朱徐東，黃麗萍，朱娜，王松，姚偉，吳毅

1.江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是一種以記憶力減退、認(rèn)知功能障礙、行為能力異常為臨床特征的神經(jīng)退行性疾病。目前對(duì)阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制有一些假說(shuō)，包括基因突變學(xué)說(shuō)（β-淀粉樣蛋白異常沉積、Tau 蛋白過(guò)度磷酸化與ApoE 基因異常表達(dá)），神經(jīng)遞質(zhì)學(xué)說(shuō)，神經(jīng)炎癥學(xué)說(shuō)等［1］。中藥材中一些有效成分（如苷類、黃酮類、生物堿類、多糖類等）對(duì)防治AD 有一定的療效并且毒性小［2］。

黃精，屬于百合科黃精屬多年生草本植物的干燥根狀莖，是一種藥食同源性中藥，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、潤(rùn)肺、補(bǔ)脾、益腎等功效，也具有防治阿爾茨海默病、改善學(xué)習(xí)記憶能力、提高免疫力等藥理作用。黃精含有多糖、黃酮、木脂素、生物堿、皂苷等化學(xué)成分，這些成分使其具有多種藥理活性。有研究顯示黃精可通過(guò)增強(qiáng)α7nAChR 的表達(dá)［3］、減少海馬組織中Aβ 沉積［4］改善AD 模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法是基于系統(tǒng)生物學(xué)理論，對(duì)生物系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)分析。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)強(qiáng)調(diào)對(duì)信號(hào)通路的多途徑調(diào)節(jié)，與中藥多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的防治原理相符合。本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討黃精防治AD 的可能作用機(jī)制，以期能為黃精的深入研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 黃精化合物的獲取和篩選

通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)（中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析http://tcmspw.com/tcmsp.php）、查閱相關(guān)文獻(xiàn)［5-10］以及課題組從炆黃精中分離得到的24 個(gè)化合物(純度＞90%)［11-12］獲取黃精的化學(xué)成分。為了便于分析，將黃精中的化合物命名為HJ001、HJ002 等。通過(guò)Chemdraw 軟件將收集到的化合物轉(zhuǎn)化為sdf 文件格式，導(dǎo)入Swiss ADME（http://www.swissadme.ch/）平臺(tái)，對(duì)收集到的化合物進(jìn)行篩選。

1.2 活性成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

將活性成分的sdf 文件導(dǎo)入Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）平臺(tái)，設(shè)置屬性為“homo sapiens”，預(yù)測(cè)活性成分的潛在靶點(diǎn)，刪除重復(fù)值得到活性成分靶點(diǎn)。

1.3 AD 疾病相關(guān)基因的篩選

以“Alzheimer's disease”為關(guān)鍵詞，從Genecards（http://www.genecards.org/）、OMIM（http://www.omim.org/）、Drugbank（http://go.drugbank.com）三個(gè)疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)搜集AD 有關(guān)的基因，合并三個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫(kù)靶點(diǎn)后，刪除重復(fù)值得到AD 相關(guān)靶點(diǎn)。

1.4 黃精防治AD 成分-靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將篩選得到的活性成分靶點(diǎn)和AD 疾病靶點(diǎn)利用R 語(yǔ)言取交集并繪制韋恩圖，將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入到STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇物種為“Homo sapiens”（人源）、最小相互作用閾值（medium confidence）設(shè)為“0.4”，得到蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。運(yùn)用Cytoscape 3.7.0軟件分析PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩裕⒑Y選其中的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.5 GO 功能與KEGG 通路的富集分析

將黃精防治AD 的關(guān)鍵靶點(diǎn)錄入Metascape 平臺(tái)（http://metascape.org/），輸入物種（Input as species）和分析物種（Analysis as species）均選擇 “H.sapiens”，P＜0.01，對(duì)黃精防治AD 關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO 注釋分析和KEGG 通路富集分析。

1.6 黃精防治AD 成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將篩選所得有效成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)以及靶點(diǎn)所屬信號(hào)通路導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0 軟件，構(gòu)建黃精防治AD 成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)。

