自Sigma公司；貓抗體檢測(cè)試劑盒為拜奧高試劑盒，購(gòu)自附近的寵物醫(yī)院；消化液為0.25%胰酶-EDTA購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，0.01M/L的PBS為自行配制。其中生長(zhǎng)液為含10%新生牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，維持液為2%新生牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液。

2 方法

2.1 病料采集與處理

2.1.1 病料來(lái)源 采集嶗山區(qū)一寵物醫(yī)院疑似感染貓杯狀病毒的寵物貓鼻腔試子，低溫取回后進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)為貓杯狀病毒陽(yáng)性。

2.1.2 病料處理 用0.01M/L的PBS進(jìn)行三倍稀釋，-80℃/常溫凍融三次之后，然后用渦旋振蕩器將試子與病毒保存液充分混勻，然后擠壓棉簽，將棉簽取出，鼻試子病料中雜質(zhì)較少，直接12000r/min離心10min，取上清液，加入2000單位每毫升的雙抗放置于2℃～8℃冰箱作用1h待用。

2.1.3 分離培養(yǎng) 取長(zhǎng)滿單層且狀態(tài)良好的F81細(xì)胞，用0.01M/L的PBS或者無(wú)血清的DMEM清洗細(xì)胞2～3次，洗掉殘余血清，取處理好的病料按5%比例接入，接入細(xì)胞之后輕輕晃動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，使病毒液充分與細(xì)胞接觸，適量加入無(wú)血清的DMEM，防止細(xì)胞在孵育的過程中干掉，影響病毒繁殖，然后放入接毒細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育1h，孵育期間每15min輕晃培養(yǎng)瓶，充分浸潤(rùn)細(xì)胞，孵育完成之后取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶，然后加入含2%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。按此方式盲傳三代。杯狀病毒典型的病變特征為核固縮，一般表現(xiàn)為細(xì)胞圓縮、發(fā)亮、脫落，病料接毒之后培養(yǎng)時(shí)間一般為2～3d，如果盲傳三代之后依然無(wú)病變，可判為陰性。如果盲傳三代以后有明顯且典型的病變，可進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)進(jìn)行復(fù)檢。

2.1.4 初步鑒定 根據(jù)GenBank中已收錄的FCV序列，參考艾純旭碩士學(xué)位論文（艾純旭，2013）中所使用的FCV鑒定引物，進(jìn)行PT-PCR檢測(cè)。上游引物5GGGCTTGATTGATACTGTTAC3，下游引物5CCCTAAAACCAGCAGCAC3（218bp）[3]，引物由上海生工生物合成。

取病變明顯代次的細(xì)胞懸液200μL，用天根生化科技有限公司的DNA/RNA共提試劑盒按照說明書進(jìn)行核酸的提取，之后做好標(biāo)記。

RT-PCR擴(kuò)增體系如下：

Onestep Enzyme Mix 1μL 2XOne-step Rection Solution A 12.5μL上游引物F 1μL下游引物R 1μL模板RNA 2μL ddH2O 7.5μL總體積 25μL

反應(yīng)條件是50℃反轉(zhuǎn)錄30min，95℃預(yù)變性5min，進(jìn)入循環(huán)之后，94℃變性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，32個(gè)循環(huán)之后72℃大延伸3min。RT-PCR產(chǎn)物用0.1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢查。電泳時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，排除其他因素的干擾。

2.2 病毒純化

2.2.1 DMEM營(yíng)養(yǎng)瓊脂的制備 第一層營(yíng)養(yǎng)瓊脂配制：用注射用水配制1.6%的瓊脂121℃高壓滅菌20min，置56℃水浴中待用；將兩倍濃縮的DMEM培養(yǎng)基置37℃水浴中待用。將56℃的1.6%滅菌瓊脂與兩倍濃縮的DMEM等量混勻即為第一層營(yíng)養(yǎng)瓊脂。

2.2.2 純化方法 取長(zhǎng)滿單層且狀態(tài)良好的F81細(xì)胞六孔板2個(gè)，用無(wú)血清的DMEM洗滌3次，盡量去除死細(xì)胞和殘留血清。取代純化病毒液，用無(wú)血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液做10倍梯度稀釋，取10-3～10-6四個(gè)梯度進(jìn)行接毒培養(yǎng)，每個(gè)梯度2孔，0.5mL/孔，同時(shí)每塊六孔板設(shè)置1～2孔健康細(xì)胞對(duì)照。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中吸附1h，每15min輕晃一下細(xì)胞瓶，使病毒液均勻覆蓋。棄掉吸附后的病毒稀釋液，并用無(wú)血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液洗細(xì)胞2～3遍，以充分洗掉未吸附到細(xì)胞的病毒。每孔加入第一層營(yíng)養(yǎng)瓊脂約2mm，凝固后，將細(xì)胞置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每6h觀察接毒細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。開始出現(xiàn)CPE時(shí)，鋪第二層含中性紅的顯色瓊脂。第二層顯色瓊脂配制：用注射用水配制2.0%瓊脂121℃高壓滅菌20min，置56℃水浴待用。用時(shí)與37℃的兩倍濃縮的DMEM等量混勻（含終濃度1/5000的中性紅），即為第二層顯色瓊脂。

待瓊脂凝固后，每2～3h觀察一次，當(dāng)出現(xiàn)清晰的蝕斑之后進(jìn)行蝕斑挑選。挑選的時(shí)候用200ul的滴頭挑出不同大小的蝕斑，連同瓊脂一起接入長(zhǎng)滿單層的CRFK細(xì)胞的24孔板中，培養(yǎng)至CPE達(dá)75%以上時(shí)，收獲，再次進(jìn)行第二次蝕斑克隆純化試驗(yàn)，如此純化三代。

