喬俊卿，孫 凱，劉永鋒，陳夕軍，劉郵洲*

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，南京 210014；2. 揚州大學園藝與植物保護學院，揚州 225009）

表面活性素（Surfactin）是芽胞桿菌產(chǎn)生的脂肽類物質中最主要的一類，是由非核糖體多肽合成酶系（NRPS）合成的、分子量約為1000 Da，其化學結構是含有7個α-氨基酸和具有13、14或15個碳原子的β-羥基脂肪酸構成的大環(huán)內(nèi)脂型同系化合物[1]，具有生物表面活性劑、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、誘導植物抗病性和信號分子的作用，是芽胞桿菌發(fā)揮生防作用的重要因子[2-7]。當芽胞桿菌被開發(fā)為生物農(nóng)藥施用后，生防菌定殖于生境，通過產(chǎn)生抑菌物質而發(fā)揮作用。然而，受遺傳、環(huán)境和營養(yǎng)等因素影響，芽胞桿菌合成分泌表面活性素的效率非常低，需要長時間的劑量積累才能發(fā)揮其抑菌、誘導抗病性等作用。因此，芽胞桿菌產(chǎn)生脂肽類物質的能力是影響微生物農(nóng)藥效價和貨架期的重要因素，也是微生物農(nóng)藥的產(chǎn)業(yè)化應用限制因素。

為了提高Surfactin產(chǎn)量，國內(nèi)外研究人員圍繞高產(chǎn)Surfactin菌株的篩選、生物合成基因的調控、基因工程改造和高效發(fā)酵工藝等方面展開研究。菌株的生長需要多種營養(yǎng)物質，比如碳源、氮源、氨基酸和金屬離子等。營養(yǎng)物質的種類和比例，都會影響菌株的生長和發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量。通過優(yōu)化培養(yǎng)基組成，在產(chǎn)生更多Surfactin同時，進一步降低生產(chǎn)成本，是工業(yè)發(fā)酵過程中普遍采用的方法。朱玲燕等[8]發(fā)現(xiàn)通過在培養(yǎng)基中添加4種氨基酸可以提高Surfactin的產(chǎn)量，當添加L-亮氨酸時，其產(chǎn)量增加最顯著。黃翔峰等[9]發(fā)現(xiàn)當培養(yǎng)基中Fe2+的濃度達到5 mmol/L時，Surfactin的產(chǎn)量提高了9.5倍；Cooper等[10]發(fā)現(xiàn)較高濃度的Mn2+可以增加Surfactin的生物合成。

本研究室前期通過對枯草芽胞桿菌Bs916進行隨機突變，篩選發(fā)現(xiàn)△degU突變菌株B9△degU的Surfactin產(chǎn)量明顯提高，F(xiàn)engycin不再產(chǎn)生，隨后繼續(xù)突變Bacilimycin L合成基因bmyA，構建了單產(chǎn)Surfactin的工程菌株B9BD。本研究將以工程菌株B9BD為出發(fā)菌株，單因素篩選影響Surfactin產(chǎn)生的關鍵培養(yǎng)基成分，并通過 Plackett-Burman試驗、中心組合試驗（CCD）和響應曲面法（RSM），對培養(yǎng)基組分進行優(yōu)化，以期獲得更高的Surfactin產(chǎn)量，為Surfactin的高效發(fā)酵和產(chǎn)業(yè)化應用提供理論基礎和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和培養(yǎng)基

