周一鳴，馬思佳，蔣晴怡，周小理,2,*，李云龍

（1.上海應用技術大學香料香精技術與工程學院，上海 201418；2.上海應用技術大學 美麗中國與生態(tài)文明研究院上海高校智庫，上海 201418；3.山西農業(yè)大學 山西功能食品研究院，山西 太原 030031）

隨著人們生活質量的改善和醫(yī)療水平的提高，全球平均健康預期壽命穩(wěn)定增長。然而，糖尿病等代謝類疾病發(fā)生率出現驚人的增長，已成為許多國家的重大公共衛(wèi)生問題。目前，糖尿病是僅次于腫瘤和心腦血管病威脅人類健康的第3大疾病。根據國際糖尿病聯合會的數據表明，截至2019年全世界患有糖尿病的成年人總數已達4.63億，中國糖尿病患者人數已達1.1億。糖尿病的主要危害在于糖尿病并發(fā)癥導致的死亡。管理糖尿病的主要策略是減少糖的攝入，抑制碳水化合物的水解，主要通過抑制碳水化合物水解過程中起關鍵作用的兩種淀粉消化酶α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶實現。

目前，阿卡波糖、二甲雙胍和米格列醇等藥物已經在臨床被用于抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性，以治療II型糖尿病。但是使用這些藥物往往會對腸胃產生很大的副作用，包括惡心、脹氣、腹瀉、腹痛和腸胃氣脹，其主要原因是未被消化的碳水化合物在腸道菌群的作用下異常發(fā)酵而引起。近年來，隨著人們越來越重視天然和健康食品，一些天然來源的植物或提取物已被研究發(fā)現具有抑制消化酶的作用，并且毒性較低，尤其是聯合使用兩種或兩種以上天然化合物可以起到協同治療的效果，減少劑量和毒性，同時能夠減少耐藥性的誘導。Wu Xiaqing等的研究發(fā)現表兒茶素沒食子酸酯與阿卡波糖或表沒食子兒茶素沒食子酸酯聯合對α-淀粉酶表現為拮抗作用，對α-葡萄糖苷酶則表現為協同作用。

苦蕎因其高營養(yǎng)和藥用價值已顯示出良好的市場潛力。研究發(fā)現，苦蕎富含淀粉，尤其是抗性淀粉，可以作為糖尿病患者的理想食物。同時，苦蕎中含有較豐富的黃酮類化合物，包括蘆丁、槲皮素、山柰酚等成分，是降血糖的主要功能因子，其中蘆丁是苦蕎黃酮的主要成分，占黃酮類化合物的70%以上。已有研究指出，苦蕎黃酮的濃度與抑制淀粉消化酶的效率呈正相關。同時，研究發(fā)現苦蕎總黃酮對淀粉消化酶的抑制效果強于苦蕎水溶性提取物和苦蕎醇溶性提取物，說明苦蕎黃酮的降血糖功效往往是多種成分共同發(fā)揮的作用。

苦蕎中黃酮對淀粉消化酶抑制作用的研究往往局限于單獨抑制，而缺乏對聯合抑制作用的探討，因此本實驗通過模擬苦蕎淀粉體外消化體系，探討苦蕎中的主要黃酮（蘆丁和槲皮素）對淀粉消化酶的單獨抑制效果和機制，以及同時存在時對淀粉消化酶活性的抑制作用，為苦蕎產品的深加工提供一定理論基礎，以期為調控苦蕎的功能性，最大化苦蕎的降血糖效果指引方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘆?。兌取?8%）、槲皮素（純度≥98%）、阿卡波糖、對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（純度≥98%）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；豬胰腺α-淀粉酶（酶活力2 000 U/g） 美國Adamas-beta公司；α-葡萄糖苷酶（酶活力100 000 U/mL） 上海源葉生物技術有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉（均為分析純） 國藥集團（上海）化學試劑有限公司；苦蕎淀粉由實驗室自制。

1.2 儀器與設備

M200 PRO酶標儀 奧地利帝肯公司；RF-5301 PC熒光分光光度計 日本島津株式會社；PURELAB Classic超純水機 英國ELGA公司；SHZ-B水浴恒溫振動搖床中國上海博訊公司。

