何勁松 段亮 謝育 魏壽江

摘要： 目的：探析微小核糖核酸（miR-7）在八聚物（Oct4）調(diào)節(jié)Toll樣受體4（TLR4）表達(dá)中的作用對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。方法：選擇2020年1月-2021年12月，正常腸粘膜（對(duì)照組）、結(jié)直腸癌（觀察組）臨床樣本中分別獲得的17株和14株亞克隆細(xì)胞株。利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)結(jié)合免疫共沉淀技術(shù)，明確Oct4與miR-7、miR-7與TLR4分子層面的靶向調(diào)控關(guān)系;觀察雙向調(diào)控下結(jié)直腸癌細(xì)胞在體及細(xì)胞水平生物學(xué)功能，探討Oct4-miR-7-TLR4信號(hào)通路的分子機(jī)制及功能調(diào)控作用。結(jié)果：觀察組miR-7檢測(cè)值低于對(duì)照組，Oct4、TLR4檢測(cè)值、雙陽(yáng)性細(xì)胞、平均腫瘤球比高于對(duì)照組（P<0.05）;miR-7與Oct4、TLR4呈負(fù)相關(guān)，Oct4與TLR4呈正相關(guān)（P<0.05）。結(jié)論：Oct4高表達(dá)可導(dǎo)致miR-7表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而致TLR4表達(dá)上升，使結(jié)直腸癌患者出現(xiàn)miR-7低表達(dá)狀態(tài)，Oct4、TLR4高表達(dá)狀態(tài)，結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)、繁殖加快，腫瘤惡化程度加重。

關(guān)鍵詞：結(jié)直腸癌;細(xì)胞生長(zhǎng);水平表達(dá);分子機(jī)制;調(diào)控作用

【中圖分類號(hào)】 R574.63 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A? ? ? 【文章編號(hào)】2107-2306（2022）13--02

[Abstract] Objective： To explore the effect of micrornas （Mir-7） on the growth of colorectal cancer cells by regulating toll-like receptor 4 （TLR4） expression by Oct4. Methods： From January 2020 to December 2021， 17 and 14 subclonal cell lines were selected from clinical samples of normal intestinal mucosa （control group） and colorectal cancer （observation group）， respectively. The dual luciferase reporting system combined with immunoprecipitation technique was used to clarify the targeted regulatory relationship between Oct4 and Mir-7， mir-7 and TLR4 at the molecular level. To observe the biological functions of colorectal cancer cells in vivo and at the cellular level under bidirectional regulation， and to explore the molecular mechanism and functional regulation of OCT4-Mir-7-TLR4 signaling pathway. Results： The detection value of Mir-7 in the observation group was lower than that in the control group， while the detection value of Oct4 and TLR4， double positive cells and average tumor ball ratio in the observation group were higher than those in the control group， with statistical significance （P<0.05）. The results showed that Mir-7 was negatively correlated with Oct4 and TLR4， while Oct4 was positively correlated with TLR4 （P<0.05）. Conclusion： High EXPRESSION of Oct4 can lead to down-regulation of Mir-7 expression， and then increase the expression of TLR4， resulting in low expression of Mir-7 in colorectal cancer patients. High expression of Oct4 and TLR4 can accelerate the growth and reproduction of colorectal cancer cells， and aggravate the degree of tumor deterioration.

結(jié)直腸癌是指源于大腸上皮細(xì)胞，發(fā)生在結(jié)腸或直腸部位的腫瘤疾病，以便血、排便習(xí)慣改變?yōu)榈湫团R床表現(xiàn)，可伴尿頻、腹痛、腹脹等癥狀，會(huì)對(duì)患者的正常生活、工作狀態(tài)造成直接影響，且會(huì)危及其生命[1-2]。一般早期結(jié)直腸癌患者多無特異性臨床表現(xiàn)，易漏診、誤診，錯(cuò)失最佳診療時(shí)期[3]。近年來，隨生物分子學(xué)相關(guān)研究地深入，靶向治療已成為治療癌癥的新手段，成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。八聚物（Oct4）是干細(xì)胞重編的關(guān)鍵因子之一，有抑癌基因和癌基因的雙重作用，同腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4]。微小核糖核酸（miR-7）可通過調(diào)節(jié)多種靶基因的表達(dá)，抑制結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展[5]。TOLL樣受體家族（TLRs）TLR4在促進(jìn)結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞的炎癌轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮著重要作用，同結(jié)直腸癌的發(fā)生有相關(guān)性[6]。目前關(guān)于Oct4-miR-7-TLR4信號(hào)通路調(diào)控影響結(jié)直腸癌的研究尚少，所以本研究擬針對(duì)miR-7和TLR4在結(jié)直腸癌干細(xì)胞相關(guān)功能調(diào)節(jié)所發(fā)揮的作用，及Oct4調(diào)控結(jié)直腸癌干細(xì)胞致瘤能力的分子機(jī)制展開深入研究探析，以期為靶向結(jié)直腸癌干細(xì)胞的診治提供新的方向和理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料