枯草芽胞桿菌Bacillus subtilisBs916及其工程菌株B9BD由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所水稻病害及防控實驗室保存。菌株Bs916和B9BD的活化和發(fā)酵種子液制備均采用LB培養(yǎng)基（胰蛋白胨10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L）。發(fā)酵主要使用基礎發(fā)酵培養(yǎng)基Bas（葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉浸膏3 g/L，NH4NO30.5 g/L，L-亮氨酸1 g/L，KH2PO41 g/L，NaCl 3 g/L，MgSO40.02 g/L，MnSO40.05 g/L）和Landy培養(yǎng)基[11]（葡萄糖20 g/L，L-谷氨酸鈉5 g/L，KH2PO41 g/L，KCl 0.5 g/L，MgSO40.5 g/L，MnSO45.0 mg/L，F(xiàn)eSO40.15 mg/L，CuSO40.16 mg/L，pH＝7.0）。本研究所用試劑均購買自上海生物工程有限公司。

1.2 搖瓶發(fā)酵試驗過程

從-70 ℃冰箱取出菌株Bs916和B9BD，在LB平板上活化，37 ℃靜置培養(yǎng)，挑取單胞接種于含有20 mL LB液體培養(yǎng)基的50 mL三角瓶中，30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)10～12 h，即為發(fā)酵種子液。調整種子液OD600＝1.0，以1%的接種量將種子液接種到含有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)36 h。

1.3 Surfactin的高效液相色譜檢測（HPLC）與含量計算

芽胞桿菌Bs916和工程菌株B9BD發(fā)酵后，取2 mL發(fā)酵液，12000 r/min離心5 min，上清液過0.22 μm濾膜，濾液進行高效液相色譜（HPLC）分析。從Sigma公司購買Surfactin標準樣品，配制不同濃度的Surfactin甲醇標準溶液，用HPLC進行檢測分析。根據(jù)峰面積與濃度的變化關系，制作Surfactin標準曲線，即Y（峰面積）＝11.163X（濃度）＋671.19，R2＝0.9953，用于計算菌株Bs916和B9BD發(fā)酵液中Surfactin含量。

HPLC分析采用C18柱（Sephasil Peptide C18 5 μm ST 4.6/250）；流動相A為乙腈（含0.1%三氟乙酸），流動相B為水（含0.1%三氟乙酸）；采用梯度檢測方法：0～25 min，60%乙腈（含0.1%三氟乙酸)和40%水（含0.1%三氟乙酸）；25～35 min, 70% 乙腈（含0.1%三氟乙酸）和30%水（含0.1%三氟乙酸）；35～60 min, 93% 乙腈（含0.1%三氟乙酸）和7%水（含0.1%三氟乙酸）；流速為0.8 mL/min，進樣量為10 μL，紫外檢測波長為210 nm，柱溫為30 ℃。

1.4 發(fā)酵培養(yǎng)基營養(yǎng)因子單因素篩選試驗

1.4.1 碳源對菌株B9BD合成Surfactin的影響 在基礎發(fā)酵培養(yǎng)基Bas其他成分不變，培養(yǎng)條件不變的情況下，以等量蔗糖替代葡萄糖，比較其對Surfactin產(chǎn)量的影響，試驗重復3次。

1.4.2 氮源對菌株B9BD合成Surfactin的影響 在基礎發(fā)酵培養(yǎng)基Bas其他成分不變，培養(yǎng)條件不變的情況下，比較不同氮源（有機氮和無機氮）對Surfactin產(chǎn)量的影響，試驗重復3次。具體處理如下：（a）用等量硫酸銨（SN）替代硝酸銨（AN）；（b）用等量硝酸銨（AN）替代蛋白胨（peptone）和牛肉浸膏（BE）；（c）將蛋白胨（peptone）含量變?yōu)?0.5 g/L，去掉硝酸銨（AN）；（d）用等量酵母粉（YE）替代牛肉浸膏（BE）；（e）去掉牛肉浸膏（BE），蛋白胨（peptone）含量變?yōu)?3 g/L；（f）去掉蛋白胨（peptone），牛肉浸膏（BE）含量變?yōu)?13 g/L；（g）將蛋白胨（peptone）替換成等量的黃豆粉（SM）或黃豆餅粉（SCM）。

