田 中 樂，吳 文 忠，張 春 枝，吳 迪

(1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.大連醫(yī)諾生物有限公司，遼寧 大連 116600)

0 引 言

亮氨酸屬于支鏈氨基酸，是人體必需氨基酸中的一種。L－亮氨酸的生產(chǎn)方法有蛋白水解法、化學(xué)合成法、酶催化法、微生物發(fā)酵法等[1]。國內(nèi)L－亮氨酸的生產(chǎn)主要在天然蛋白水解液中提取，微生物直接發(fā)酵目前也已經(jīng)有中試生產(chǎn)的報(bào)道[2]。工業(yè)化的L－亮氨酸需要分離提純，一般的方法有離子交換法、沉淀法、乳狀液膜法及膜分離技術(shù)法[3－4]?？紤]到這些方法的處理量、純度、成本等問題，本文著重利用酶液水解L－亮氨酸異丁酯的方法來獲得高純的L－亮氨酸產(chǎn)品，并通過進(jìn)行正交試驗(yàn)對(duì)工藝參數(shù)的優(yōu)化來提高L－亮氨酸收率。

1 材料與方法

1.1 主要原料、試劑

L－亮氨酸(w＞98.5%)，湖北新生源生物工程公司；L－亮氨酸異丁酯，由L－亮氨酸制得；脂肪酶粉A，來源于試驗(yàn)室；脂肪酶DF“天野”15、脂肪酶G“天野”50、脂肪酶A“天野”6，日本天野酶公司；胰酶，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；木瓜蛋白酶，南寧龐博生物工程有限公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉、無水甲酸、高氯酸、冰醋酸、無水乙醇，分析純；甘氨酸，生化試劑。

1.2 酶液的制備

按不同pH配制緩沖液體系，將脂肪酶粉A投入到緩沖液中(m(脂肪酶粉A)／V(緩沖液)＝0.075g／mL，脂肪酶粉酶活為100 000U／g)，轉(zhuǎn)子攪拌提取20min，3 000r／min離心20min，傾倒出上清液即得試驗(yàn)所需脂肪酶液，4℃冰箱冷藏。

1.3 L－亮氨酸的制備

稱取L－亮氨酸異丁酯2.0g和適量的酶液，放置于一定溫度的搖床中，用L－亮氨酸的溶解度提前飽和反應(yīng)液，封口膜封口，170r／min搖床中反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束冷卻至室溫，過濾，無水乙醇洗滌，烘箱干燥得L－亮氨酸，稱量后計(jì)算L－亮氨酸收率。

1.4 L－亮氨酸含量測(cè)定

取試驗(yàn)所得L－亮氨酸約0.1g，精密稱定，加無水甲酸1mL溶解后加冰醋酸25mL，按照電位滴定法[5]，用高氯酸滴定液(0.1mol／L)滴定，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 不同酶對(duì)L－亮氨酸異丁酯水解效果的影響

分別用3種天野脂肪酶、木瓜蛋白酶、胰酶以及脂肪酶粉A的水提酶液對(duì)L－亮氨酸異丁酯進(jìn)行水解試驗(yàn)，反應(yīng)條件為：L－亮氨酸異丁酯質(zhì)量為2.0g，加入不同酶制成酶液25mL，反應(yīng)前用L－亮氨酸飽和(添加的溶解度按在25℃、100mL水中的溶解度2.3g，即每25mL酶液溶解0.575g L－Leu)，46 ℃、170r／min 搖 床 中 反 應(yīng)8h。由表1知，6種酶僅有胰酶及脂肪酶A對(duì)L－亮氨酸異丁酯具有水解作用。脂肪酶 A 水解L－亮氨酸異丁酯得到的L－亮氨酸收率最高，胰酶是混合酶，部分酶起作用時(shí)可能會(huì)伴隨副反應(yīng)，故選擇脂肪酶A進(jìn)行L－亮氨酸異丁酯的水解試驗(yàn)。

表1 不同酶對(duì)L－亮氨酸收率的影響Tab.1 Effect of different enzymes on the yield of L－leucine

2.1.2 緩沖液體系對(duì)L－亮氨酸收率的影響

在純水及 KH2PO4－NaOH、KH2PO4－K2HPO4、Gly－NaOH緩沖液體系條件下分別對(duì)脂肪酶粉A進(jìn)行溶解離心，物料比為1∶12.5，酶液先用L－亮氨酸飽和，加入L－亮氨酸異丁酯2.0g，48℃、170r／min搖床中反應(yīng)8h，考察緩沖液體系對(duì)L－亮氨酸收率的影響。如表2所示，4種緩沖體系所提酶液中，Gly－NaOH緩沖液體系水解L－亮氨酸異丁酯效果最好，用純水提取的酶液收率次之，并且反應(yīng)后生成的L－亮氨酸溶液中因沒有離子存在使其部分黏壁，處理較困難。選擇Gly－NaOH緩沖液體系(pH 9.4)水解L－亮氨酸異丁酯。