選擇2020年1月-2021年12月，正常腸粘膜（對(duì)照組）、結(jié)直腸癌（觀察組）臨床樣本中分別獲得的17株和14株亞克隆細(xì)胞株。利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)結(jié)合免疫共沉淀技術(shù)，明確Oct4與miR-7、miR-7與TLR4分子層面的靶向調(diào)控關(guān)系;觀察雙向調(diào)控下結(jié)直腸癌細(xì)胞在體及細(xì)胞水平生物學(xué)功能，探討Oct4-miR-7-TLR4信號(hào)通路的分子機(jī)制及功能調(diào)控作用。

1.2方法

1.2.1質(zhì)粒構(gòu)建、獲得亞克隆細(xì)胞株

構(gòu)建Oct4過表達(dá)、miR-7過表達(dá)及敲降、TLR4過表達(dá)及敲降質(zhì)粒;構(gòu)建含Oct4核心結(jié)合位點(diǎn)的miR-7啟動(dòng)子區(qū)域熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒;構(gòu)建含miR-7靶點(diǎn)的TLR43’UTR熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒（均含有對(duì)照質(zhì)粒）。后通過脂質(zhì)體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染法，獲得結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW620的亞克隆細(xì)胞株：Oct4過表達(dá)、miR-7過表達(dá)、Oct4過表達(dá)+miR-7過表達(dá)、Oct4過表達(dá)+TLR4敲降、TLR4敲降（均包括對(duì)照組亞克隆細(xì)胞株）。通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）、免疫印跡（WB）等實(shí)驗(yàn)檢測(cè)上述亞克隆細(xì)胞株中相關(guān)基因的表達(dá)。

1.2.2驗(yàn)證表達(dá)

在Oct4過表達(dá)細(xì)胞株及對(duì)照細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染具有Oct4核心結(jié)合位點(diǎn)（5’-CACCC-3’）的miR-7啟動(dòng)子序列的熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，檢測(cè)其活性。采用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（CHIP）檢測(cè)Oct4過表達(dá)細(xì)胞株及對(duì)照細(xì)胞株中Oct4與miR-7相關(guān)啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合能力。在miR-7過表達(dá)細(xì)胞株及對(duì)照細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染具有miR-7核心結(jié)合位點(diǎn)的TLR43’UTR的熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)及含突變位點(diǎn)的對(duì)照系統(tǒng)，檢測(cè)其活性。在Oct4過表達(dá)+miR-7過表達(dá)及其對(duì)照細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染具有miR-7核心結(jié)合位點(diǎn)的TLR43’UTR的熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)及含突變位點(diǎn)的對(duì)照系統(tǒng)，檢測(cè)其活性。最后流式分選上述亞克隆細(xì)胞株中結(jié)直腸癌腫瘤干細(xì)胞（Lgr5+/EpCAM+，CSCs）及對(duì)照組（Lgr5-/EpCAM-，non-CSCs），檢測(cè)細(xì)胞數(shù)目。檢測(cè)Oct4/miR-7/TLR4通路對(duì)于結(jié)直腸癌腫瘤干細(xì)胞致瘤能力的影響將上述分選得到的CSCs及non-CSCs細(xì)胞亞群按照1個(gè)、10個(gè)、100個(gè)梯度的細(xì)胞數(shù)目在體外進(jìn)行成球?qū)嶒?yàn)，在體內(nèi)進(jìn)行裸鼠皮下植瘤實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)直腸癌腫瘤干細(xì)胞的致瘤能力。