1.4.3 金屬離子對菌株B9BD產(chǎn)生Surfactin的影響 在基礎發(fā)酵培養(yǎng)基Bas其他成分不變，培養(yǎng)條件不變的情況下，向培養(yǎng)基中分別添加CuSO4（終濃度為0.001 g/L）、CaCl2（終濃度為0.001 g/L）和FeSO4（終濃度為0.05 g/L），比較其對Surfactin產(chǎn)量的影響，試驗重復3次。

1.5 培養(yǎng)基組分關鍵因子篩選（Plackett-Burman）試驗設計

根據(jù)1.4部分發(fā)酵培養(yǎng)基單因素篩選試驗結果，采用Design-expert軟件進行Plackett-Burman搖瓶發(fā)酵試驗設計，從以下10個因素中篩選影響Surfactin產(chǎn)量的關鍵因子，試驗中每因素取“1”（高水平，范圍區(qū)間最大值）和“-1”（低水平，范圍區(qū)間最小值）兩水平，即葡萄糖10和20 g/L（A），黃豆粉10和20 g/L（B），牛肉浸膏1和3 g/L（C），NH4NO31和4 g/L（D），L-亮氨酸0.5和2 g/L（E），KH2PO41和3 g/L（F），NaCl 1和3 g/L（G），MgSO40和0.02 g/L（H），MnSO40和0.05 g/L（J），F(xiàn)eSO4 0.02和0.1 g/L（K）。試驗重復3次。

1.6 最陡爬坡試驗設計

根據(jù)Plackett-Burman（PB）試驗結果，綜合選出3個對Surfactin產(chǎn)量有顯著影響的培養(yǎng)基關鍵因子：葡萄糖；黃豆粉；L-亮氨酸。采用最陡爬坡試驗對3個關鍵因素的用量范圍進行摸索，確定合適的步長，為后續(xù)的中心組合試驗設計提供依據(jù)。

1.7 中心組合試驗（central composite design）設計

根據(jù)PB試驗和最陡爬坡試驗結果，利用中心組合試驗對葡萄糖、黃豆粉和L-亮氨酸進行3因素5水平試驗，依據(jù)其設計原理，分別按照軸向點α值為1.68179，角點值為1，設計5水平試驗（表1），共設20組，每組3個重復。

表1 關鍵培養(yǎng)基成分中心組合實驗設計各因素水平Table 1 Central composite experimental design of key Media composition

1.8 搖瓶發(fā)酵驗證

將菌株Bs916和工程菌株B9BD分別在LB培養(yǎng)基、Landy培養(yǎng)基、基礎發(fā)酵培養(yǎng)基Bas和優(yōu)化培養(yǎng)基opt進行發(fā)酵，比較Surfactin的產(chǎn)量，以驗證優(yōu)化培養(yǎng)基的效果，試驗3次重復。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基主要成分單因素篩選

2.1.1 碳源對工程菌株B9BD合成Surfactin的影響 有文獻報道，葡萄糖或蔗糖是最適合作為枯草芽胞桿菌產(chǎn)Surfactin的碳源[12]。本試驗結果表明，用蔗糖作為碳源，菌株B9BD產(chǎn)Surfactin的量下降，其產(chǎn)量為（247.49±18.88）mg/L，明顯低于葡萄糖作為碳源處理（圖1）。因此，后續(xù)將使用葡萄糖為發(fā)酵培養(yǎng)基碳源。

圖1 不同碳源對菌株B9BD產(chǎn)生Surfactin的影響Fig. 1 Effect of different carbon sources on the production of Surfactin byB. subtilisB9BD

