張翠忠，張貞發(fā)，向 剛，黃 青，連 歡，劉鳳平，黃 唯，周樹年，李許明，李福燕

（廣西民族師范學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，光電化學(xué)傳感與區(qū)域環(huán)境分析實驗室，廣西 崇左 532200）

過氧化氫（HO）作為去色劑等常添加在各種快消食品中，當(dāng)濃度超出0.7 μmol/L，可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)和DNA的嚴(yán)重?fù)p傷，進而誘發(fā)慢性腎功能衰竭、急性腎損傷等疾病。因此，開發(fā)新方法檢測食品中HO含量對食品安全具有重大意義。目前，用于HO檢測的方法包括熒光法、化學(xué)發(fā)光法、滴定法、比色法、表面增強拉曼光譜和電化學(xué)法等。其中，電化學(xué)傳感器技術(shù)因其靈敏度高、成本低、響應(yīng)速度快等特點已被廣泛關(guān)注。然而，傳感器的靈敏度、選擇性和穩(wěn)定性等性能與電極表面修飾材料息息相關(guān)。

銀納米粒子（AgNPs）造價成本相對較低、毒性低，對HO具有好的催化特質(zhì)。然而，貴金屬粒子受表面電荷影響易團聚，大量結(jié)果顯示粒子粒徑降低到納米尺度，催化劑才能發(fā)揮其催化能力。通常采用支撐材料(碳材料、金屬氧化物、金屬有機框架材料等)負(fù)載貴金屬克服納米粒子團聚現(xiàn)象。

石墨烯氣凝膠（graphene aerogels，GAs）具有多孔結(jié)構(gòu)。制備過程中，氧化石墨烯（graphene oxide，GO）的部分含氧官能團被還原，冷凍干燥時，GO之間的氫鍵被削弱，致使機械強度弱化。Zhong Jing和Wan Wenchao等為了提高GAs結(jié)構(gòu)強度，引入機械強度良好的多壁碳納米管（multi walled carbon nanotube，MWCNT），該MWCNT-GA復(fù)合材料可使GAs在外力誘導(dǎo)的變形下保持結(jié)構(gòu)完整性。最近，Ryu等在此基礎(chǔ)上引入多巴胺（dopamine，DA）作為交聯(lián)劑加固二者化學(xué)鍵合。DA在弱堿環(huán)境中可以自發(fā)地氧化、自聚合在材料表面，形成富含兒茶酚和氨基官能團的聚多巴胺（polydopamine，PDA）層。PDA通過自身攜帶的氨基和羥基將羧基化的MWCNT和GO縮合形成混合氣凝膠（mixed aerogels，MAs），MAs形貌類似“卷心菜狀”，其微觀結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為3維（3-dimensional，3D）分層多孔結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)具有良好的機械強度，不易坍塌，穩(wěn)定性好，尤其能提供優(yōu)異的傳質(zhì)通道，已逐步應(yīng)用于傳感和吸附等平臺。然而，鮮見AgNPs改性的MAs（MAs-AgNPs）復(fù)合材料應(yīng)用于HO電化學(xué)檢測的相關(guān)報道。

本研究采用回流法化學(xué)還原硝酸銀（AgNO）制備AgNPs并負(fù)載于MAs，以3D AgNPs-MAs復(fù)合材料修飾玻碳電極（glassy carbon electrode，GCE）制備用于食品中HO測定的電化學(xué)傳感器。以對HO的電流響應(yīng)為指標(biāo)，對AgNPs-MAs-GCE修飾電極的條件進行優(yōu)化；并與制備的其余修飾電極（如AgNPs-GCE和MAs-GCE）進行電化學(xué)測試及對比分析；使用牛奶樣品對AgNPs-MAs-GCE修飾電極進行實際樣品測試及回收率分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛奶 廣西石埠乳業(yè)有限公司；透析袋（截留分子質(zhì)量3 500 Da） 湖南電禾公司；石墨粉、羧基化MWCNT 南京先豐納米材料科技有限公司；鹽酸DA上海恒斐生物科技有限公司；AgNO、HO國藥集團化學(xué)試劑有限公司；以上試劑均為分析純；實驗用水均為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

CHI760E電化學(xué)分析儀 上海辰華儀器有限公司；GCE（直徑3 mm）、鉑柱電極、飽和甘汞電極 天津英科聯(lián)合科技有限公司；80-ZB離心機 上海雅榮生化儀器設(shè)備有限公司；CTFD-10冷凍干燥機 上海拓紛機械設(shè)備有限公司；SU5000場發(fā)射掃描電鏡 日立高新技術(shù)公司。