1.7 分子對(duì)接

運(yùn)用Cytoscape3.7.0 軟件對(duì)篩選的關(guān)鍵靶點(diǎn)與活性成分進(jìn)行分子對(duì)接，同時(shí)以經(jīng)FDA 認(rèn)證的臨床防治AD 的藥物多奈哌齊（Donepezil）、加蘭他敏（Galanthamine）、卡巴拉?。≧ivastigmine）、美金剛（Memantine）為陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行分子對(duì)接，在Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.uniprot.org)中搜索關(guān)鍵靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的Entry，在PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.rcsb.org）中下載靶點(diǎn)的3D 結(jié)構(gòu)。用Discovery Studio 2016 軟件對(duì)其進(jìn)行去水、加氫、分配電荷等處理，運(yùn)用LibDock 模塊與活性化合物及陽(yáng)性藥進(jìn)行分子對(duì)接。

2 結(jié)果

2.1 黃精活性成分

通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)、相關(guān)文獻(xiàn)調(diào)研以及實(shí)驗(yàn)室獲取對(duì)黃精的化學(xué)成分進(jìn)行收集，共得到105 個(gè)化合物。利用Swiss ADME 平臺(tái)對(duì)所收集到的成分進(jìn)行類藥性篩選后，共有54 個(gè)符合條件的化合物，見(jiàn)表1。

表1 黃精活性成分

2.2 靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

基于Swiss Target Prediction 平臺(tái)預(yù)測(cè)活性成分的潛在靶點(diǎn)，共得到4 463 個(gè)基因靶點(diǎn)，根據(jù)Probability＞0.12 進(jìn)行篩選并刪除重復(fù)值后共得到152個(gè)潛在活性成分靶點(diǎn)。利用OMOM、Drugbank 以及GeneCards 疾病數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)“Alzheimer's disease”相關(guān)基因進(jìn)行檢索，合并后刪去重復(fù)值共得到1 597 個(gè)潛在疾病靶點(diǎn)。

2.3 黃精防治AD 成分-靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將潛在黃精活性成分靶點(diǎn)與AD 疾病靶點(diǎn)取交集，并通過(guò)R 語(yǔ)言繪制韋恩圖，得到黃精成分-AD 共同靶點(diǎn)66 個(gè)，見(jiàn)圖1。將共同靶點(diǎn)在String 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)分析，最小相互作用閾值設(shè)為“0.4”，形成376 個(gè)蛋白互作關(guān)系對(duì)，見(jiàn)圖2。利用Cytoscape3.7.0 對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，由于網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)“degree”中位數(shù)為9，故以“degree”大于等于2 倍中位數(shù)的值（degree ≥18）為條件進(jìn)行篩選，得到14 個(gè)候選靶點(diǎn)；然后對(duì)其進(jìn)行degree、betweenness、closeness 計(jì)算分析，再以大于等于中位數(shù)的值進(jìn)行篩選（degree ≥22、betweenness ≥2.07、closeness ≥0.867），得 到5 個(gè)關(guān)鍵 的防治AD 的靶點(diǎn)，即SRC、PTGS2、MMP9、EGFR、STAT3，見(jiàn)圖3。

圖1 黃精成分-AD靶點(diǎn)韋恩圖

圖2 黃精成分-AD靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

圖3 黃精防治AD成分的PPI網(wǎng)絡(luò)篩選

2.4 基因功能與通路富集分析

利用Matescape 數(shù)據(jù)平臺(tái)對(duì)66 個(gè)黃精防治AD的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO 注釋分析和KEGG 通路分析，利用GraphPad Prism 9.0.0 繪制熱圖，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 黃精中有效成分對(duì)AD潛在靶點(diǎn)的富集分析

GO 注釋分析包括生物過(guò)程（Biological Process，BP)，細(xì)胞組 成（Cellular Component，CC）和 分子功能（Molecular Function，MF）三個(gè)部分。其中生物過(guò)程排名靠前的有炎癥反應(yīng)（inflammatory response）、對(duì)無(wú)機(jī)物的反應(yīng)（response to inorganic substance）、活性氧 代謝過(guò) 程（reactive oxygen species metabolic process）、激酶活性的正調(diào)控（positive regulation of kinase activity）；細(xì)胞組 成中靠前的有受體復(fù)合物（receptor complex）、膜閥（membrane raft）、膜 側(cè)（side of membrane）、軸突（axon）；分子功能中靠前的有氧化酶活性（oxidoreductase activity）、蛋白質(zhì)激酶活性（protein kinase activity）、核受體活性（nuclear receptor activity）、電子傳輸活動(dòng)（electron transfer activity）。KEGG 通路富集分析中，排名靠前的有癌癥信號(hào)通路（Pathways in cancer）、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑抵抗（EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance）、內(nèi)分泌抵抗（Endocrine resistance）。