2.1.2 氮源對工程菌株 B9BD合成 Surfactin的影響 不同氮源（有機氮和無機氮）對菌株 B9BD產(chǎn)生Surfactin能力的影響結果表明，當培養(yǎng)基中只含有硝酸銨時，菌株B9BD不具有產(chǎn)生Surfactin的能力；當培養(yǎng)基中含有兩種有機氮源組合時，更有利于Surfactin的合成；硝酸銨比硫酸銨更有利于Surfactin的合成；當把蛋白胨（Peptone）、牛肉浸膏（BE）、酵母粉（YE）、黃豆粉（SM）和黃豆餅粉（SCM）中的兩種有機氮源與硝酸銨（AN）或硫酸銨（SN）其中一種無機氮源進行三元組合后，菌株B9BD在三元組合的培養(yǎng)基中Surfactin的產(chǎn)量較高。菌株B9BD在黃豆粉等量替換蛋白胨后的組合（SM＋BE＋AN）培養(yǎng)基中Surfactin產(chǎn)量為（396.33±14.77） mg/L，而基礎培養(yǎng)基Bas（Peptone＋BE＋AN）的Surfactin產(chǎn)量為（414.96±23.09）mg/L；在5%水平，兩種培養(yǎng)基的Surfactin產(chǎn)量無顯著差異（圖2）。基于成本因素，本研究后續(xù)以黃豆粉作為主要氮源，輔助添加牛肉浸膏和硝酸銨為菌株B9BD發(fā)酵Surfactin的氮源。

圖2 不同氮源對菌株B9BD合成Surfactin的影響Fig. 2 Effects of different nitrogen sources on the production of Surfactin byB. subtilisB9BD

2.1.3 金屬離子對工程菌株B9BD合成Surfactin的影響 有文獻報道，金屬離子能促進芽胞桿菌Surfactin的合成[13]。由圖3所示，在培養(yǎng)基中添加 Fe2+能增加Surfactin的產(chǎn)量，達（461.10±16.47）mg/L，但在培養(yǎng)基中添加Cu2+和Ca2+后，Surfactin的產(chǎn)量反而下降。

圖3 不同金屬離子對菌株B9BD合成Surfactin的影響Fig. 3 Effect of different metal ions on the production of Surfactin byB. subtilisB9BD

2.2 Plackett-Burman試驗結果

基于單因素試驗和基礎培養(yǎng)基，選取10個培養(yǎng)基組分開展10因素2水平的Plackett-Burman試驗，共設計12組培養(yǎng)基，其發(fā)酵Surfactin的產(chǎn)量見表2。將試驗結果利用Design-expert軟件進行回歸分析和方差統(tǒng)計分析結果表明，PB試驗數(shù)據(jù)回歸分析所得各因子的回歸方程為Y＝331.64＋159.56A＋53.58B＋44.43C＋19.42D＋76.25E＋16.93F＋15.24G－34.10H－4.09J－14.23K，校正系數(shù)R2＝0.9992，式中Y為Surfactin產(chǎn)量的預測值。由校正系數(shù)可知Y的變化中99.92%能被回歸方程解釋。Design-expert對回歸模型的方差分析（表3）表明，回歸模型是顯著的（P＝0.0472），葡萄糖（A）、黃豆粉（B）和L-亮氨酸（E）是對菌株B9BD產(chǎn)生Surfactin具有顯著性影響（P＜0.05）的主要因子。因此，在后續(xù)的中心組合試驗設計中將以培養(yǎng)基成分（葡萄糖、黃豆粉和L-亮氨酸）作為研究對象進行進一步優(yōu)化。

表2 培養(yǎng)基成分部分因子Plackett-Burman試驗設計及試驗結果Table 2 Experimental design and response of Plackett-Burman of media composition

表3 培養(yǎng)基成分部分因子Plackett-Burman試驗設計的方差分析Table 3 Analysis of variance for Plackett-Burman design of media compositions

2.3 最陡爬坡試驗

最陡爬坡試驗的設計和響應值如表4所示，菌株B9BD在試驗設計的5組培養(yǎng)基中的Surfactin產(chǎn)量各不相同，且互相之間都具有顯著差異；其中第3組培養(yǎng)基組合的Surfactin產(chǎn)量最高，達831.21 mg/L，表明該組合的變量水平已接近最佳用量，可以作為中心組合試驗的中心點進行試驗。

