陳一蕊 勾朝陽 李新陽

河南省南陽市中心醫(yī)院(473000)

宮頸癌是婦科惡性腫瘤，臨床研究發(fā)現(xiàn)，宮頸病變程度較高時癌細(xì)胞易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后效果差，早期宮頸癌的5年生存率為90%，而晚期的5年生存率僅為25%[1]。高危人乳頭瘤病毒(HPV)持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)病的主要原因[2]。宮頸病變主要分為宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變(SIL)、宮頸癌、宮頸柱狀上皮異位等，早期臨床表現(xiàn)不明顯，易導(dǎo)致漏診而延誤治療的最佳時機[3]。因此，尋找特異度較高的分子標(biāo)記物，對宮頸癌早期診治對改善患者預(yù)后有重大意義。微小RNAs(miRNAs)具有調(diào)控基因，參與機體細(xì)胞活動的作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-3607-3p在乳腺癌、前列腺癌、肝癌等惡性腫瘤中表達(dá)顯著降低[5]。但在宮頸癌中表達(dá)的研究目前缺乏。因此，本研究通過分析宮頸癌患者血清中miR-3607-3p表達(dá)水平及HPV感染情況及其相關(guān)性，為宮頸癌的早期篩查和預(yù)后評估提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年8月-2020年2月在本院就診并行宮頸活檢的74例患者臨床資料，年齡28～69歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《2015年NCCN宮頸癌臨床實踐指南》[6]關(guān)于宮頸癌病變診斷標(biāo)準(zhǔn)；②初次行宮頸活體組織檢測；③臨床資料完整且本人與家屬自愿簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并其他惡性腫瘤及其他臟器功能障礙；②合并其他急性炎癥且接受治療；③合并宮頸手術(shù)史且宮頸組織切除。本研究方案經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器

RNA提取試劑盒(杭州昊鑫生物科技有限公司)，qRT-PCR檢測試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海鈺博生物科技有限公司)，引物均由北京伊塔生物科技有限公司合成，HPV E6/E7 mRNA試劑盒(德國貝克曼公司)，LEPGEN qRT-PCR儀(樂普生物科技股份有限公司)，NP80紫外分光光度計(德國implen公司)。

1.3 研究方法

1.3.1樣本采集采集研究對象空腹靜脈血，靜置后離心收集血清，置-18℃保存。

1.3.2qRT-PCR法檢測血清中miR-3607-3p水平嚴(yán)格按照說明操作，加入Trizol試劑提取血清中總RNA。將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，將所得cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，以U6為內(nèi)參基因，采用2-??Ct法計算miR-3607-3p水平。miR-3607-3p及內(nèi)參U6的引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3.3HPV-DNA檢測避開經(jīng)期，使用宮頸專用刷收集宮頸脫落細(xì)胞，提取宮頸脫落細(xì)胞中DNA，采用PCR擴(kuò)增技術(shù)，利用第二代雜交捕獲法對其進(jìn)行檢測，檢測高危型HPV 14種，雜交反應(yīng)期間根據(jù)光強弱判斷是否存在HPV感染(DNA負(fù)荷量<1.0 ng/L為陰性，≥1.0 ng/L為陽性)。

1.3.4HPVE6/E7mRNA檢測采用HPV E6/E7 mRNA試劑盒檢測所有研究對象宮頸脫落細(xì)胞中HPV E6/E7 mRNA表達(dá)情況，≥500 copies/ml高載量組，<500 copies/ml低載量組。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較

經(jīng)病理檢查為宮頸炎18例(宮頸炎組)，SIL 31例(SIL組)，宮頸癌25例(宮頸癌組)。3組年齡、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、分娩次數(shù)無差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組一般資料比較

2.2 血清miR-3607-3p水平比較

血清中miR-3607-3p水平宮頸炎組(0.98±0.16)、SIL組(0.64±0.15)、宮頸癌組(0.34±0.13)依次降低(F=100.825，P=0.000)。

2.3 HPV-DNA與HPV E6/E7 mRNA表達(dá)比較

宮頸炎組、SIL組、宮頸癌組HPV-DNA與HPV E6/E7 mRNA表達(dá)水平依次升高(P<0.05)。見表3。

表3 各組HPV表達(dá)情況比較[例(%)]

2.4 宮頸癌患者血清miR-3607-3p表達(dá)與HPV感染的相關(guān)性

宮頸癌患者血清中miR-3607-3p高表達(dá)7例(28.0%)。Spearman分析顯示，宮頸癌患者血清中miR-3607-3p表達(dá)與HPV陽性表達(dá)、HPV E6/E7 mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.541、-0.492，均P=0.000)。

