趙雨萌，繆佩佩，王旭東，高坦坦，史曉藝，賈紹雷，任爭(zhēng)光，趙曉燕

（北京農(nóng)學(xué)院生物與資源環(huán)境學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206）

草莓原產(chǎn)于南美洲，在世界范圍內(nèi)廣泛種植，草莓果實(shí)味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，深受百姓喜愛。中國(guó)是世界上草莓生產(chǎn)大國(guó)之一，自1994年起產(chǎn)量始終居于世界第一，占全世界總產(chǎn)量的1/3[1]。隨著草莓種植產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，草莓病害頻頻發(fā)生，如草莓根腐病、草莓白粉病、草莓炭疽病等，草莓的產(chǎn)量和品質(zhì)受到不同程度的影響[2]。正確運(yùn)用化學(xué)防治、農(nóng)業(yè)防治、生物防治等技術(shù)，能夠有效預(yù)防和控制病害的發(fā)生[3]。試驗(yàn)報(bào)道，枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis按 4050 g/hm2用量單獨(dú)使用，對(duì)草莓白粉病的防治效果達(dá)92.09%[4]。貝萊斯芽胞桿菌B. velezensisZZBV-3可有效防治草莓根腐病，盆栽防治效果可達(dá) 77.96%和81.18%[5]。以生防菌為產(chǎn)品的生物防治已經(jīng)成為備受關(guān)注且有明顯效果的技術(shù)之一[6]。

解淀粉芽胞桿菌B. amyloliquefaciens作為一種被廣泛應(yīng)用的生防菌，具有抑菌譜廣、防病效果好等特點(diǎn)[7]，解淀粉芽胞桿菌能夠分泌多種酶類如蛋白酶、幾丁質(zhì)酶等，也能分泌一些抗菌肽等抑菌物質(zhì)，可以拮抗多種病原物[8]。同時(shí)，解淀粉芽胞桿菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物不僅能夠影響土壤中微生物的種群結(jié)構(gòu)，促進(jìn)根際微生物趨向有利生長(zhǎng)的方向轉(zhuǎn)變，還能夠改善土壤酶活性，增強(qiáng)土壤肥力，有利于土壤環(huán)境的健康發(fā)展[9]。

良好的土壤環(huán)境條件能夠促進(jìn)植物的生長(zhǎng)和發(fā)育，是植物生存發(fā)育的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的樞紐[10]。土壤酶參與各種養(yǎng)分的合成和釋放、有機(jī)質(zhì)的循環(huán)利用以及不同方向的生理生化反應(yīng)過程，土壤酶活性的高低直接影響土壤肥力的大小和土壤微生態(tài)環(huán)境，進(jìn)而影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育[11]。

為了探究解淀粉芽胞桿菌對(duì)土壤酶活性的影響以及對(duì)草莓的防病促生作用，本試驗(yàn)通過解淀粉芽胞桿菌TR2對(duì)草莓的田間灌根處理，在不同時(shí)期采集土壤進(jìn)行酶活測(cè)定，監(jiān)測(cè)酶活的變化趨勢(shì)和差異，同時(shí)對(duì)草莓根長(zhǎng)、根重、葉面積、新葉數(shù)和果實(shí)數(shù)量、最大單果重等生長(zhǎng)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行測(cè)量，調(diào)查生長(zhǎng)階段草莓根腐病的發(fā)生率，為闡明生防解淀粉芽胞桿菌對(duì)土壤酶活性的影響及其防病促生作用機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

解淀粉芽胞桿菌Bacillus amyloliquefaciensTR2由北京農(nóng)學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室保存。

草莓品種：紅顏；栽培方式：溫室起壟栽培。

LA（固體）培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，瓊脂15 g，水1000 mL。

LB（液體）培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，水1000 mL。

1.2 方法

1.2.1 生防菌的發(fā)酵 取出-80 ℃冰箱中保存的解淀粉芽胞桿菌TR2，在LA平板上進(jìn)行劃線分離活化，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。取活化后的TR2單菌落在裝有5 mL 液體LB培養(yǎng)基的試管中進(jìn)行小量過夜搖培，溫度37 ℃、轉(zhuǎn)速220 r/min，然后按1:100的比例接種到裝有100 mL LB液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中進(jìn)行大量搖培發(fā)酵，條件同前，發(fā)酵培養(yǎng)48 h，使菌液濃度達(dá)到2×108CFU/mL。