表2 緩沖液體系對(duì)L－亮氨酸收率的影響Tab.2 Effect of different buffer systems on the yield of L－leucine

2.1.3 物料比對(duì)L－亮氨酸收率的影響

通過確定底物L(fēng)－亮氨酸異丁酯的質(zhì)量、改變酶液用量的方法來調(diào)整物料比。L－亮氨酸異丁酯質(zhì)量為2.0g，分別加入15，18，20，25，30mL的酶液，即L－亮氨酸異丁酯與水的物料比為1∶7.5，1∶9，1∶10，1∶12.5及1∶15。酶液先用L－亮氨酸溶解度飽和，反應(yīng)溫度為48℃，170r／min搖床中反應(yīng)8h，考察物料比對(duì)L－亮氨酸收率的影響。由圖1可知，當(dāng)物料比從1∶10到1∶12.5時(shí)，L－亮氨酸的收率由低到高的過程，在物料比增至1∶15時(shí)，收率增加不大?？紤]到最優(yōu)的酶液總量，需滿足最適的底物濃度，選擇L－亮氨酸異丁酯的水解反應(yīng)的物料比為1∶12.5。

圖1 物料比對(duì)L－亮氨酸收率的影響Fig.1 Effect of material ratio on the yield of L－leucine

2.1.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)L－亮氨酸收率的影響

L－亮氨酸異丁酯初始被水解時(shí)，很長時(shí)間都保持油狀，為了獲得較為準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，選擇從8h開始。在L－亮氨酸異丁酯為2.0g、物料比為1∶12.5、酶液先用L－亮氨酸飽和、48℃、170r／min的條件下，考察不同的反應(yīng)時(shí)間下L－亮氨酸收率。由圖2可知，L－亮氨酸異丁酯在水解過程中，隨著時(shí)間的增加，L－亮氨酸的收率逐漸增加，12h時(shí)收率達(dá)到89.23%。繼續(xù)增加時(shí)間，L－亮氨酸收率基本不增加，所以選擇最佳反應(yīng)時(shí)間為12h。

圖2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)L－亮氨酸收率的影響Fig.2 Effect of reaction time on the yield of L－leucine

2.1.5 反應(yīng)溫度對(duì)L－亮氨酸收率的影響

在L－亮氨酸異丁酯為2.0g，加入25mL的L－亮氨酸飽和后酶液，搖轉(zhuǎn)速為170r／min，反應(yīng)溫度分別為44、46、48、50、54℃條件下反應(yīng)12h，考察反應(yīng)溫度對(duì)L－亮氨酸收率的影響。如圖3所示，在44～50℃時(shí)，L－亮氨酸收率呈增加趨勢(shì)，溫度到達(dá)54℃時(shí)，L－亮氨酸的收率大幅度減小。溫度過低時(shí)，脂肪酶水解速率較慢，溫度過高時(shí)酶容易加快變性，所以選擇反應(yīng)溫度為50℃較合適。

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)L－亮氨酸收率的影響Fig.3 Effect of reaction temperature on the yield of L－leucine

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用L9(34)正交表，以L－亮氨酸收率為指標(biāo)，因素水平和正交試驗(yàn)結(jié)果及分析分別見表3、4。從表3、4可以看出，影響L－亮氨酸收率的因素順序?yàn)榱弦罕?、反?yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間，最佳的組合為C3A2B3，即料液比為1∶13，反應(yīng)溫度為50℃，反應(yīng)時(shí)間為13h。

2.2.2 驗(yàn)證性試驗(yàn)

采用正交試驗(yàn)確定最佳的脂肪酶A水解L－亮氨酸異丁酯的工藝條件，以L－亮氨酸收率為指標(biāo)，進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)。3個(gè)平行反應(yīng)結(jié)果表明，在此條件下L－亮氨酸的收率為95.23%。

表3 正交試驗(yàn)因素水平表Tab.3 Level table of orthogonal exprimental design

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析Tab.4 Result of analysis of orthogonal exprimental

3 結(jié) 論

通過不同酶作催化劑水解L－亮氨酸異丁酯，發(fā)現(xiàn)脂肪酶A對(duì)L－亮氨酸異丁酯水解效果最好。通過單因素及正交試驗(yàn)獲得了最佳的工藝參數(shù)：以L－亮氨酸異丁酯為原料，選擇Gly－NaOH緩沖液體系提取脂肪酶液，用L－亮氨酸溶解度的質(zhì)量飽和酶液，搖床轉(zhuǎn)速為170r／min，物料比為1∶13，反應(yīng)溫度為50℃，反應(yīng)時(shí)間13h。L－亮氨酸的收率為95.23%。對(duì)所得到的L－亮氨酸進(jìn)行含量測(cè)定，測(cè)定其純度為99.80%。該方法制備的L－亮氨酸產(chǎn)品色澤光亮，純度好，L－亮氨酸收率高。

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