2.5 影響宮頸癌發(fā)生的logistic回歸分析

以是否發(fā)生宮頸癌為因變量(未發(fā)生=1、發(fā)生=0)，將賦值后的自變量miR-3607-3p、HPV陽性表達(dá)、HPV E6/E7 mRNA高載量納入logistic回歸分析。結(jié)果顯示HPV陽性表達(dá)、HPV E6/E7 mRNA高載量是影響宮頸癌發(fā)生的危險因素，而miR-3607-3p是宮頸癌發(fā)生的保護(hù)因素(P<0.05)。見表4。

表4 影響宮頸癌發(fā)生的多因素logistic回歸分析

3 討論

近年來，宮頸癌的發(fā)病年齡逐漸趨于年輕化，受到了社會廣泛關(guān)注。據(jù)報道，宮頸癌中80%的病例發(fā)生在欠發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家，我國每年約有10萬病例出現(xiàn)[7]。研究發(fā)現(xiàn)，HR-HPV持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸癌誘發(fā)的主要因素，96%以上的宮頸癌患者組織細(xì)胞中可以檢出HPV，可將其作為宮頸癌早期篩查的重要指標(biāo)[8-9]。早期宮頸癌患者及時治療預(yù)后較好，而晚期患者則預(yù)后較差、死亡率較高。因此，尋找靈敏度和特異度均高且檢測方便的生物學(xué)標(biāo)志，是當(dāng)前預(yù)測宮頸癌發(fā)病并改善預(yù)后的研究重點。

miRNA具有組織特異性、高度保守性和時序性[10]。轉(zhuǎn)錄后的miRNA調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)水平，30%轉(zhuǎn)錄靶基因受miRNA調(diào)控。另外，miRNA參與細(xì)胞生長、凋亡、分化和炎癥反應(yīng)等重要生物學(xué)過程[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中擔(dān)任重要角色，即在不同腫瘤中呈現(xiàn)不同程度的表達(dá)，miRNA在實驗檢測中可反復(fù)凍融而含量不被降解，且能長時間保存，這些優(yōu)點促使miRNA成為未來檢測某些腫瘤疾病的一種新型生物標(biāo)志物[12-13]。miRNA表達(dá)改變與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[14]。miR-3607-3p是一種位于染色體5q14.3上的內(nèi)含子miRNA，其表達(dá)變化可用于鑒別腫瘤細(xì)胞的存在[15]。Wu等[16]研究發(fā)現(xiàn)，CirclRAK3海綿miR-3607-3p影響乳腺細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移；Sun等[17]研究得出，miR-3607-3p在胰腺癌患者中表達(dá)下調(diào)，且miR-3607-3p水平與胰腺癌患者預(yù)后相關(guān)；相關(guān)功能實驗表明，miR-3607-3p能顯著抑制肝癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18]。而miR-3607-3p在宮頸癌中的研究鮮有報道，因此本研究探究宮頸癌患者血清中miR-3607-3p的表達(dá)水平及其與HPV感染相關(guān)性。

本研究結(jié)果顯示，宮頸炎組、SIL組、宮頸癌組患者血清中miR-3607-3p水平依次降低，提示miR-3607-3p水平與宮頸病變進(jìn)展有關(guān)；宮頸癌組HPV-DNA與HPV E6/E7 mRNA水平高于宮頸炎組和SIL組，進(jìn)一步提示宮頸癌發(fā)生與HPV感染有關(guān)。通過Spearman分析，宮頸癌患者血清中miR-3607-3p表達(dá)與HPV陽性表達(dá)、HPV E6/E7 mRNA水平呈負(fù)相關(guān)，提示miR-3607-3p可能與HPV感染相互作用，共同影響宮頸癌病情發(fā)展，但相互作用機制還有待深入探討。多因素分析表明，miR-3607-3p低水平、HPV陽性表達(dá)、HPV E6/E7 mRNA高載量均是宮頸癌發(fā)生的影響因素，均可能使宮頸癌發(fā)生風(fēng)險升高，監(jiān)控血清miR-3607-3p水平及HPV陽性表達(dá)率、HPV E6/E7 mRNA載量有利于宮頸癌的早期篩查及預(yù)后評估。

綜上所述，宮頸癌患者血清miR-3607-3p水平較低，是宮頸癌發(fā)生的影響因素，其與HPV感染呈負(fù)相關(guān)。檢測血清miR-3607-3p水平有助于預(yù)測宮頸癌發(fā)生，可作為宮頸癌篩查的生物指標(biāo)。但本研究樣本量較少，其具體作用機制尚不明確，研究中可能存在一定誤差，后續(xù)還需加大樣本量繼續(xù)探討研究。