1.3 方法

1.3.1 MWCNT-PDA的制備

參考Ryu等提出的方法。將0.10 g羧基化MWCNT溶于200 mL去離子水，超聲處理30 min使其分散均勻，在攪拌情況下緩慢地加入0.20 g DA。用三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液將該混合物的pH值調(diào)整為8.5，并在室溫下連續(xù)攪拌該懸浮液48 h。5 000 r/min離心5 min，去除上清液，用去離子水和乙醇溶液多次沖洗并進行透析，以完全去除游離的DA。冷凍干燥24 h，最終獲得MWCNT-PDA。

1.3.2 MAs的制備

參考Hummers和Zhan Wenwei等的方法。將GO透析數(shù)天，直至溶液pH值趨于中性，冷凍干燥，得到透析后的GO。將MWCNT-PDA∶GO以質(zhì)量比1∶4溶于一定體積的去離子水，超聲溶解，其中GO質(zhì)量濃度為2.00 mg/mL。將25 mL混合溶液轉(zhuǎn)入反應(yīng)釜，90 ℃反應(yīng)12 h。將反應(yīng)產(chǎn)物倒入透析袋，以去離子水和乙醇溶液交替透析數(shù)天，液氮冷凍后進行干燥，再在750 ℃以氮氣保護退火3 h，得到MAs。

1.3.3 AgNPs-MAs的制備

參考并改進Shi Lei等的合成技術(shù)。將0.040 g AgNO置于小燒杯中，加入20 mL乙二醇，超聲處理0.5 h。加入0.02 g MAs靜置2 h后，在圓底燒瓶中加入0.2 mL水合肼和0.5 mL 0.4 mol/L NaOH溶液，保持150 ℃，在油浴鍋中回流4 h。用二次水和乙醇依次清洗、6 000 r/min離心5 min，真空干燥后得到AgNPs-MAs。重復(fù)上述步驟制備AgNPs（不加MAs）。

1.3.4 AgNPs-MAs-GCE及其他修飾電極的制備

將AgNPs-MAs分散于,-二甲基甲酰胺，使溶液中AgNPs-MAs質(zhì)量濃度為1 mg/mL，用移液槍取5 μL復(fù)合物溶液滴涂于事先打磨好的GCE表面，自然晾干，得到AgNPs-MAs-GCE修飾電極。此外，其他對比性修飾電極（如AgNPs-GCE和MAs-GCE）的制作程序與此相似。

1.3.5 掃描電鏡和能譜測試

掃描電鏡：掃描探頭為二次電子探頭，掃描電壓10 kV，工作距離8.5 mm，探針電流20 pA。

能譜掃描實驗參數(shù)：掃描電壓10 kV，工作距離6.9 mm。

1.3.6 修飾電極的電化學(xué)測試

采用電化學(xué)阻抗法在5 mmol/L [Fe(CN)]/[Fe(CN)]+0.1 mol/L KCl溶液中測試不同修飾電極的電化學(xué)阻抗表征，偏壓0.2 V，頻率范圍10 000～0.5 Hz，交流振幅5 mV。

采用循環(huán)伏安法測試不同修飾電極對HO的電流響應(yīng)，電壓范圍-0.5～0.6 V，掃描速率為50 mV/s，HO濃度為10 mmol/L。

采用計時庫侖法在0.1 mmol/L [Fe(CN)]/[Fe(CN)]+0.1 mol/L KCl溶液中測試電量評估AgNPs-MAs-GCE修飾電極的有效面積，電壓范圍0.25～0.5 V，脈沖寬度0.25 s，圈數(shù)為1 圈。

采用計時電流法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以AgNPs-MAs-GCE為工作電極，最佳測試條件下，保持基線平穩(wěn)后，向10 mL磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）中每隔50 s等量添加20 μL 5 mmol/L HO溶液。

采用計時電流法考察電極穩(wěn)定性，將AgNPs-MAs-GCE修飾電極保存于4 ℃冰箱，每隔10 d在相同條件下測試對HO的電流響應(yīng)，其中，偏壓-0.4 V，緩沖液為磷酸鹽緩沖液（pH 7.4），電極修飾液體積5 μL；而AgNPs-MAs-GCE修飾電極的重復(fù)性測定，需要修飾3 根相同的電極，測定條件與穩(wěn)定性保持一致。

