宋曉慶 李采霞 潘小紅 楊春燕 彭曉旭 張艷茹 高文怡 鄧 云

中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第904醫(yī)院(無錫，214000)

不孕(育)癥已成為一個(gè)全球性問題，并且有逐年增加趨勢(shì)[1-2]。雖然輔助生殖技術(shù)(ART)已成為解決不孕(育)癥的有效手段，但臨床成功率遠(yuǎn)未達(dá)到預(yù)期[3-4]。在不孕不育因素中，男性不育因素近50%[4]。男性不育主要與精子質(zhì)量有關(guān)，精子質(zhì)量易受如缺乏微量元素、疾病和感染因素、藥物、毒物和輻射損傷、氧化應(yīng)激、年齡、精神因素、不良生活習(xí)慣(吸煙、飲酒等)等多種因素的影響[5]。在導(dǎo)致男性不育眾多因素中，精子氧類活性物質(zhì)(ROS)受到了廣泛關(guān)注，活性氧誘導(dǎo)的精子氧化應(yīng)激損傷理論成為近年研究熱點(diǎn)[6-7]。本研究探究ROS與精子形態(tài)畸形及精子DNA損傷的可能關(guān)系，為男性不育癥抗氧化治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年8月-2020年8月在本院就診的男性不育患者精液標(biāo)本250例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①近期無嚴(yán)重的生殖系統(tǒng)感染，無激素類藥物服用史，無外傷及遺傳性家族史；②肝腎功能正常、無全身器質(zhì)性、急慢性疾?。虎廴旧w正常：46，XY，近半年內(nèi)未受到X線等輻射影響，體檢未發(fā)現(xiàn)睪丸、附睪、輸精管異常，無精索靜脈曲張。所有患者均簽署知情同意書，本研究通過倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 標(biāo)本采集

男方禁欲3～5d，手淫法收集精液，37℃孵育30min液化后室溫下梯度離心，棄上清收集沉淀，用Ham'sF-1培養(yǎng)基洗滌精子2次；棄上清收集沉淀，加入Ham'sF-10+BSA3.5mg/ml(9:1)培養(yǎng)基，調(diào)整精子密度至20×106/ml，輕輕攪拌，制備精子懸液備用。

1.3 觀察方法

1.3.1精子形態(tài)學(xué)分析參照第五版《WHO人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》采用改良巴氏染色法，每張涂片至少計(jì)數(shù)分類200個(gè)精子，對(duì)精子頭部、頸部、尾部形態(tài)進(jìn)行評(píng)判，對(duì)精子頭部、頸部、尾部形態(tài)畸形以及混合畸形進(jìn)行分組，計(jì)算正常形態(tài)精子百分率與異常形態(tài)[8]。

1.3.2精子DNA完整性分析采用染色質(zhì)擴(kuò)散法(SCD)檢測(cè)精子核DNA損傷程度。具體方法參照Sperm Fun DNA試劑說明書，精子DNA碎片指數(shù)(DFI)判斷：精子頭部只產(chǎn)生小暈或無暈，單側(cè)暈厚度不能超過精子頭部最小直徑的1/3。在高倍顯微鏡下至少觀察到500個(gè)精子，計(jì)數(shù)含有DNA片段的精子數(shù)。精子DNA碎片指數(shù)(DFI)=(存在DNA碎片的精子數(shù)量/計(jì)數(shù)的精子總數(shù))×100%。

1.3.3精子ROS檢測(cè)采用上海杰美生物制劑公司生產(chǎn)的精子活性氧化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，采用魯米諾化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)。

1.3.4實(shí)驗(yàn)分組根據(jù)精子DFI分為<15%、15%～30%、>30% 3組；按照第五版《WHO人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》參考值將正常形態(tài)精子≥4%分為正常組，<4%為異常組。分析不同形態(tài)精子及精子DFI組間精子ROS水平關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布時(shí)，計(jì)數(shù)資料均采用卡方檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同精子形態(tài)學(xué)組間精子ROS水平

入組患者250例中精子形態(tài)正常占60.4%(151/250)，異常占39.6%(99/250)；精子形態(tài)異常中，頭部畸形47.5%%(47/99)，頸部畸形35.4%(35/99)，尾部畸形為13.1%(13/99)，混合畸形4.0%(4/99)，各畸形占比逐漸降低(P<0.05)。精子ROS水平，精子形態(tài)正常組(462.76±148.76 U/L)低于頭部畸形組(715.49±203.82 U/L)、頸部畸形組(711.39±206.24 U/L)、尾部畸形組(718.83±201.57 U/L)、混合畸形組(721.31±200.67 U/L)(t=9.262、8.235、5.779、3.404，P<0.05)，而各畸形組間無差異(均P>0.05)。