1.2.2 田間灌根處理 溫室草莓定植一周（2020年9月18日）后，將發(fā)酵菌液稀釋成60倍液進(jìn)行灌根處理。溫室為東西向起壟，共8壟，中間的6壟為試驗(yàn)區(qū)域（如圖1所示），分為TR2處理區(qū)與對(duì)照處理區(qū)，每壟為一個(gè)重復(fù)，共6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)25株，處理之間間隔區(qū)為10株苗。每株灌根稀釋后的菌液100 mL，對(duì)照組澆灌同樣稀釋60倍的LB培養(yǎng)基100 mL。在第7 d重復(fù)灌根一次加強(qiáng)處理。

圖1 田間處理圖示Fig. 1 The design of the field trial

1.2.3 樣品采集 分別在第一次灌根后的第1、7、15、30、60 d進(jìn)行樣品采集，取樣時(shí)每壟取兩株草莓，包括植株與根系周圍直徑5 cm范圍，深至主根系末端的土壤，隨后在4 ℃冰箱內(nèi)妥善保存。

1.2.4 土壤酶活測(cè)定 試驗(yàn)共測(cè)定4種草莓土壤酶活性，其中土壤脲酶活性測(cè)定采用苯酚納比色法，土壤過氧化氫酶活性測(cè)定采用高錳酸鉀滴定法，土壤蔗糖酶進(jìn)行活性測(cè)定采用3,5-二硝基水楊酸比色法，土壤磷酸性酶活性測(cè)定采用磷酸苯二鈉比色法，分為酸性磷酸酶和堿性磷酸酶兩種活性[12-14]。

1.2.5 草莓生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定 充分清洗植株根系后，測(cè)量草莓的根長(zhǎng)、根重、葉面積和新葉數(shù)（指除移栽前的老葉之外的葉片）等相關(guān)生長(zhǎng)數(shù)據(jù)。

草莓葉面積采用吐德拉草莓葉面積法進(jìn)行估算，取每個(gè)植株最大的葉片測(cè)量葉片寬度，計(jì)算公式[15]如下：葉面積y＝7.0918x－13.4784，x為葉寬，單位cm。

待果實(shí)成熟后（定植后90 d）采收，記錄單株草莓中已成熟的果實(shí)數(shù)量，并利用電子天平稱量單株草莓的最大單果重量。

1.2.6 草莓根腐病發(fā)病率和防效調(diào)查 在第一次施藥后第7、15、30和60 d時(shí)調(diào)查田間TR2處理區(qū)和對(duì)照區(qū)草莓根腐病的發(fā)病情況，統(tǒng)計(jì)草莓死苗數(shù)量計(jì)算發(fā)病率，并計(jì)算解淀粉芽胞桿菌TR2對(duì)草莓根腐病的防治效果。死苗率（%）＝死苗株數(shù)/總調(diào)查株數(shù)×100，防效（%）＝（對(duì)照死苗率－處理死苗率）/對(duì)照死苗率×100。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2007和SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，應(yīng)用ANOVA單因素（LSD法）進(jìn)行TR2處理組和對(duì)照組的差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 解淀粉芽胞桿菌TR2對(duì)土壤酶活性的影響

解淀粉芽胞桿菌TR2處理對(duì)草莓土壤酶活性的影響如圖2所示，在60 d的試驗(yàn)過程中，土壤的各種酶活性都呈上升的趨勢(shì)，包括脲酶、過氧化氫酶、蔗糖酶、磷酸酶等，而且TR2處理的土壤酶活高于對(duì)照，說明解淀粉芽胞桿菌TR2處理對(duì)草莓土壤的4種酶活性都有促進(jìn)作用。

圖2 解淀粉芽胞桿菌TR2對(duì)土壤酶活性的影響Fig. 2 Effect ofBacillus amyloliquefaciensTR2 on soil enzyme activity