2.5 黃精防治AD“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將黃精成分、作用靶點(diǎn)和KEGG 通路信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0 構(gòu)圖軟件，構(gòu)建黃精防治AD“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖5。該網(wǎng)絡(luò)中包括108 個(gè)節(jié)點(diǎn)，372 條邊。108 個(gè)節(jié)點(diǎn)中20 個(gè)節(jié)點(diǎn)為黃精防治AD 涉及的活性成分，66 個(gè)節(jié)點(diǎn)為黃精防治AD 作用靶點(diǎn)，20 個(gè)節(jié)點(diǎn)為AD 靶點(diǎn)參與的信號(hào)通路。該網(wǎng)絡(luò)說(shuō)明黃精防治AD 作用可能具有多成分、多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)作用的特點(diǎn)。

圖5 黃精防治AD成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 分子對(duì)接驗(yàn)證結(jié)果

將PPI 網(wǎng)絡(luò)中篩選的5 個(gè)靶點(diǎn)作為黃精抗AD的關(guān)鍵靶點(diǎn)，與黃精抗AD 的20 個(gè)活性成分以及臨床防治AD 的藥物多奈哌齊（Donepezil）、加蘭他敏（Galanthamine）、卡巴拉汀（Rivastigmine）、美金剛（Memantine）進(jìn)行分子對(duì)接，并以對(duì)接打分值構(gòu)建熱圖，見(jiàn)圖6。其中，陽(yáng)性藥中與5 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)對(duì)接打分最高的是多奈哌齊，最低的是美金剛；并且20 個(gè)化合物中，與SRC（PDBID:1Y57）對(duì)接打分高于多奈哌齊的有10 個(gè)化合物，高于加蘭他敏的有19 個(gè)化合物，高于卡巴拉汀的有20 個(gè)化合物；與EGFR（PDBID：1Z9I）對(duì)接打分高于多奈哌齊的有4 個(gè)化合物，高于加蘭他敏的有17 個(gè)化合物，高于卡巴拉汀的有18 個(gè)，20 個(gè)化合物的對(duì)接打分均高于美金剛；與PTGS2（PDBID:5F19）對(duì)接打分高于多奈哌齊的有2 個(gè)化合物，高于加蘭他敏和卡巴拉汀的均有17個(gè)化合物，高于美金剛的有20 個(gè)化合物；與STAT3（PDBID6NJS）對(duì)接打分高于加蘭他敏的有14 個(gè)化合物，高于卡巴拉汀的有17 個(gè)化合物，高于美金剛的有20 個(gè)化合物；與MMP9（PDBID:6ESM）的對(duì)接打分高于多奈哌齊的有5 個(gè)化合物，高于加蘭他敏的有11 個(gè)化合物，高于卡巴拉汀的有15 個(gè)化合物，高于美金剛的有19 個(gè)化合物。結(jié)果表明，多數(shù)黃精活性成分與網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵靶點(diǎn)具有較好的結(jié)合能力。

圖6 黃精活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)對(duì)接得分熱圖

3 討論

目前，防治AD 的藥物多作用于單靶點(diǎn)，只能改善中輕度AD 的癥狀，并不能預(yù)防、終止和逆轉(zhuǎn)AD的進(jìn)程的發(fā)展。中藥具有多靶點(diǎn)、多途徑作用的特點(diǎn)，對(duì)防治AD 這種復(fù)雜性疾病有其獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)，具有極大的潛力。已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明黃精多糖可以改善APP 轉(zhuǎn)基因小鼠海馬CA1 區(qū)突觸界面［13］，減少海馬神經(jīng)元的凋亡［14］，可顯著改善AD 大鼠海馬的病理改變［15］。但是，其作用機(jī)制尚不明確。因此，本研究基于多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的研究思路，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，分析黃精防治AD 的靶點(diǎn)，構(gòu)建黃精防治AD 靶點(diǎn)的交互作用網(wǎng)絡(luò)，富集防治AD 相關(guān)的生物過(guò)程及信號(hào)通路，闡述黃精防治AD 的作用機(jī)制，為黃精的臨床應(yīng)用以及推廣提供科學(xué)依據(jù)。

