華紅艷 李建聽 夏劍民

511400 廣州市番禺區(qū)何賢紀(jì)念醫(yī)院腎病科，廣東廣州

腎臟纖維化是慢性腎臟疾病發(fā)展的重要病理過程，在臨床上治療慢性腎臟疾病中控制腎臟纖維化難度較大[1]。因此，抗腎臟纖維化藥物成為研究的熱點。在諸多研究中發(fā)現(xiàn)miRNA-34b 與多種腎臟疾病的發(fā)生有關(guān)，同時細胞毒顆粒關(guān)聯(lián)RNA 結(jié)合蛋白1 應(yīng)激顆粒(TIA-1-SG)通路在此過程中也發(fā)揮了重要作用[2-3]。抑制miRNA-34b 表達或許能夠緩解腎臟纖維化的發(fā)展，可為臨床上控制腎臟纖維化患者的病情提供新的治療方案，但是目前關(guān)于其中的機制研究較為少見。鑒于此，本研究對miRNA-34b 抑制治療腎臟纖維化的新機制進行分析。

資料與方法

實驗動物、細胞：雄性CD1 小鼠共20 只，均為8 周齡，平均體重為(19.57±1.88)g。人腎小管上皮細胞(HK2)、巨噬細胞(RAW)均購于美國模式菌種收集中心。

方法：(1)實驗方法。①動物實驗：給予CD1 小鼠250 mg/kg 葉酸誘導(dǎo)腎間質(zhì)纖維化，給予其miRNA-34b 抑制劑(以下簡稱“抑制劑”)皮下注射，持續(xù)4周，注射2次/周。②體外細胞實驗：對HK2分別進行miRNA-34b 的過表達處理與沉默處理，均使用RAW 上清液進行培養(yǎng)，共24 h。(2)細胞培養(yǎng)。HK2 復(fù)蘇后接種于F12 培養(yǎng)液中，其中含有10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素及100 μg/mL 鏈霉素，在濃度為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度恒定37℃；在細胞生長至80%融合時，傳代比例為1∶4，隨后將細胞接種至培養(yǎng)皿中，接種密度為1.0×105個/mL，在細胞貼壁后進行相應(yīng)處理24 h。RAW 復(fù)蘇后接種于DMEM 培養(yǎng)液中，相關(guān)物質(zhì)含量、培養(yǎng)條件、傳代比例以及接種密度均同上，培養(yǎng)48 h 收集上清液后進行過濾處理。(3)HK2miRNA-34b 的過表達處理。在進行瞬時轉(zhuǎn)染前，進行正常的細胞培養(yǎng)，在細胞生長至融合適度時，提前1 h 更換新鮮培養(yǎng)。①將7.5 μL 的Lipo3000 與250 μL 的無血清培養(yǎng)基進行混合稀釋；②將上一步驟的稀釋液1∶1與正常對照稀釋液進行混合稀釋。③在室溫條件下進行孵育，共10 min。④在培養(yǎng)皿中加入250 μL的轉(zhuǎn)染液，并在常規(guī)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，共48 h。(4)mRNA 檢測。將培養(yǎng)基棄除，使用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)進行1 次洗滌；將PBS 棄除，加入1 000 μL 的Trizol，并進行多次沖洗；將Trizol 置入加有1.5 mL 的無核酸酶純水離心管，然后在該離心管中加入300 μL 的氯仿，將其均勻混合。(5)蛋白檢測。將培養(yǎng)基棄除，使用PBS 進行3 次洗滌；將PBS 棄除，將培養(yǎng)皿凍存于-80℃環(huán)境下。加入100 μL 的裂解液以及蛋白抑制劑混合液，將培養(yǎng)皿上的細胞刮除到離心管，運用超聲裂解儀進行裂解，頻率設(shè)置為3 Hz，共進行3 次，10 s/次。采用ECL 化學(xué)發(fā)光顯示試劑，Western 印跡成像獲得圖像。

觀察指標(biāo)：①動物實驗：對比小鼠在注射miRNA-34b 抑制劑前后的纖維化指標(biāo)，包括轉(zhuǎn)化因子生長β1蛋白(TGFβ1)、纖維連接蛋白與Ⅳ型膠原蛋白。②體外細胞實驗：對比HK2 miRNA-34b 過表達處理與沉默處理的纖維化相關(guān)指標(biāo)、腎小管損傷指標(biāo)、miRNA-34b 與TIA-1-SG。纖維化指標(biāo)包括TGFβ1、纖維連接蛋白與Ⅳ型膠原蛋白，腎小管損傷指標(biāo)包括溶酶體酶(尿NAG)、尿視黃醇結(jié)合蛋白。

統(tǒng)計學(xué)方法：數(shù)據(jù)均用SPSS 23.0 統(tǒng)計學(xué)軟件予以處理；計量資料以表示，比較采用t檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

小鼠指標(biāo)比較：與小鼠注射miRNA-34b 抑制劑前情況比較，注射后纖維化指標(biāo)TGFβ1、纖維連接蛋白與Ⅳ型膠原蛋白均降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 小鼠指標(biāo)比較(±s)

表1 小鼠指標(biāo)比較(±s)

時間 n TGFβ1 纖維連接蛋白 Ⅳ型膠原蛋白(μg/g·Cr) (μg/mL) (ng/mL)注射前 20 42.69±7.25 457.68±88.75 205.86±40.39注射后 20 15.36±5.08 208.71±45.22 115.63±25.77 t 13.806 11.178 8.422 P 0.000 0.000 0.000

體外細胞指標(biāo)比較：過表達處理后HK2 腎小管損傷指標(biāo)、纖維化相關(guān)指標(biāo)與miRNA-34b 表達率高于沉默處理后HK2，過表達處理后的HK2 細胞的TIA-1-SG 表達率低于沉默處理后HK2，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 體外細胞指標(biāo)比較(±s)