1.2.3裸鼠移植瘤模型步驟

①取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，收集后用無血清培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)，稀釋至濃度為8×107/ml的細(xì)胞懸液。②取適量的細(xì)胞懸液與Matrigel等比例混合，利用一次性無菌胰島素注射器取100μ在裸鼠的雙側(cè)背部近大腿處進(jìn)行皮下注射。③觀察瘤子的生長(zhǎng)情況，待移植瘤長(zhǎng)出后，利用電子游標(biāo)卡尺每周測(cè)量一次，記錄腫瘤的長(zhǎng)寬。根據(jù)公式π/6×長(zhǎng)×寬2，計(jì)算腫瘤的大小。④待腫瘤大小至1，000mm3左右時(shí)（注射后30天左右），處死裸鼠，拍照，剝出皮下腫瘤，稱重，按照次序排列整齊后拍照，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，對(duì)比兩種細(xì)胞的生長(zhǎng)能力。

1.2.4細(xì)胞數(shù)檢測(cè)

雙陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目。過程如下：①消化、離心、PBS重懸。②加抗體：Lgr5--PE，EpCAM--APC雙標(biāo)篩選結(jié)直腸癌干細(xì)胞，設(shè)空白對(duì)照，避光孵育20min。③孵育后每管加入500μl的完全培養(yǎng)基或PBS，1000r/min，離心5-7分鐘，去上清，用含1%FBS，2%P/S的PBS500μl-1000μl重懸，進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，觀察陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。根據(jù)將要接收細(xì)胞數(shù)目的多少，準(zhǔn)備流式接管，分別收集雙陽(yáng)性細(xì)胞及雙陰性細(xì)胞。

細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)過程如下：①細(xì)胞消化、離心、重懸、計(jì)數(shù)。②50μl完全培養(yǎng)基中1000個(gè)細(xì)胞與50ulmatrigel混合，這個(gè)過程在冰盒上操作。③上述100ul混合液鋪于12孔板中。④放入37度溫箱中，待半小時(shí)到一小時(shí)左右，凝固后，其上添加1ml完全培養(yǎng)基，防止膠體干掉。每隔兩天換液一次。采用電子顯微鏡觀察細(xì)胞的成球能力并拍照。

1.3 觀察指標(biāo)

①比較兩組的miR-7、Oct4、TLR4表達(dá)。②miR-7、Oct4、TLR4在結(jié)直腸癌中的相關(guān)性。③比較兩組的雙陽(yáng)性細(xì)胞和致瘤情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用t和“x±s”表示計(jì)量資料，使用x2和%表示計(jì)數(shù)資料，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析法。P<0.05表示數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1比較兩組的miR-7、Oct4、TLR4表達(dá)

觀察組miR-7檢測(cè)值低于對(duì)照組，Oct4、TLR4檢測(cè)值高于對(duì)照組（P<0.05）。見表1。

2.2miR-7、Oct4、TLR4在結(jié)直腸癌中的相關(guān)性

結(jié)果顯示，miR-7與Oct4、TLR4呈負(fù)相關(guān)，Oct4與TLR4呈正相關(guān)（P<0.05）。見表2。

2.3比較兩組的雙陽(yáng)性細(xì)胞和致瘤情況

觀察組雙陽(yáng)性細(xì)胞、平均腫瘤球比均高于對(duì)照組（P<0.05）。見表3。

3. 討論

結(jié)直腸癌是較常見的一種胃腸道惡性腫瘤疾病，在腫瘤疾病中，結(jié)直腸癌發(fā)病率、病死率分別居于第三、第二[7]。流行病學(xué)顯示，2018年全球結(jié)直腸癌新發(fā)病例達(dá)180萬(wàn)，死亡人數(shù)在88萬(wàn)左右，整體發(fā)病率、病死率較高[8]。且目前結(jié)直腸癌的具體病因尚未明確，難以給予有針對(duì)性的治療措施。但隨醫(yī)療技術(shù)的提升，近年發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌發(fā)病是多種原癌基因與抑癌基因共同作用的結(jié)果，基于結(jié)直腸癌發(fā)病的分子機(jī)制，針對(duì)細(xì)胞信號(hào)通路尋找治療靶點(diǎn)，行靶向治療已成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