解淀粉芽胞桿菌TR2處理對(duì)草莓土壤脲酶活性和蔗糖酶活性的促進(jìn)作用較好。其中對(duì)脲酶的促進(jìn)作用表現(xiàn)最早且延續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，在第7、15、30和60 d，TR2處理的草莓土壤脲酶活性與對(duì)照有顯著差異，比對(duì)照分別高出148%、44%、215%和39%，其中第30 d時(shí)的促進(jìn)作用最好（圖2A）。解淀粉芽胞桿菌TR2處理從第15 d開始表現(xiàn)對(duì)草莓土壤蔗糖酶活性的明顯促進(jìn)作用，在第15、30和60 d，TR2處理的草莓土壤蔗糖酶活性比對(duì)照分別高出33%、124%和44%，差異顯著，其中第30 d時(shí)的促進(jìn)作用最好（圖2B）。

解淀粉芽胞桿菌TR2處理對(duì)草莓土壤過氧化氫酶活性的促進(jìn)作用表現(xiàn)比較晚，從第30 d開始處理與對(duì)照的差異具有顯著性，第30 d和第60 d比對(duì)照組分別高出38%和43%，其中在第60 d時(shí)的促進(jìn)作用最好（圖2C）。

土壤磷酸酶分酸性磷酸酶和堿性磷酸酶兩種形式，在第15 d和第60 d時(shí)，解淀粉芽胞桿菌TR2處理對(duì)草莓兩種土壤磷酸酶活性的促進(jìn)作用具有顯著性。在第15 d時(shí)，TR2處理的土壤酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性分別比對(duì)照高出69%和45%；在第60 d時(shí)，TR2處理的土壤酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性分別比對(duì)照高出27%和49%。綜合來看，TR2處理在第15 d時(shí)對(duì)土壤磷酸酶的促進(jìn)作用最好（圖2D）。

2.2 解淀粉芽胞桿菌TR2對(duì)草莓生長(zhǎng)的影響

解淀粉芽胞桿菌TR2對(duì)草莓生長(zhǎng)的影響如圖3和表1所示，在60 d的試驗(yàn)過程中，處理組草莓的各種生長(zhǎng)指標(biāo)都大于對(duì)照組，包括草莓根長(zhǎng)、根重、草莓新葉數(shù)和最大葉面積，草莓的單株成熟果實(shí)數(shù)量和最大單果重量等，說明解淀粉芽胞桿菌TR2對(duì)草莓的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。

圖3 解淀粉芽胞桿菌TR2對(duì)草莓植株生長(zhǎng)的影響Fig. 3 Effect ofBacillus amyloliquefaciensTR2 on strawberry growth

表1 解淀粉芽胞桿菌TR2對(duì)草莓果實(shí)生長(zhǎng)的影響Table 1 Effect ofB.amyloliquefaciensTR2 on strawberry fruit growth

在定植后90 d試驗(yàn)調(diào)查時(shí)，單株成熟果實(shí)數(shù)與最大單果重都與對(duì)照有顯著差異，處理組單株的成熟果實(shí)平均比對(duì)照多將近4個(gè)，平均最大單果重是對(duì)照的兩倍（表1），說明解淀粉芽胞桿菌TR2能夠有效促進(jìn)果實(shí)的成熟，提前果實(shí)的成熟時(shí)間，也能夠有效增加果實(shí)的重量。

解淀粉芽胞桿菌TR2處理從第7 d開始就表現(xiàn)對(duì)草莓根部生長(zhǎng)的促進(jìn)作用，第7、30、60 d的根長(zhǎng)和7～60 d的根重都與對(duì)照有顯著差異，對(duì)根長(zhǎng)的促進(jìn)作用在20%左右；對(duì)根重的促進(jìn)作用更好，第60 d時(shí)，處理組根重比對(duì)照組高出92%。解淀粉芽胞桿菌TR2處理對(duì)地上部分生長(zhǎng)的促進(jìn)作用從第15 d以后開始顯現(xiàn)，第15 d和第30 d的最大葉面積和新葉數(shù)都與對(duì)照有顯著差異，15 d時(shí)平均最大葉面積比對(duì)照大10 cm2，第30 d時(shí)平均每株比對(duì)照多長(zhǎng)出1.2個(gè)新葉。