表4 最陡爬坡試驗設計及測定值Table 4 The experimental design and results of the path of steepest ascent experiments

2.4 中心組合試驗及響應曲面分析

中心組合試驗設定各因素水平及測定值如表5所示，將試驗結果利用Design-expert軟件進行回歸分析和方差統(tǒng)計分析結果如表6所示。中心組合試驗數(shù)據(jù)回歸分析，獲得主要因子回歸方程為：Y＝864.91－18.64A＋34.95B＋14.59C－3.91AB－4.69AC＋9.78BC－98.20A2－48.46B2－40.48C2，校正系數(shù)R2＝0.9312，式中Y為Surfactin產(chǎn)量的預測值。模型的P值小于0.0001，表明該模型正確可靠，該菌株發(fā)酵產(chǎn)生的Surfactin量實際測定值與方程預測值存在顯著相關性。該模型變異系數(shù)CV為3.80%，小于10%，屬于弱變異，這進一步表明試驗數(shù)據(jù)的可靠性。缺失擬合項值為2.24，該回歸方程的失擬不顯著（P＞0.05），說明所建立的回歸方程擬合度較高，該模型可以用于預測Surfactin產(chǎn)量。

表5 中心組合試驗設計Surfactin產(chǎn)量測定值Table 5 The Experimental design and responses of central composite design

表6 培養(yǎng)基關鍵因素中心組合試驗回歸方程的方差分析Table 6 Analysis of variance of central composite design

葡萄糖、黃豆粉和L-亮氨酸影響菌株B9BD發(fā)酵Surfactin產(chǎn)量的響應曲面三維圖都有凸起的最高點，表明中心組合試驗建立的模型可以預測3個因素的最佳中心點，即可以確定3個變量的最優(yōu)值（圖4）。根據(jù)中心組合試驗回歸方程求得3個因素的最優(yōu)值，分別為葡萄糖24.27 g/L、黃豆粉29.05 g/L和L-亮氨酸2.36 g/L，Surfactin產(chǎn)量預測值為882.24 mg/L。由此，得到最優(yōu)培養(yǎng)基配方為：葡萄糖24.27 g/L、黃豆粉29.05 g/L、牛肉浸膏3 g/L、NH4NO34 g/L、L-亮氨酸2.36 g/L、KH2PO43 g/L、NaCl 3 g/L和FeSO40.02 g/L。

圖4 葡萄糖和黃豆粉（a）、葡萄糖和L-亮氨酸（b）、黃豆粉和L-亮氨酸（c）的響應曲面分析Fig. 4 Response surface curves showing the interface of the glucose, soybean meal and L-leucine

2.5 搖瓶發(fā)酵驗證

將菌株Bs916和B9BD在優(yōu)化培養(yǎng)基Opt進行搖培發(fā)酵試驗，并與Bas培養(yǎng)基、Landy培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基對比Surfactin產(chǎn)量結果表明，工程菌株B9BD在Opt培養(yǎng)基中Surfactin平均產(chǎn)量達（934.25±32.67）mg/L，是B9BD在Bas培養(yǎng)基中Surfactin產(chǎn)量的2.25倍，是B9BD在LB培養(yǎng)基和Landy培養(yǎng)基的5.6倍。野生菌株Bs916在Opt培養(yǎng)基中Surfactin產(chǎn)量為（334.37±19.25）mg/L，分別是Bas培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基和Landy培養(yǎng)基中Surfactin產(chǎn)量的2.0、4.7和4.8倍（圖5）。以上結果同時也表明，Opt培養(yǎng)基對工程菌株B9BD和野生型菌株Bs916產(chǎn)Surfactin都有顯著提升作用。

圖5 優(yōu)化培養(yǎng)基發(fā)酵Surfactin產(chǎn)量驗證Fig. 5 Verification of the Surfactin yeild in optimized medium