腫瘤干細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞存在的具有自我更新和致瘤特性，對(duì)傳統(tǒng)放化療存在抵抗的小部分細(xì)胞亞群，此部分細(xì)胞雖少，卻是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵。分析本研究結(jié)果數(shù)據(jù)?？赡艿脑蛉缦拢簃iR-7是多種腫瘤的抑癌基因，可作用于多種靶基因。在腫瘤疾病中，miR-7呈高表達(dá)狀態(tài)，有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和細(xì)胞周期進(jìn)程的作用，對(duì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，控制病情有積極影響。本研究中，結(jié)直腸癌者的miR-7呈低表達(dá)狀態(tài)，可側(cè)面說明miR-7表達(dá)下降，致腫瘤細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)得不到有效控制，患者病情開始逐漸惡化。Oct4有抑癌基因和癌基因雙重作用，亦是維持胚胎干細(xì)胞多能性及自我更新能力的主要調(diào)節(jié)劑。Oct4表達(dá)上升，可能會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖分化，可能會(huì)通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt通路，達(dá)維持腫瘤干細(xì)胞增殖、分化能力，加重結(jié)直腸癌病情的目的。TLR4在促進(jìn)結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞的炎癌轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮著重要作用，可通過調(diào)控下游NF-κB等多種基因的表達(dá)，來促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生[9]。即TLR4通過促進(jìn)炎性因子分泌，加重胃腸道炎癥反應(yīng)，使腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的攻擊產(chǎn)生抵抗，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖，加重腫瘤惡化程度[10]。就Oct4-miR-7-TLR4信號(hào)通路的分子機(jī)制而言，本研究中，結(jié)直腸癌者的miR-7呈低表達(dá)，Oct4、TLR4呈高表達(dá)，說明Oct4過表達(dá)可導(dǎo)致miR-7表達(dá)下調(diào)，隨miR-7表達(dá)下降，結(jié)直腸癌失去保護(hù)因素，TLR4等危險(xiǎn)因素呈上升趨勢(shì)。miR-7表達(dá)越低，Oct4、TLR4表達(dá)越高，結(jié)直腸癌干細(xì)胞的致瘤能力越強(qiáng)，患結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)越高，腫瘤病變程度越嚴(yán)重。

綜上所述，Oct4高表達(dá)可導(dǎo)致miR-7表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而致TLR4表達(dá)上升，使結(jié)直腸癌患者出現(xiàn)miR-7低表達(dá)狀態(tài)，Oct4、TLR4高表達(dá)狀態(tài)，結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)、繁殖加快，腫瘤惡化程度加重。

參考文獻(xiàn)：

[1] 萬(wàn)健，張玉潔，王敏，等.潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)異型增生和潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌56例的臨床特征[J].中華消化雜志，2021，41（10）：660-664.

[2] 徐恩盼，李冰，周平紅，等.內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)治療超高齡患者結(jié)直腸癌前病變及早期癌的臨床療效分析[J].中華消化內(nèi)鏡雜志，2021，38（12）：985-990.

[3] 申玉翠，徐建華，高鵬，等.內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)治療早期結(jié)直腸癌及癌前病變的回顧性分析[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2020，36（13）：1857-1860.

[4] 程玉，趙醒，次云哲，等.干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子OCT4在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其意義[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2018，34（1）：86-88.

[5] 薛迪新，吳偉力，陳積賢，等.環(huán)狀RNA Cdr1as/miR-7/SP1軸調(diào)控乳腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的研究[J].浙江醫(yī)學(xué)，2021，43（20）：2162-2168.

[6] 閆曉菲，趙廣越，喬鋆，等.miR-30c-5p及Toll樣受體4在結(jié)腸癌中的表達(dá)及意義[J].中國(guó)綜合臨床，2021，37（1）：57-61.

[7] 王德征，張爽，張輝，等.天津市結(jié)直腸癌死亡率1999—2015年變化趨勢(shì)分析[J].中華胃腸外科雜志，2019，22（6）：579-586.

[8] 鄭瑩，王澤洲.全球結(jié)直腸癌流行數(shù)據(jù)解讀[J].中華流行病學(xué)雜志，2021，42（1）：149-152.

[9] 張曉紅，南瓊.MicroRNA-7在結(jié)直腸癌中的研究進(jìn)展[J].胃腸病學(xué)，2019，24（7）：444-446.

[10] 李昂，仵紅嬌，謝俞寧，等.Toll樣受體基因組特征與直腸癌臨床病理及免疫參數(shù)的相關(guān)性分析[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2021，46（4）：340-347.

基金項(xiàng)目：南充市市?？萍紤?zhàn)略合作專項(xiàng)資金（20SXQT0151）

作者簡(jiǎn)介：何勁松（1985，12）男，碩士，四川南充人，漢族，主治醫(yī)師，研究方向：胃腸道腫瘤基礎(chǔ)與臨床、減重代謝性疾病的外科治療。

通訊作者：魏壽江（1966，10）男，碩士，重慶人，漢族，教授、科室主任，研究方向：胃腸道腫瘤基礎(chǔ)與臨床。