2.3 解淀粉芽胞桿菌TR2對(duì)草莓根腐病的防病作用

在試驗(yàn)過程中，田間草莓根腐病的發(fā)生率在20%以內(nèi)，解淀粉芽胞桿菌TR2處理組草莓根腐病的發(fā)病率始終低于對(duì)照組，在15～60 d處理組的死苗率與對(duì)照組都有顯著差異，防效在25%左右（表2）。說明解淀粉芽胞桿菌TR2灌根處理可以減少草莓根腐病的發(fā)生，具有較好的防病作用。

表2 解淀粉芽胞桿菌TR2對(duì)草莓根腐病的防病作用Table 2 Control effect ofB.amyloliquefaciensTR2 on strawberry root rot

3 討論

土壤酶活性是土壤的重要理化指標(biāo)，一般認(rèn)為，土壤環(huán)境中土壤酶的活性程度越高，土壤肥力越高[16,17]。本研究結(jié)果表明，解淀粉芽胞桿菌TR2處理后對(duì)草莓根際周圍土壤的脲酶、淀粉酶、過氧化氫酶及磷酸酶等4種酶活性均具有促進(jìn)作用，同時(shí)表現(xiàn)出對(duì)根長(zhǎng)、根重、葉片生長(zhǎng)以及果實(shí)生長(zhǎng)與成熟的促進(jìn)作用，說明解淀粉芽胞桿菌TR2的促生作用可能與其能夠提高土壤酶活性，從而提高了土壤的肥力有關(guān)。

土壤酶活性與土壤中的氮素循環(huán)、碳素循環(huán)、微生物的量及活性密切相關(guān)[18-21]。本研究結(jié)果表明，解淀粉芽胞桿菌TR2從第7 d開始就陸續(xù)對(duì)脲酶、淀粉酶、過氧化氫酶及磷酸酶等4種酶活性表現(xiàn)明顯促進(jìn)作用，并且到第60 d時(shí)仍然對(duì)4種酶活性具有明顯的促進(jìn)作用，促進(jìn)作用的持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)。趙艷等[22]研究表明施用膠質(zhì)芽胞桿菌菌劑對(duì)黑麥草根際土壤脲酶、磷酸酶及過氧化氫酶活性在苗期、中期和收獲期均高于對(duì)照，也表現(xiàn)出比較長(zhǎng)期的促進(jìn)作用。而高吉坤等[23]研究的枯草芽胞桿菌B29對(duì)黃瓜根際土壤脲酶、過氧化氫酶、蔗糖酶和磷酸酶活性的促進(jìn)作用僅在0～20 d期間內(nèi)比較明顯，到第30 d或40 d時(shí)與對(duì)照沒有明顯差異。由此可見，生防菌的施用能有利于土壤酶活性的提高，但是不同菌株對(duì)土壤酶活的促進(jìn)能力不同。

解淀粉芽胞桿菌TR2是一株對(duì)多種病原菌具有抑菌活性的菌株，前期研究表明該菌株能夠減輕西瓜枯萎病的發(fā)生，并且具有較好的解磷解鉀能力[24]；本研究進(jìn)一步證明了該菌株可以促進(jìn)草莓土壤的酶活性和草莓的生長(zhǎng)，減少田間草莓根腐病的發(fā)生，因此該菌株是一株具有良好潛力的土傳病害生防菌株，具有較好的應(yīng)用前景。一般認(rèn)為，生防菌對(duì)植物病害的防病機(jī)制主要有拮抗作用、促生作用、誘導(dǎo)抗性作用以及對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的調(diào)控作用[25]。本研究雖然明確了解淀粉芽胞桿菌TR2對(duì)土壤酶活性的促進(jìn)作用，但對(duì)于與土壤酶活性密切相關(guān)的土壤中微生物的量與群落結(jié)構(gòu)的變化，以及之間的關(guān)系并不清楚。因此，繼續(xù)開展該菌株在草莓根際的定殖動(dòng)態(tài)以及對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)調(diào)控作用的研究，進(jìn)一步明確該菌株的生防機(jī)制，為更好地開發(fā)和應(yīng)用該菌株打下基礎(chǔ)。