1.3 方法

1.3.1 蘆丁和槲皮素對淀粉消化酶的單獨抑制實驗

對α-淀粉酶的抑制實驗參照王靜等的方法。將60 μL不同質量濃度（0～1 mg/mL）蘆丁或槲皮素和60 μL 2 U/mL α-淀粉酶混合，37 ℃預孵育10 min。添加2.5 mL 20 mg/mL Tris緩沖鹽溶液、0.4 mL 0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液（pH 6.9）和0.98 mL超純水，37 ℃、150 r/min恒溫水浴搖床中反應3 min。最后加入2 mL 3,5-二硝基水楊酸，在沸水浴中加熱5 min后終止反應。反應溶液冷卻至室溫后，稀釋至25 mL，在540 nm處用酶標儀測定吸光度。

對α-葡萄糖苷酶的抑制實驗參照Zhao Chunchao等的方法。將100 μL不同質量濃度蘆丁或槲皮素和100 μL 2 U/mL α-淀粉酶混合，37 ℃預孵育10 min。添加250 μL 3 mmol/L對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷、1 mL磷酸鈉緩沖液和0.98 mL超純水，37 ℃、150 r/min恒溫水浴搖床中反應10 min。最后，加入NaCO溶液（2 mL、1 mol/L）停止反應，在405 nm處用酶標儀測定吸光度。

設置僅添加酶為空白組，抑制劑和酶都不添加為空白對照組，添加抑制劑和酶為樣品組，僅添加抑制劑為樣品對照組。以阿卡波糖作為陽性對照。按下式計算蘆丁和槲皮素對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的抑制率：

1.3.2 蘆丁和槲皮素對淀粉消化酶的抑制動力學實驗

參照陳雨涔等的方法，固定底物質量濃度（2 g/mL、2.5 mL），測定不同質量濃度蘆?。?、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL）和槲皮素（0、0.1、0.3、0.5、0.7 mg/mL）存在時，對應體系的反應速率隨α-淀粉酶活力的變化，判斷抑制劑的可逆性。固定底物濃度（3 mmol/L、250 μL），測定不同質量濃度蘆丁（0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL）和槲皮素（0、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL）存在時，對應體系的反應速率隨α-葡萄糖苷酶活力的變化，判斷抑制劑的可逆性。

固定α-淀粉酶（2 U/mL、60 μL）活力，測定不同質量濃度蘆丁（0、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL）和槲皮素（0、0.1、0.3、0.5、0.7 mg/mL）存在時，對應體系的反應速率隨底物質量濃度的變化。固定α-葡萄糖苷酶（2 U/mL、100 μL）活力，測定不同質量濃度蘆丁（0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL）和槲皮素（0、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL）存在時，對應體系的反應速率隨底物質量濃度的變化。

進一步以底物濃度的倒數為橫坐標，反應初速率的倒數為縱坐標，繪制Lineweaver-Burk曲線圖，根據所得直線的相交情況，確定蘆丁和槲皮素對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制類型。

式（2）～（5）中：v為存在或不存在蘆丁和槲皮素時的酶促反應速率；v為最大酶反應速率；c為苦蕎淀粉和對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷濃度；c為蘆丁和槲皮素質量濃度；K為米氏常數；K為抑制劑與酶結合的平衡常數；K為抑制劑與酶-底物復合物結合的平衡常數。

1.3.3 淀粉消化酶的熒光猝滅分析

參考梁宗瑤等的方法，在3 種溫度（298、304、310 K）下用熒光分光光度計分別測定α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的熒光變化，加入不同濃度的蘆丁或槲皮素（0～64 μmol/L）孵育5 min后，繼續(xù)進行測量。激發(fā)波長280 nm；發(fā)射波長300～500 nm；激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均5.0 nm。通過Stern-Vlomer方程可以判斷蘆丁和槲皮素對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的熒光猝滅機理，如下：

式（6）～（7）中：F和F分別為α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶在不存在或存在蘆丁和槲皮素時的熒光強度；c為蘆丁和槲皮素的濃度；τ為熒光團的平均熒光壽命；K、K和K分別為猝滅速率常數、猝滅常數和結合常數；n為結合位點數。

蘆丁和槲皮素與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的主要作用力類型可以通過Van’t-Hoff方程進行判斷，如下：