對(duì)黃精防治AD 的作用網(wǎng)絡(luò)與潛在機(jī)制的研究結(jié)果表明：黃精中可能有20 個(gè)成分對(duì)防治AD 有顯著效果，有研究證明apigenin 可以通過(guò)調(diào)節(jié)氧化還原失衡、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡等機(jī)制發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［16］；異甘草素（isoliquiritigenin）可以通過(guò)促進(jìn)或維持抗氧化能力和抑制神經(jīng)炎癥來(lái)保護(hù)脂多糖誘導(dǎo)的認(rèn)知障礙和神經(jīng)元損傷［17］。此外，該文收集到66 個(gè)黃精防治AD 的靶點(diǎn)，表明黃精防治AD 是通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)作用的結(jié)果。

從構(gòu)建的PPI 網(wǎng)絡(luò)可知，黃精與AD 靶點(diǎn)存在密切作用關(guān)系，核心靶點(diǎn)有5 個(gè)，主要為EGFR、SRC、PTGS2、STAT3、MMP9。研究表明，PTGS2 基因也稱為環(huán)加氧酶2 基因（COX2），在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎性細(xì)胞中被普遍表達(dá),可以通過(guò)抑制神經(jīng)元凋亡和炎癥，同時(shí)促進(jìn)AD 中的神經(jīng)元生長(zhǎng)［18］。有研究顯示，在AD 小鼠中STAT3 的表達(dá)會(huì)增加，可能與AD 的慢性炎性損傷相關(guān)，在AD 的發(fā)病過(guò)程中，STAT3 的活化可介導(dǎo)保護(hù)反應(yīng)［19］。那么，黃精有可能是通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)，進(jìn)而達(dá)到防治AD 的作用。

進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行GO 分析和KEGG 通路分析，GO 富集分析顯示，黃精防治AD 主要是通過(guò)炎癥反應(yīng)、對(duì)無(wú)機(jī)物的反應(yīng)、活性氧代謝過(guò)程、激酶活性的正調(diào)控以及對(duì)Aβ 的反應(yīng)等生物過(guò)程發(fā)揮作用。KEGG 通路富集結(jié)果顯示，癌癥信號(hào)通路、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑抵抗、內(nèi)分泌抵抗以及5-羥色胺能突觸等是黃精防治AD 的主要通路。其中，排名靠前的5-羥色胺能突觸、NF-κB 信號(hào)通路與神經(jīng)病變類疾病發(fā)病機(jī)制息息相關(guān)。研究表明，5-HT 受體5-HT6 活化時(shí)可增強(qiáng)抑制性的GABA 的功能產(chǎn)生，并因此降低膽堿能、谷氨酸能神經(jīng)元的活性，從而改善認(rèn)知障礙功能［20］。AD 患者腦神經(jīng)細(xì)胞變性與NF-κB 信號(hào)通路的活化有關(guān)。NF-κB信號(hào)通路可激活淀粉樣蛋白通路以促進(jìn)Aβ 的形成，同時(shí)也是炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)方式［21］，這也與GO 分析中的炎癥反應(yīng)、對(duì)Aβ 的反應(yīng)以及對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)等生物過(guò)程相符合。同時(shí)，黃酮類成分可以通過(guò)抑制氧化應(yīng)激及清除自由基、減少Aβ 形成、抑制炎癥因子表達(dá)，從而有效阻斷AD 的疾病進(jìn)展［22］。

綜上所述，本研究系統(tǒng)地分析了黃精防治AD的作用機(jī)制，揭示了黃精防治AD 的活性成分、作用網(wǎng)絡(luò)和潛在作用機(jī)制，證明了黃精防治AD 具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用的特點(diǎn)。但是對(duì)于黃精防治AD 的具體作用靶點(diǎn)及通路仍需進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，本課題組后續(xù)將對(duì)黃精作用于AD 大鼠后的血液、腦組織進(jìn)行分析，以研究黃精防治AD的活性成分、作用靶點(diǎn)及通路。