2.3 病毒的鑒定

2.3.1 RT-PCR檢測(cè) 用2.1.4的方法進(jìn)行PT-PCR檢測(cè)是否有目的條帶。

2.3.2 病毒的效價(jià)測(cè)定 取長(zhǎng)滿單層的F81細(xì)胞，消化之后接入96孔板，每孔100uL，標(biāo)記好之后放入37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)6～8h，取需要測(cè)定的病毒用2%血清的DMEM進(jìn)行倍比稀釋，稀釋到10-8，吸出培養(yǎng)板中的廢液之后，將稀釋好的病毒液接入，每孔100uL棄去邊緣孔，接中間的六個(gè)孔，并設(shè)置陰性對(duì)照，邊緣孔加入維持液，標(biāo)記好之后放入37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)，每天觀察病變情況并進(jìn)行記錄。到第5d的時(shí)候按Reed-Muench法計(jì)算TCID50。

2.3.3 病毒的致病性 取純化后第三代病毒液，按Reed-Muench法計(jì)算TCID50，根據(jù)測(cè)定結(jié)果稀釋到10-5.0TCID50/0.1mL；取無(wú)貓杯狀抗體的60日齡小貓7只，隨機(jī)選取5只用于攻純化后第3代貓杯狀病毒，另外2只作為對(duì)照，兩組貓?jiān)谙嗤h(huán)境下隔離喂養(yǎng)，攻毒組每只貓滴鼻50μL，點(diǎn)眼50μL；攻毒后第3d開始，每日觀察貓的發(fā)病情況并記錄。

3 結(jié)果

病料處理之后接毒F81細(xì)胞第二代開始出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，第三代出現(xiàn)核固縮、圓縮、發(fā)亮的典型細(xì)胞病變。RTPCR初步檢測(cè)有目的條帶，且與陽(yáng)性對(duì)照目的條帶片段大小相同，陰性對(duì)照則無(wú)。進(jìn)行第一代病毒純化時(shí)，出斑時(shí)間從36～48h不等，蝕斑直徑大小不一，挑取獨(dú)立并且數(shù)量占優(yōu)勢(shì)的蝕斑進(jìn)行后續(xù)純化，三代純化后均可在30h內(nèi)開始出現(xiàn)蝕斑，取純化之后的病毒上清液進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，有目的條帶出現(xiàn)，與陽(yáng)性對(duì)照目的條帶片段大小相同，陰性對(duì)照則無(wú)。按Reed-Muench法計(jì)算TCID50，F(xiàn)CV-LH的TCID50為10-8/mL。純化后3代病毒液按Reed-Muench法計(jì)算TCID50，F(xiàn)CV-LH的TCID50為10-8.5/mL。將病毒液體稀釋攻毒后，第5天開始發(fā)病，主要臨床癥狀為體溫升高，精神不振，食欲下降，眼鼻分泌物增多，嚴(yán)重者糊住眼睛和鼻孔；在觀察期內(nèi)未出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫大的臨床癥狀。發(fā)病照片見圖1、圖2。第7天有一只小貓出現(xiàn)口腔潰瘍，流涎嚴(yán)重的臨床癥狀，發(fā)病圖片見圖3。第7天也為發(fā)病高峰，截止第8天，共有4只小貓發(fā)病，一只未發(fā)病。癥狀持續(xù)到第9天左右開始陸續(xù)恢復(fù)，直到第14天，4只小貓基本完全恢復(fù)，恢復(fù)圖片見圖4。

圖1 發(fā)病小貓眼分泌物增多

圖2 發(fā)病小貓眼鼻分泌物增多

圖3 發(fā)病小貓流涎、口腔潰瘍

圖4 發(fā)病小貓基本恢復(fù)

4 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，近幾年寵物貓養(yǎng)殖數(shù)量越來(lái)越多，F(xiàn)CV呈世界性分布，雖然只有一個(gè)血清型，但由于病毒的不斷變異，導(dǎo)致疫苗的保護(hù)力下降[4]，因此開展對(duì)貓杯狀病毒的研究十分必要。

貓杯狀病毒用F81細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)可以產(chǎn)生典型的細(xì)胞病變，穩(wěn)定之后24～32h即可全部病變，具體病變表現(xiàn)為細(xì)胞發(fā)亮、圓縮、核固縮，最后成葡萄串樣脫落。但是RT-PCR的方法只能檢測(cè)是不是該病毒，而無(wú)法確定其毒力，按Reed-Muench法計(jì)算TCID50也僅說明了病毒含量，后續(xù)的動(dòng)物回歸試驗(yàn)證明了該病毒的致病力較強(qiáng)。

用蝕斑克隆純化法進(jìn)行純化時(shí)，要求較高，鋪瓊脂的厚度以及瓊脂溫度需要進(jìn)行準(zhǔn)確地把控；出斑挑斑時(shí)，斑太小，病毒不易繁殖，斑太大易夾雜其他病毒達(dá)不到純化目的，所以蝕斑克隆純化方法操作要求較高。純化三代之后，取病毒液接長(zhǎng)滿單層的F81細(xì)胞，病變出現(xiàn)快且典型，在沒有其他更好的純化方法的前提下，用蝕斑克隆方法進(jìn)行純化也是比較可行的。

后續(xù)還需進(jìn)行更加深入的研究，例如可以制苗看其免疫原性，然后綜合分析之后看其是否可以用于制備疫苗產(chǎn)品，這對(duì)于新產(chǎn)品的開發(fā)還是比較有意義的。