3 討論

Surfactin因其獨特的理化性質，在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥和食品加工等領域具有廣泛的應用前景[14-17]。目前，Surfactin不能進行有機合成，只能該通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)，因此，發(fā)酵工藝的優(yōu)化是提高Surfactin產(chǎn)量的重要環(huán)節(jié)。近年來，利用Design-expert軟件設計PB試驗和響應曲面法被廣泛應用于微生物發(fā)酵工藝的篩選和優(yōu)化[18,19]，如喬俊卿等[20]利用PB試驗和響應曲面分析法優(yōu)化了枯草芽胞桿菌T-500菌株產(chǎn)脂肽類抗生素的發(fā)酵工藝。本研究通過比較不同碳源、氮源和金屬離子對芽胞桿菌工程菌株B9ΔdegUΔbmyA（B9BD）產(chǎn)Surfactin能力的影響，初步確定了對菌株B9BD的Surfactin產(chǎn)量有重要影響的培養(yǎng)基成分，再通過PB試驗、中心組合試驗和響應曲面法，優(yōu)化獲得菌株B9BD產(chǎn)生Surfactin的高效發(fā)酵培養(yǎng)基配方，其搖培發(fā)酵產(chǎn)量可達934.25 mg/L。根據(jù)培養(yǎng)基各組分的價格，計算可知LB培養(yǎng)基每升的成本為6.37元，優(yōu)化培養(yǎng)基每升的成本為2.70元；菌株B9BD在LB培養(yǎng)基中發(fā)酵生產(chǎn)1 g Surfactin的培養(yǎng)基成本為38.13元，而在優(yōu)化培養(yǎng)基中的發(fā)酵培養(yǎng)基成本僅為2.88元，僅為LB培養(yǎng)基發(fā)酵成本的7.5%。

氮源在Surfactin生產(chǎn)過程中起著關鍵作用。為了提高Surfactin的產(chǎn)量，郅巖等[21]篩選的培養(yǎng)基中用到了蛋白胨和硝酸銨，王軍強等[22]的培養(yǎng)基中把牛肉膏和硝酸銨作為氮源，而湯穎秀等[23]篩選的培養(yǎng)基中只有硝酸銨一種氮源。本試驗中對多種氮源進行組合篩選發(fā)現(xiàn)，蛋白胨-牛肉浸膏-硝酸銨組合的效果是最好。其中蛋白胨是有機氮源，硝酸銨作為無機氮源，可以看作對有機氮源的補充，而少量添加牛肉浸膏，也使 Surfactin的產(chǎn)量進一步提高。此外，黃豆粉是工業(yè)生產(chǎn)上的一種廉價、易獲得氮源，本研究用黃豆粉替代蛋白胨，也可以達到相當?shù)男Ч?，這降低了發(fā)酵培養(yǎng)基的成本，有助于在工業(yè)上的大規(guī)模發(fā)酵。

氨基酸是Surfactin生物合成的重要前體，增加氨基酸供應對Surfactin的產(chǎn)生具有積極影響。通過PB試驗發(fā)現(xiàn)，L-亮氨酸是對Surfactin產(chǎn)量有顯著影響的培養(yǎng)基關鍵成分。有研究指出，通過增強亮氨酸代謝途徑，Surfactin的產(chǎn)量可以提高20.9倍[24]。王苗苗等[25]在THBS-2菌株搖瓶發(fā)酵過程中添加一定量的L-亮氨酸，Surfactin產(chǎn)量提高一倍左右。后期，我們將對氨基酸前體進行種類篩選和用量篩選，并作為補料進行中途補充，以驗證其對Surfactin產(chǎn)量的影響。

本研究只是對B9BD菌株產(chǎn)生Surfactin的發(fā)酵培養(yǎng)基成分進行了優(yōu)化，但發(fā)酵條件等還需要進一步研究，以期為工業(yè)上大規(guī)模生產(chǎn)提供理論依據(jù)。