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        ATRX新致病性變異致X連鎖智力低下家系分析

        2023-01-03 13:45:50金孝華安莉莎閆有圣曹小芳于晗澍
        關(guān)鍵詞:證者外顯子表型

        金孝華 安莉莎 閆有圣 張 璐 曹小芳 馬 旭 于晗澍

        1.國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所(北京,100081);2. 國家人類遺傳資源中心;3. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院;4. 菏澤市立醫(yī)院

        X連鎖智力低下綜合征(XLMR)是一組高度異質(zhì)性的先天性缺陷和智力發(fā)育異常,在男性患者中的發(fā)生率約為1/600,僅次于唐氏綜合征的發(fā)生率[1]。目前已經(jīng)報(bào)道的XLMR致病基因有90余個(gè)[2]。α地中海貧血X連鎖智力障礙(ATR-X)綜合征是一種罕見的XLMR,主要特征為智力低下、特殊面容、發(fā)育遲緩、身材矮小、小頭畸形、伴或者不伴有輕型α地中海貧血,ATRX基因突變是導(dǎo)致ATR-X綜合征的遺傳學(xué)因素[3]。筆者對于一個(gè)X連鎖智力低下家系進(jìn)行了臨床表型分析,經(jīng)全外顯子組(WES)測序及家系突變分析,明確ATRX基因突變導(dǎo)致了該家系A(chǔ)TR-X綜合征。

        1 資料和方法

        1.1 家系資料

        核心家系父母正常,生育二男一女,兩男孩子患病,女孩正常(圖1,492頁)。先證者(Ⅱ3)男,3歲,因孕36+2周胎心監(jiān)護(hù)異常剖宮產(chǎn),出生體重2.77kg,出生后診斷為“早產(chǎn)兒腦病”。頭顱MRI顯示:雙側(cè)大腦多發(fā)皮層下腦白質(zhì)異常信號,給于康復(fù)治療。身高89.7cm,體重13.5kg,頭圍49.0cm,經(jīng)《0~6歲小兒神經(jīng)心理發(fā)育量表》評估,發(fā)育商數(shù)(DQ)81.1,中度發(fā)育遲緩。血常規(guī)檢查結(jié)果顯示,紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)4.38×1012,血紅蛋白(HGB)116g/L,紅細(xì)胞比容(HCT)34.80%,平均紅細(xì)胞體積(MCV) 79.50fl,平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量(MCH)26.50pg,診斷為小細(xì)胞低色素貧血?;純河刑厥饷嫒荩貉劬鄬挕?nèi)眥贅皮、鼻梁低平、人中長、鯉魚樣嘴、厚嘴唇、V型上唇;生長發(fā)育遲緩;語言發(fā)障礙。先證者同胞哥哥(Ⅱ1)15歲,智力低下(IQ=43),血常規(guī)檢查正常,RBC 5.16×1012,HGB 149g/L,HCT 43.70%,MCV 84.70fL,MCH 28.90pg。特殊面容,6歲時(shí)頻發(fā)性癲癇。腦電圖提示雙側(cè)枕區(qū)不同步棘慢波,多棘慢波接近連續(xù)發(fā)放,右側(cè)顯著,給予抗癲癇藥物控制。先證者姐姐(Ⅱ2)、父(Ⅰ1)母(Ⅰ1)均無相關(guān)表型。遵循知情同意的原則,簽署知情同意書后,采集先證者同胞兄姐及父母外周血用于基因檢測。

        1.2 研究方法

        1.2.1DNA提取采用基因組DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit,QIAGEN,German)提取先證者及家系成員全血基因組DNA,嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。用核酸定量儀(Qubit2.0,Invitrogen)進(jìn)行基因DNA定量和純度測定。

        1.2.2全外顯子組測序分析證者基因組DNA經(jīng)定量后采用全外顯子組捕獲試劑盒(SureSelect Human All Exon V5,Agilent)捕獲全外顯子組,并進(jìn)行高通量測序試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建,在高通量測序儀(HiseqX10,Illumina)上進(jìn)行全外顯子組測序。測序片段通過BWA軟件(版本:0.7.9a)與UCSC hg19參考基因組進(jìn)行比對,采用GATK(版本:v3.2)進(jìn)行變異識別和分型,采用VEP軟件(Variant Effect Predictor, Ensembl 73)進(jìn)行注釋。參考變異數(shù)據(jù)庫ClinVar、OMIM 和HGMD篩選已知的致病變異,同時(shí)采用多種工具預(yù)測錯(cuò)義變異的功能以及非編碼調(diào)控序列的注釋。依據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(ACMG)發(fā)布的《序列變異解讀標(biāo)準(zhǔn)和指南》對每個(gè)變異進(jìn)行分類[4-5]。序列變異使用人類基因變異國際命名系統(tǒng)(HGVS)進(jìn)行變異命名和注釋[6]。

        1.2.3家系成員Sanger測序驗(yàn)證生物信息學(xué)分析獲得的候選致病基因突變位點(diǎn),在其周圍設(shè)計(jì)上下游擴(kuò)增引物,PCR反應(yīng)后獲得目標(biāo)區(qū)域產(chǎn)物,采用BigDye3.1(ABI)測序試劑盒進(jìn)行測序反應(yīng),產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀法純化后在ABI3500DX測序儀上進(jìn)行序列分析。