采用計時電流法考察AgNPs-MAs-GCE修飾電極的抗干擾性，測試時分3 個環(huán)節(jié)。首先，滴加HO，其次，滴加干擾物，最后，繼續(xù)滴加HO，而測試條件與穩(wěn)定性保持一致。

1.3.7 AgNPs-MAs-GCE修飾電極的實際樣品測試及回收率分析

采用計時電流法測試實際樣品和回收率，測試前將牛奶于6 000 r/min離心5 min，移取上清液1 mL，將其溶于10 mL磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）中，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進行回收實驗。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個實驗均重復(fù)3 次。使用Zview 3.10軟件對電化學(xué)阻抗奈奎斯特圖的數(shù)據(jù)進行擬合，其他數(shù)據(jù)使用Origin 8.5軟件進行分析和繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 AgNPs-MAs-GCE修飾電極及其材料的掃描電鏡表征

從圖1A～E可以看出，GO褶皺明顯并呈現(xiàn)規(guī)則的較大孔洞，這為后續(xù)3D MAs的制備提供支撐；MWCNTPDA呈螺旋彎曲，直徑小于50 nm且長度約為1 μm；3D MAs的橫切面呈分層多孔結(jié)構(gòu)，類似“卷心菜狀”；AgNPs直徑為30～50 nm，大小基本均勻，相對分散；AgNPs-MAs復(fù)合材料修飾GCE表面特征，發(fā)現(xiàn)大量AgNPs負(fù)載于MAs中。肉眼觀察MAs呈現(xiàn)圓柱狀，冷凍干燥后，表面粗糙，層狀分布明顯并有大孔（圖1F）。

圖1 GO（A）、MWCNT-PDA（B）、MAs（C）、AgNPs（D）、AgNPs-MAs-GCE（E）掃描電鏡圖和MAs實物圖（F）Fig. 1 Scanning electron microscopic images of GO (A),MWCNT-PDA (B), MAs (C), AgNPs (D), AgNPs-MAs-GCE (E) and pictures of MAs (F)

2.2 AgNPs-MAs復(fù)合材料元素圖譜表征分析

由圖2可知，AgNPs-MAs復(fù)合材料的主要元素為Ag（紫色）、O（藍(lán)色）和C（綠色），相對含量分別為55.64%、2.37%和41.99%。

圖2 AgNPs-MAs的掃描電鏡圖（A）、面掃元素圖（B）和能量色散X射線譜圖（C）Fig. 2 Scanning electron microscopic image (A), scanning electron microscopic elemental mapping image (B), and energy-dispersive X-ray spectroscopic image (C) of the AgNPs-MAs

2.3 不同修飾電極的電化學(xué)阻抗表征

將制備的GCE、AgNPs-GCE、MAs-GCE和AgNPs-MAs-GCE電極分別置于三電極體系中進行電化學(xué)阻抗測量，結(jié)果如圖3所示。半圓的直徑長度表示高頻電子傳遞的限制過程，而直線部分表示低頻溶液擴散限制過程。采用Zview軟件，進行等效電路擬合（圖4），GCE、AgNPs-GCE、MAs-GCE和AgNPs-MAs-GCE電極的電荷轉(zhuǎn)移電阻（）分別為955.5、3 342、326.7 Ω和384.8 Ω，說明AgNPs分散于3D MAs多層結(jié)構(gòu)中時，其降為最小值，這更利于電荷轉(zhuǎn)移。

圖3 不同修飾電極的電化學(xué)阻抗圖譜Fig. 3 Nyquist plots of different modified electrodes

圖4 不同修飾電極的等效電路圖Fig. 4 Equivalent circuits for different modified electrodes

2.4 不同修飾電極對H2O2的電流響應(yīng)分析

如圖5所示，GCE和MAs-GCE在HO溶液中沒有明顯的氧化還原峰，二者電流區(qū)別不大；AgNPs-GCE對HO具有催化作用，顯示較強的氧化還原峰；AgNPs-MAs-GCE對HO響應(yīng)明顯增大，其還原峰電流分別是AgNPs-GCE的1.8 倍和GCE的24.5 倍。這歸因于MAs材料的分層多孔結(jié)構(gòu)方便快速傳質(zhì)以及分散于該結(jié)構(gòu)中的AgNPs催化協(xié)同作用，AgNPs在MAs加持下，大幅度提高催化活性位點的密度性，活性位點與HO在3D空間中充分接觸。