式（8）～（9）中：T為溫度；R為氣體常數；ΔG為自由能變化；ΔH為焓變；ΔS為熵變。

1.3.4 蘆丁和槲皮素對淀粉消化酶的聯合抑制實驗

通過蘆丁和槲皮素單獨抑制時的抑制能力曲線計算出對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的半抑制濃度（IC）值。在此基礎上結合苦蕎加工過程中蘆丁和槲皮素的變化范圍，將蘆丁與槲皮素按照不同濃度比混合，參考1.3.1節(jié)中酶活性測定方法，進行聯合抑制實驗，計算蘆丁與槲皮素聯合對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的抑制率。為了評價蘆丁和槲皮素聯合使用的抑制作用，判斷聯合作用的效果，利用等效線圖解法和Chou-Talalay藥物聯合指數（combination index，CI）進行評價。CI計算公式如下：

式中：D、D分別為組合系統中產生一定抑制水平蘆丁和槲皮素的劑量；Dx、Dx分別為單獨添加的導致相同抑制水平蘆丁和槲皮素的劑量。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 蘆丁和槲皮素對淀粉消化酶的單獨抑制能力

如圖1所示，蘆丁和槲皮素對淀粉消化酶都表現出劑量依賴性的抑制作用。其中，阿卡波糖作為陽性對照的酶抑制效果最強，對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的IC值分別為0.047 mg/mL和0.03 mg/mL。但阿卡波糖對淀粉消化酶的過度抑制可能會導致結腸內未被消化的淀粉發(fā)生異常發(fā)酵，從而產生胃腸道功能紊亂；而蘆丁和槲皮素相對溫和的抑制活性，能有效緩解胃腸道不適。由圖1A可知，蘆丁和槲皮素對α-淀粉酶的IC值分別為0.36 mg/mL和0.22 mg/mL；由圖1B可知，蘆丁和槲皮素對α-葡萄糖苷酶的IC值分別為1.3 mg/mL和0.362 mg/mL。槲皮素比蘆丁具有更強的抑制能力，是由于槲皮素C環(huán)上的羥基被一個糖基取代變?yōu)樘J丁，羥自由基轉變?yōu)樘腔赡軙l(fā)生空間位阻，削弱蘆丁與酶的結合作用，從而降低蘆丁的抑制能力。

圖1 蘆丁和槲皮素對α-淀粉酶（A）和α-葡萄糖苷酶（B）的抑制曲線Fig. 1 Inhibitory effects of rutin and quercetin on α-amylase (A) and α-glucosidase (B)

此外，由圖1可知，蘆丁和槲皮素對α-淀粉酶的抑制效果更強，分別是對α-葡萄糖苷酶抑制能力的3.6 倍和1.6 倍，這可能是由于蘆丁和槲皮素B環(huán)上的羥基有利于與α-淀粉酶的活性位點結合。

2.2 蘆丁和槲皮素對淀粉消化酶的抑制動力學分析

由圖2可知，不同質量濃度的蘆丁和槲皮素都能得到一條通過原點的直線，且斜率隨著質量濃度的增加而減小。由此可知，蘆丁和槲皮素對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶都屬于可逆性抑制作用。

圖2 蘆丁和槲皮素對淀粉消化酶的抑制可逆性Fig. 2 Reversible inhibitory effects of rutin and quercetin against starch-digesting enzymes

如圖3A和C所示，蘆丁和槲皮素對α-淀粉酶抑制的雙倒數曲線，所有直線與縱軸相交，隨著蘆丁和槲皮素質量濃度的增加，K值不斷增加而v值保持不變。因此蘆丁和槲皮素對α-淀粉酶屬于競爭性抑制，通過與α-淀粉酶的活性中心結合，占據底物的結合位點，從而抑制底物的水解。根據競爭性抑制公式可以計算出蘆丁和槲皮素對α-淀粉酶的K值分別為806.29、793.92 μg/mL，說明槲皮素與α-淀粉酶的結合更牢固，具有更強的抑制效果，與2.1節(jié)中槲皮素對α-淀粉酶的抑制能力強于蘆丁的實驗結果一致。

如圖3B所示，所有直線都相交于第3象限，K值和v同時減小，表明蘆丁對α-葡萄糖苷酶屬于非競爭性和反競爭性的混合型抑制，其中，K值為9.61 μmol/L，K值為3.38 μmol/L，說明蘆丁更傾向于與酶-底物復合物結合。如圖3D所示，所有直線都相交于第2象限，K值逐漸升高，同時v逐漸降低，表明槲皮素對α-葡萄糖苷酶為競爭性和非競爭性的混合型抑制，K值為3.72 μmol/L，K值為9.74 μmol/L，說明槲皮素更傾向于與游離的α-葡萄糖苷酶結合。