        2 結(jié)果

        2.1 先證者全外顯子組測序結(jié)果

        先證者全外顯子組測序產(chǎn)出原始數(shù)據(jù)為12.5G,目標(biāo)捕獲區(qū)平均測序深度為101.98×,≥1×測序深度下的覆蓋度為98.05%,≥4×為97.92%,≥10×為97.15%,≥20×為95.43%,數(shù)據(jù)量符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求。測序數(shù)據(jù)經(jīng)生物信息學(xué)分析,先證者在ATRX基因外顯子3檢測到NM_000489.3:c.161_162del(NP_000480.2:p.Ser54Ter)半合子變異。該變異在正常人數(shù)據(jù)庫1000 Genomes、ExAC、gnomAD均未見記錄,屬于罕見的變異;ClinVar、OMIM和HGMD數(shù)據(jù)庫未見致病性報(bào)道。

        2.2 家系成員驗(yàn)證

        采用Sanger測序驗(yàn)證家系成員中ATRX基因c.161_162del變異,結(jié)果顯示先證者父親為野生型,母親為雜合突變攜帶者,患病的哥哥與先證者相同,屬于半合子變異,姐姐和母親相同屬于雜合突變攜帶者(圖2,492頁),該遺傳方式符合X連鎖遺傳方式。

        2.3 變異致病性分析

        ATRX基因c.161_162del變異屬于缺失變異,ATRX基因的密碼子發(fā)生框移,導(dǎo)致編碼蛋白的第54位絲氨酸(Ser)變?yōu)榻K止密碼子(Ter),產(chǎn)生了沒有功能的截?cái)嗟鞍?PVS1);該變異在正常人數(shù)據(jù)庫均未見頻率報(bào)道(PM2);家系分析復(fù)合共分離的模式(PP1);患者表型與ATR-X綜合征高度符合(PP4)。根據(jù)ACMG變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南,ATRX基因c.161_162del變異屬于致病性變異(PVS1+PM2+PP1+PP4)。

        3 討論

        ATRX基因定位于Xq21.1,包含有36個(gè)外顯子,基因全長跨越300kb,編碼2492個(gè)氨基酸的ATRX蛋白,參與DNA重組、修復(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的等,是DNA解旋酶家族SWI/SNF的成員。ATRX蛋白包含多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域,N端有一個(gè)富含半胱氨酸的區(qū)域,該區(qū)域包括一個(gè)C2-C2和PHD樣鋅指結(jié)構(gòu)域,還有一個(gè)ATP酶/解旋酶結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域主要控制轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控和有絲分裂染色體分離。ATRX的中心部分包括一個(gè)預(yù)測的卷曲-卷曲結(jié)構(gòu)域,一個(gè)預(yù)測的核定位信號和21個(gè)谷氨酸殘基。ATRX蛋白的C末端是一個(gè)不同于SNF2蛋白的保守區(qū)和一個(gè)谷氨酸富集區(qū)[7]。ATRX蛋白在個(gè)體發(fā)育過程中發(fā)揮廣泛的生物學(xué)功能,在大腦、心臟及骨骼肌高表達(dá),ATRX基因突變導(dǎo)致蛋白功能異常,從而導(dǎo)致了患者出現(xiàn)復(fù)雜表型的X連鎖的智力低下綜合征。

        ClinVar數(shù)據(jù)庫已經(jīng)收錄的ATRX基因變異達(dá)到200余種,其中主要是錯(cuò)義突變,其中50%的突變C端的富含半胱氨酸的區(qū)域,30%位于SNF2樣解旋酶結(jié)構(gòu)域[7]。但是與ATP酶/解旋酶結(jié)構(gòu)域突變患者相比,具有PHD樣鋅指結(jié)構(gòu)域突變的患者表現(xiàn)出更嚴(yán)重的表型[8]。本研究對一個(gè)X連鎖智力低下家系進(jìn)行了全外顯子測序,發(fā)現(xiàn)先證者和患病的同胞哥哥存在ATRX基因NM_000489.3:c.161_162del,該變異位于PHD樣鋅指結(jié)構(gòu)域,產(chǎn)生了ATRX蛋白的截?cái)?,先證者和其哥哥表現(xiàn)典型的ATR-X綜合征表型,智力低下、特殊面容。Basehore等[9]報(bào)道了5個(gè)家系中存在無義突變c.109C>T(p.R37X),患者產(chǎn)生ATR-X綜合征的表型,但是總體表型比較溫和,盡管突變位點(diǎn)位于ATRX基因外顯子2,但是蛋白的功能似乎可以通過替代轉(zhuǎn)錄本的產(chǎn)生或者通過其他的分子機(jī)制部分挽救。

        ATR-X綜合征血液系統(tǒng)的表現(xiàn)存在可變表型,約75%的患兒表現(xiàn)出α-地中海貧血的特征[10]。先證者有輕度的小細(xì)胞低色素貧血,考慮伴有α-地中海貧血的表型,但其哥哥血常規(guī)檢查正常。有文獻(xiàn)報(bào)道Smith-Fineman-Myers綜合征的大多數(shù)兒童期表現(xiàn)會(huì)更加典型,成年后部分表型有可能消失[11],所以其哥哥并沒有表現(xiàn)出地貧的特征。

        由于ATR-X綜合征的表型特征在不同家系中存在不一致性,WES技術(shù)大大提高了診斷效率,明確基因突變。ATR-X綜合征屬于X連鎖遺傳方式,患者主要是男性,女性攜帶者由于X失活一般無表型。先證者母親是ATRX基因雜合變異攜帶者,再次生育有50%的概率將突變遺傳給男性后代。如家族中發(fā)現(xiàn)ATRX基因致病變異,對高危女性進(jìn)行攜帶者檢測,并進(jìn)行產(chǎn)前診斷或者植入前基因?qū)W檢測(PGT)[12],可以阻斷ATR-X綜合征患者的出生。

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