圖5 不同修飾電極的循環(huán)伏安圖Fig. 5 Cyclic voltammograms of different modified electrodes

2.5 AgNPs-MAs-GCE修飾電極測試條件優(yōu)化分析

2.5.1 掃描速率對AgNPs-MAs-GCE修飾電極HO電化學(xué)行為的影響

由圖6A可知，在30～110 mV/s掃描速率范圍內(nèi)，氧化和還原峰電流隨掃描速率的增大而增大，且峰電流與掃描速率的平方根呈正比關(guān)系（圖6B），即HO在AgNPs-MAs-GCE電極周圍的電子轉(zhuǎn)移受擴散控制。

圖6 AgNPs-MAs-GCE修飾電極在不同掃描速率下對H2O2電流響應(yīng)（A）及H2O2峰電流響應(yīng)與掃描速率平方根的線性關(guān)系圖（B）Fig. 6 Current response at different scanning speeds of the electrode AgNPs-MAs-GCE (A) and linear relationship between peak current and square root of scanning speed (B)

2.5.2 pH值對AgNPs-MAs-GCE修飾電極HO電化學(xué)行為的影響

如圖7所示，隨著pH值從5.5增至7.4，峰電流依次增加，隨后進入堿性環(huán)境，隨著pH值增大峰電流降低。因此，本實驗得到的最優(yōu)pH 7.4。

圖7 AgNPs-MAs-GCE修飾電極的pH值與峰電流的關(guān)系Fig. 7 Relationship between peak current and pH for AgNPs-MAs-GCE

2.5.3 偏壓對AgNPs-MAs-GCE修飾電極HO電化學(xué)行為的影響

如圖8所示，隨著偏壓增加，電流響應(yīng)信號增加，噪音信號也同步增加；偏壓為-0.7 V時，噪音信號明顯擾亂電流信噪。此外，偏電壓太大，傳感器的選擇性會受到挑戰(zhàn)。為了保證傳感器的靈敏性和選擇性，本實驗選擇-0.4 V為工作偏壓。

圖8 AgNPs-MAs-GCE修飾電極在不同偏壓下對H2O2的電流響應(yīng)Fig. 8 Current response to H2O2 at different bias levels of AgNPs-MAs-GCE

2.5.4 修飾液體積對AgNPs-MAs-GCE修飾電極HO電化學(xué)行為的影響

如圖9所示，5 μL AgNPs-MAs修飾液會使AgNPs-MAs-GCE電極產(chǎn)生較高的響應(yīng)信號，其他體積修飾液下的電流響應(yīng)波動不大，所以本實驗以5 μL為最優(yōu)AgNPs-MAs修飾液體積。

圖9 AgNPs-MAs-GCE修飾電極在不同修飾液體積下H2O2電流響應(yīng)Fig. 9 Current response to H2O2 at different volumes of modified electrode solution of AgNPs-MAs-GCE

2.6 AgNPs-MAs-GCE修飾電極的有效面積分析

采用計時庫侖法測試修飾電極AgNPs-MAs-GCE在0.1 mmol/L [Fe (CN)]溶液中電量和時間的關(guān)系，計算修飾電極的有效面積。參考公式如下：

式中：為電荷量；為電極有效面積；為溶液中的初始摩爾濃度；為電子的轉(zhuǎn)移數(shù)量；為法拉第常數(shù)（96 480 C/mol）；為電解時間；為擴散系數(shù)（7.610 6 cm/s）；為雙層電荷；為Faradaic電荷。

如圖10所示，AgNPs-MAs-GCE和GCE電極的擬合曲線方程分別是＝19.2+0.69（＝0.992 6）和＝6.86+0.13（＝0.998 3），根據(jù)其斜率，得到AgNPs-MAs-GCE修飾電極的有效面積是裸GCE的2.8倍，說明修飾材料有可能在實驗中起到富集作用增大電流響應(yīng)。

圖10 AgNPs-MAs-GCE修飾電極的電量與時間關(guān)系曲線（A）、電量與時間平方根的線性關(guān)系圖（B）Fig. 10 Charge versus time curve for AgNPs-MAs-GCE (A), and linear relationship between charge and square root of time (B)