圖3 蘆丁和槲皮素對淀粉消化酶的雙倒數圖Fig. 3 Double-reciprocal plots of rutin and quercetin against starch-digesting enzymes

2.3 蘆丁和槲皮素對淀粉消化酶的熒光光譜分析

由圖4可知，當測試溫度298 K、激發(fā)波長280 nm時，α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均在340 nm波長附近有最大發(fā)射峰（λ）。當反應體系中加入不同濃度的蘆丁和槲皮素，兩種酶的熒光強度都展現出劑量依賴性的猝滅，且λ發(fā)生不同程度的移動。如圖4A和B所示，隨著蘆丁濃度的增加，α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的λ分別從340 nm移動到335 nm和332 nm；如圖4C和D所示，隨著槲皮素濃度的增加，α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的λ分別從342 nm和340 nm移動至338 nm。這種現象表明蘆丁和槲皮素與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶之間存在相互作用，導致氨基酸殘基逐漸暴露在水溶液中，所處環(huán)境極性降低。

圖4 蘆丁和槲皮素與淀粉消化酶熒光光譜圖Fig. 4 Fluorescence spectra of rutin and quercetin against starch-digesting enzymes

2.4 蘆丁和槲皮素對淀粉消化酶的結合性質分析

由圖5可知，蘆丁和槲皮素對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的Stern-Volmer曲線均具有良好的線性關系。由表1可知，隨著溫度的升高，蘆丁對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的K值分別降低了2.58×10L/mol和1.97×10L/mol，槲皮素對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的K值分別降低了1.60×10L/mol和2.12×10L/mol；K值均隨著溫度的升高而降低，且K值為10和10數量級，遠大于生物大分子的最大散射碰撞猝滅常數2.0×10L/（mol·s），說明蘆丁和槲皮素與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均通過形成復合物的方式發(fā)生靜態(tài)猝滅。

圖5 蘆丁和槲皮素對淀粉消化酶的Stern-Volmer曲線Fig. 5 Stern-Volmer curves of rutin and quercetin against starch-digesting enzymes

由圖6可知，蘆丁和槲皮素對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶相互作用的雙對數曲線圖均具有良好的線性關系，利用擬合直線的斜率和截距，并結合靜態(tài)猝滅公式，由此可以計算得到K值和n。如表1所示，槲皮素對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的K值均高于蘆丁，說明槲皮素與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的結合力更強；蘆丁和槲皮素對α-淀粉酶的K值高于α-葡萄糖苷酶，說明蘆丁和槲皮素對α-淀粉酶具有更強的結合力。此外，n值近似于1，表明蘆丁和槲皮素在α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶上只存在一個（或一類）結合位點。

圖6 蘆丁和槲皮素與淀粉消化酶相互作用的雙對數曲線圖Fig. 6 Double logarithm plots of rutin and quercetin with starch-digesting enzymes

通過Van’t-Hoff方程計算出ΔH、ΔS及ΔG的變化，可以判斷蘆丁和槲皮素與淀粉消化酶之間的相互作用力。如表1所示，ΔG均為負值，表明蘆丁和槲皮素與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的結合是一種自發(fā)的過程。蘆丁和槲皮素與α-淀粉酶反應時，ΔH均為負值，ΔS均為正值，表明這種結合是熵驅動的放熱過程，疏水相互作用力和氫鍵是蘆丁和槲皮素與α-淀粉酶復合物穩(wěn)定的主要驅動力。蘆丁和槲皮素與α-葡萄糖苷酶反應時，ΔH和ΔS均為負值，表明主要驅動力是氫鍵。

表1 蘆丁或槲皮素與α-淀粉酶或α-葡萄糖苷酶相互作用及熱力學參數Table 1 Thermodynamic parameters for interaction between rutin or quercetin and α-amylase or α-glucosidase

2.5 蘆丁和槲皮素對淀粉消化酶的聯合抑制作用

由2.1節(jié)的結果（圖1）可知，蘆丁和槲皮素對于α-淀粉酶的IC比為1.64∶1，蘆丁和槲皮素對α-葡萄糖苷酶的IC比為3.6∶1。已有研究發(fā)現苦蕎中蘆丁含量是槲皮素的7 倍，但在加工存儲過程中約80%的蘆丁會水解成槲皮素，所以槲皮素含量通常是蘆丁的5 倍。因此，分別以7∶1、1.64∶1和1.64∶8.2，作為蘆丁和槲皮素聯合使用抑制α-淀粉酶的濃度比，以7∶1、3.6∶1和3.6∶18作為蘆丁和槲皮素聯合使用抑制α-葡萄糖苷酶的濃度比。