表2 體外細胞指標(biāo)比較(±s)

處理方式 株數(shù) TGFβ1 纖維連接 Ⅳ型膠原 尿NAG 尿視黃醇結(jié)合 miRNA-34b TIA-1-SG(μg/g·Cr) 蛋白(μg/mL) 蛋白(ng/mL) (U/L) 蛋白(mg/mL) 表達率(%) 表達率(%)過表達 30 44.55±7.38 463.68±79.39 212.58±43.59 15.88±1.63 75.88±15.63 0.87±0.11 0.35±0.07沉默 30 16.94±6.12 215.73±47.26 120.75±26.88 10.49±0.26 43.26±8.75 0.39±0.08 0.85±0.12 t 15.773 14.699 9.821 17.886 9.974 19.329 19.713 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

討 論

調(diào)節(jié)細胞質(zhì)的微小RNA 功能是對細胞基因表達的關(guān)鍵，細胞質(zhì)微小RNA 功能受阻，將會影響細胞功能。應(yīng)激顆粒(SG)由RNA和蛋白質(zhì)聚集形成，控制RNA 的代謝、信號傳導(dǎo)與應(yīng)激下的細胞存活。miRNA-34b是微小RNA中的一種，與眾多微小RNA一樣，能夠?qū)哂猩飳W(xué)功能的蛋白翻譯產(chǎn)生干預(yù)作用，不僅參與細胞調(diào)控中的增殖、凋亡及分化等生理過程，還可以調(diào)控病毒在宿主細胞內(nèi)的復(fù)制[4]。TIA-1-SG 作為靶蛋白，其表達水平直接受到miRNA-34b 的影響，miRNA-34b 將其下調(diào)后促進纖維化蛋白的合成，進而促進腎臟纖維化。在既往的研究中發(fā)現(xiàn)miRNA-34b 與腎小管損傷指標(biāo)、纖維化相關(guān)指標(biāo)呈正相關(guān)關(guān)系，與TIA-1-SG 的表達呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[5-6]。為了研究miRNA-34b 抑制劑治療腎臟纖維化的新機制，將這些指標(biāo)作為此次研究的觀察重點。

在本次的研究結(jié)果中，與小鼠注射miRNA-34b抑制劑前情況比較，注射后的纖維化指標(biāo)TGFβ1、纖維連接蛋白及Ⅳ型膠原蛋白均降低。該項結(jié)果證實了miRNA-34b 抑制劑在抑制腎臟纖維化方面具有顯著作用。而在進一步的體外細胞實驗中發(fā)現(xiàn)，過表達處理后HK2 的腎小管損傷指標(biāo)、纖維化相關(guān)指標(biāo)與miRNA-34b 表達率高于沉默處理后的HK2，過表達處理后HK2 細胞的TIA-1-SG 表達率低于沉默處理后的HK2。說明miRNA-34b 表達情況的變化會影響腎臟是否發(fā)生纖維化，當(dāng)miRNA-34b 呈過表達狀態(tài)時會引起腎臟纖維化的發(fā)生。腎臟纖維化通常為腎小管間質(zhì)纖維化，主要特征為出現(xiàn)腎間質(zhì)細胞與膠原成分聚集增加、腎小管變形及周圍毛細血管減少等。由于腎臟纖維化可造成腎小管損傷，故而腎小管損傷指標(biāo)的變化可間接反映腎臟纖維化的發(fā)生或者緩解。尿NAG、尿視黃醇結(jié)合蛋白是反映人體腎小管損傷的有效指標(biāo)[7-8]，由于miRNA-34b過表達引起腎臟纖維化發(fā)生，進而對腎小管造成損傷，因此，經(jīng)過miRNA-34b 過表達處理的HK2 在腎小管損傷相關(guān)指標(biāo)尿NAG、尿視黃醇結(jié)合蛋白水平出現(xiàn)顯著升高的變化。另外，miRNA-34b 表達率與TIA-1-SG 表達率呈相反的變化，表明兩者之間存在關(guān)聯(lián)。HK2 在應(yīng)用miRNA-34b 抑制劑處理后，過表達處理后HK2的miRNA-34b 表達率降低，TIA-1-SG 表達率升高。其原因是miRNA-34b 參與了腎臟疾病的發(fā)生，而TIA-1-SG 作為一種SG，為保護腎臟細胞適應(yīng)miRNA-34b 引起的細胞功能損傷而形成，因此在miRNA-34b 促進腎纖維化發(fā)展的過程中，對TIA-1-SG 產(chǎn)生抑制作用，使其表達水平下調(diào)。miRNA-34b 抑制劑通過抑制miRNA-34b 的表達，進而抑制其對靶蛋白TIA-1-SG 的下調(diào)作用，使TIA-1-SG 表達率升高，纖維化蛋白的合成隨之受到抑制，最終實現(xiàn)了對腎臟纖維化的抑制，以控制腎臟疾病的病情發(fā)展。JAK-STAT 通路是腎纖維化的關(guān)鍵，TGFβ1 是促進JAK-STAT 通路的重要因子，本次研究結(jié)果也可表明，注射miRNA-34b 抑制劑后的小鼠TGFβ1 水平明顯降低[9]。進一步證實了miRNA-34b抑制劑對腎纖維化的抑制作用。

綜上所述，TIA-1-SG 對緩解腎臟纖維化具有重要作用，miRNA-34b 抑制劑能夠抑制miRNA-34b 表達，進而對其下調(diào)TIA-1-SG 的過程產(chǎn)生抑制作用，促進TIA-1-SG 表達，進而降低腎損傷指標(biāo)、炎性指標(biāo)及纖維化指標(biāo)。