2.2 不同DFI值組精子ROS水平

分析比較，精子DFI<15%、DFI 15～30%、DFI>30%占比逐漸降低，分別為55.6%(139/250)、32.4%(81/250)、12.0%(30/250)(t=7.832、8.030、2.035，均P<0.05)；DFI>30%組精子ROS水平最高(719.74±205.39 U/L)，其次為DFI 15～30%組(637.24±183.65 U/L)和DFI<15%組(457.68±151.46 U/L)(F=46.417，P=0.000)。

2.3 精子形態(tài)學(xué)、精子DNA碎片與精子ROS水平相關(guān)性

Pearson相關(guān)性分析，精子形態(tài)正常率與精子ROS水平存在負(fù)相關(guān)(r=-0.345，P=0.000)，頭部畸形(r=0.242，P=0.009)、頸部畸形(r=0.167，P=0.008)、尾部畸形(r=0.128，P=0.043)發(fā)生率均與精子ROS水平存在正相關(guān)(P=0.05)；精子DFI值與精子ROS水平存在正相關(guān)性(r=0.341，P=0.000)。

3 討論

精子ROS可幫助維持男性正常生殖生理功能，與男性不育存在一定關(guān)系。以往研究認(rèn)為，ROS在精子發(fā)育過程中具有兩面性，正常生理劑量對(duì)精子獲能、精子活力以及頂體反應(yīng)具有重要影響。當(dāng)男性機(jī)體抗氧化體系失常，機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，精子會(huì)發(fā)生病理改變，如精子膜被破壞、精子成熟障礙、精子活力降低、線粒體功能障礙等，最終可能會(huì)導(dǎo)致精子死亡[9-11]。以往評(píng)估精子質(zhì)量時(shí)多采用精子常規(guī)檢查，近年有學(xué)者通過精子DFI值評(píng)價(jià)精子質(zhì)量取得較好應(yīng)用價(jià)值[12]。另外，有研究顯示正常形態(tài)精子占比對(duì)預(yù)測(cè)女方受孕概率有一定價(jià)值，且與受孕時(shí)間具有關(guān)聯(lián)性[13]。

在本研究中，250例入組患者中精子形態(tài)正常占比60.4%，精子形態(tài)異常中頭部畸形、頸部畸形、尾部畸形、混合畸形占比逐漸降低，精子形態(tài)異常各畸形組精子ROS水平無差異但均高于正常組。說明本組患者精子畸形率較高，且精子畸形者精子ROS水平更高。既往研究顯示[14-15]，形態(tài)異常精子伴隨產(chǎn)生大量活性氧，異常形態(tài)精子是產(chǎn)生氧自由基的主要來源之一，精子異常形態(tài)與精子ROS可能存在一定關(guān)系。本研究經(jīng)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，精子ROS水平與精子正常形態(tài)率呈負(fù)相關(guān)，與頭部畸形、頸部畸形、尾部畸形發(fā)生率均呈正相關(guān)，且以頭部畸形的相關(guān)性最高，具體原因有待進(jìn)一步研究。

本研究顯示，精子DFI<15%、DFI 15～30%、DFI>30%患者精子ROS水平逐漸升高，表明ROS水平高的精子更有可能含有DNA片段。分析認(rèn)為：精子膜不飽和脂肪酸含量高，自身抗氧化能力弱，在過量活性氧攻擊下易發(fā)生脂類過氧化反應(yīng)，而DNA堿基對(duì)氧化應(yīng)激敏感，這些結(jié)構(gòu)的過氧化作用可導(dǎo)致堿基修飾、DNA鏈斷裂和染色質(zhì)交聯(lián)，導(dǎo)致精子DNA片段增加。本文分析精子DFI值與精子ROS水平存在正相關(guān)性，也提示精子DNA損傷可能是由于精液中氧化應(yīng)激反應(yīng)造成的[16-17]。

綜上所述，異常形態(tài)精子可能是產(chǎn)生氧自由基的重要來源，而高水平精子ROS與精子DNA碎片增多可能有關(guān)，它會(huì)加速生殖細(xì)胞的凋亡、導(dǎo)致受精率降低等一系列不良后果。