圖7 蘆丁和槲皮素聯合使用對α-淀粉酶（A）和α-葡萄糖苷酶（B）的抑制能力Fig. 7 Combined inhibition of rutin and quercetin on α-amylase (A)and α-glucosidase (B)

如圖7所示，蘆丁和槲皮素聯合使用對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均具有抑制效果。在相同質量濃度下，蘆丁和槲皮素聯合作用優(yōu)于單獨抑制的效果，且抑制率隨著二者聯合質量濃度的增加而逐漸升高。二者濃度比為1.64∶8.2時對α-淀粉酶抑制能力最強，IC值為0.055 mg/mL；二者濃度比為3.6∶18時對α-葡萄糖苷酶抑制能力最強，IC值為0.091 mg/mL。結果表明，蘆丁和槲皮素聯合使用時均能夠提高對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制效果，且槲皮素較多時，抑制作用更強。

2.6 蘆丁和槲皮素對淀粉消化酶聯合抑制作用的評價

圖8 蘆丁和槲皮素聯合抑制α-淀粉酶（A）和α-葡萄糖苷酶（B）的IC50等效線圖Fig. 8 IC50 isobolograms for inhibition of α-amylase (A) and α-glucosidase (B) by combined use of rutin and quercetin

由圖8A可知，3 種濃度比下的劑量對均位于等效線的下方，CI值分別為0.20、0.22和0.24，均小于1，表明蘆丁和槲皮素聯合使用對α-淀粉酶表現出協同抑制的作用。其中，蘆丁和槲皮素濃度比為7∶1時CI值最小，具有更好地協同抑制效果，這可能是由于α-淀粉酶上有多個活性位點，蘆丁和槲皮素能夠與α-淀粉酶的不同氨基酸殘基發(fā)生特異性結合，聯合使用時優(yōu)勢互補，增加了黃酮-酶復合物的穩(wěn)定性。

由圖8B可知，3 種濃度比下的劑量對均位于等效線的下方，CI值分別為0.41、0.36和0.22，均小于1。表明蘆丁和槲皮素聯合使用時對α-葡萄糖苷酶表現出協同抑制的作用。其中，蘆丁和槲皮素濃度比為3.6∶18時CI值最小，具有更好的協同抑制效果，這可能是由于蘆丁和槲皮素都能夠非競爭性抑制α-葡萄糖苷酶活性，與α-葡萄糖苷酶的非競爭性位點結合，增強了協同抑制作用。此外，由2.4節(jié)的結果可知，槲皮素與α-葡萄糖苷酶的結合力更強，因此槲皮素占比較多時協同抑制效果更好。

3 結 論

通過探究苦蕎中黃酮的主要成分蘆丁和槲皮素單獨使用和聯合使用的抑制效果，結合抑制動力學、熒光光譜法，更加精準和全面地分析苦蕎中蘆丁和槲皮素對淀粉消化酶的影響。主要研究結果表明，蘆丁和槲皮素對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶都具有劑量依賴性的抑制，且對兩種淀粉消化酶的抑制效果皆為槲皮素優(yōu)于蘆丁。蘆丁和槲皮素對α-淀粉酶的IC值分別為0.36 mg/mL和0.22 mg/mL，對α-葡萄糖苷酶的IC值分別為1.30 mg/mL和0.362 mg/mL。二者對α-淀粉酶的抑制效果強于α-葡萄糖苷酶。進一步判斷抑制機理可知，蘆丁和槲皮素與α-淀粉酶以疏水相互作用力和氫鍵結合，競爭性抑制酶的活性，且槲皮素與α-淀粉酶的結合能力更強，能起到更好的抑制效果；對α-葡萄糖苷酶均為通過氫鍵結合的混合型抑制。同時，二者與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的結合只存在一個（或一類）作用位點。將蘆丁和槲皮素按照不同比例聯合使用可以增強兩者單用時的抑制能力，并且對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶都具有協同抑制的作用，當二者濃度比為7∶1和3.6∶18時，對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的CI值分別達到0.20和0.22，具有最佳的協同抑制效果。