2.7 AgNPs-MAs-GCE修飾電極對H2O2標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

如圖11所示，隨著電解池中HO濃度的增加，峰電流有規(guī)律地攀升且峰電流與HO濃度成呈良好線性關(guān)系，其線性方程為＝0.32+1.66（＝0.999 3），線性范圍為9.98～136 μmol/L，檢出限0.02 μmol/L（信噪比為3）。該傳感器的靈敏性高于目前文獻報道值，如表1所示。高靈敏性可能歸功于：以3D分層多孔結(jié)構(gòu)的復(fù)合材料修飾電極能明顯增大被測物接觸空間，改善了目標(biāo)離子的傳質(zhì)效率；分散的AgNPs提供了足夠的識別位點并增強了響應(yīng)信號的接收。

圖11 連續(xù)滴加H2O2的計時電流響應(yīng)曲線（A）及電流與H2O2濃度的線性關(guān)系（B）Fig. 11 Amperometric response curves of AgNPs-MAs-GCE with successive addition of H2O2 (A), and linear relationship between peak current and concentration of H2O2 (B)

表1 基于類似納米材料的電化學(xué)傳感器H2O2檢測性能比較Table 1 Comparison of the analytical performance of electrochemical sensors based on similar nanomaterials for H2O2 detection

2.8 AgNPs-MAs-GCE修飾電極的穩(wěn)定性和重復(fù)性分析

如圖12所示，第30天該修飾電極的響應(yīng)電流比第1天降低18.4%，電極活性保持在81.5%以上，而3 根AgNPs-MAs-GCE電極的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.52%、3.2%和3.1%。以上數(shù)據(jù)顯示該修飾電極構(gòu)建的HO電化學(xué)傳感器具有較好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

圖12 AgNPs-MAs-GCE電極的穩(wěn)定性和重復(fù)性Fig. 12 Stability and repeatability of AgNPs-MAs-GCE

2.9 AgNPs-MAs-GCE電極的抗干擾性分析

如圖13所示，向磷酸鹽緩沖液等時間、等體積地添加20 μL 5 mmol/L HO后，發(fā)現(xiàn)電流響應(yīng)隨添加次數(shù)依次增加；依次添加等濃度的干擾物鹽酸DA、酪氨酸（tyrosine，Tyr）、尿酸（uric acid，UA）、色氨酸（tryptophan，Try）、檸檬酸（citric acid，CA）和抗壞血酸（ascorbic acid，AA）于電解池，發(fā)現(xiàn)只有UA對應(yīng)的電流有輕微浮動，其余干擾物對應(yīng)的電流幾乎沒有增加；最后繼續(xù)添加HO，發(fā)現(xiàn)電流響應(yīng)并未受電解池測試環(huán)境的影響，依然隨HO添加次數(shù)而增加。因此，該修飾電極構(gòu)建的HO電化學(xué)傳感器具有良好的抗干擾能力。

圖13 AgNPs-MAs-GCE電極的抗干擾能力Fig. 13 Anti-interference capacity of AgNPs-MAs-GCE

2.10 AgNPs-MAs-GCE修飾電極測量的回收率分析

如表2所示，牛奶樣品的回收率在98.1%～98.8%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.58%～2.28%。說明該方法建立的傳感器回收率高，實驗數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度高，有望用于檢測實際樣品。

表2 AgNPs-MAs-GCE修飾電極測定牛奶樣品回收率Table 2 Recoveries of H2O2 spiked in milk samples using AgNPs-MAs-GCE

3 結(jié) 論

以3D MAs負(fù)載AgNPs制備高穩(wěn)定性和傳質(zhì)效率優(yōu)異的分層多孔復(fù)合材料修飾GCE構(gòu)建AgNPs-MAs-GCE電化學(xué)傳感器并采用計時電流法檢測HO。隨著HO濃度的增加，峰電流與濃度呈良好線性關(guān)系，其線性方程為＝0.32+1.66（＝0.999 3），線性范圍9.98～136 μmol/L，檢出限0.02 μmol/L（信噪比為3）。該傳感器保存至第30天時，該修飾電極的活性保持在81.5%以上，重復(fù)性的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差低于3.2%，對于實際樣品的回收率保持在98.1%～98.8%之間，實驗結(jié)果表明，該傳感器有望用于食品中HO的高靈敏性檢測。此外，該傳感器也存在一些不足，不能同時檢測多種組分，若將計時電流法與原位拉曼技術(shù)或微流控技術(shù)結(jié)合，有望同時檢測多種組分。