劉曉萌，蘇振賀，宣立峰，王培培，董麗紅，郭慶港*，馬 平

（1. 河北省農林科學院植物保護研究所/河北省農業(yè)有害生物綜合防治工程技術研究中心/農業(yè)部華北北部作物有害生物綜合治理重點實驗室，保定 071000；2. 河北省農林科學院石家莊果樹研究所，石家莊 050061）

由灰葡萄孢菌Botrytis cinerea引起的番茄灰霉病在設施栽培環(huán)境下發(fā)生普遍、危害嚴重，成為制約設施番茄健康發(fā)展的主要障礙[1,2]。由于缺乏抗病品種，目前化學殺菌劑依然是防治番茄灰霉病的主要措施[3]，但長期大量的施用化學殺菌劑容易引起病原菌產生抗藥性[4]。目前已有報道表明，灰葡萄孢菌對嘧霉胺表現(xiàn)高抗，對腐霉利、咯菌腈的抗性也在逐年提高[5]。抗藥性菌株的出現(xiàn)降低了化學殺菌劑的防治效果，因此，農民不得不頻繁、大量地施用化學殺菌劑，由此所帶來的農藥殘留和環(huán)境污染問題日益嚴重。國內外研究證明，微生物殺菌劑是防治作物病害行之有效和環(huán)境友好的措施之一[6]。針對番茄灰霉病，目前國內外已獲得一些具有開發(fā)前景的生防菌株。地衣芽胞桿菌Bacillus licheniformisW10菌株和多粘類芽胞桿菌Bacillus polymyxaW3菌株不僅對灰霉菌具有較強的抑菌活性，同時能有效防治番茄灰霉病[7]。Lee等[8]以地衣芽胞桿菌B. licheniformisN1為活性成分，研制了不同的微生物制劑，發(fā)現(xiàn)可濕性粉劑能更好的發(fā)揮防治番茄灰霉病的效果。生防菌防治作物氣傳病害的機制包括產生抑菌活性物質直接殺死或抑制病原菌生長；通過占據葉面的氣孔或營養(yǎng)位點，與病原菌競爭空間和營養(yǎng)；誘導植物產生系統(tǒng)抗病性等[9]。張玉勛等[10]研究發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌M9在番茄葉片上的定殖能力較強，對灰霉病的防效較高，而定殖能力較差的M11和M15菌株則防效較差。由此可見，生防菌在植物組織上的定殖能力成為其防治灰霉病的重要機制之一[11]，因此有必要對生防菌在葉面的定殖數(shù)量進行檢測。以往主要通過抗生素馴化結合菌落計數(shù)法對靶標微生物進行定量檢測，但該方法所需時間長，并且容易出現(xiàn)假陽性[12]。近年來，隨著分子生物學技術，尤其是實時定量PCR技術（Real-time PCR）的出現(xiàn)，使得定量檢測不同環(huán)境中的微生物數(shù)量成為可能，目前熒光定量PCR技術被廣泛應用于細菌的分子檢測[13]。熒光定量PCR技術分為熒光染料法（SYBR）和TaqMan探針法，而后者的靈敏度和特異性更高。楊健等[14]根據芽胞桿菌gyrB基因序列設計特異性引物，利用熒光定量PCR技術開展了牛乳中蠟樣芽胞桿菌Bacillus cereus的定量檢測。Scortichini等[15]根據16S rDNA序列設計了針對榛黃假單胞菌Pseudomonas avellanae的特異性引物和探針，建立了榛黃假單胞菌P avellanae的定量檢測體系，開展了該病原細菌在榛子樹上的定殖檢測。目前的研究多針對某個屬或者種的微生物進行定量檢測，但針對某個特定菌株開展定量檢測的報道較少，主要原因是缺乏針對特定菌株的特異性引物或探針。隨著全基因組測序技術的快速發(fā)展，越來越多的微生物公布了全基因組序列。通過對靶標微生物全基因組序列進行比對分析，可獲得靶標微生物的特異性基因序列，據此可獲得針對靶標微生物的特異性引物或探針[8]。

枯草芽胞桿菌B. subtilisHMB19198菌株能有效防治番茄灰霉病，目前已獲得HMB19198菌株全基因組序列（結果未發(fā)表），以該菌株為活性的微生物殺菌劑正處于新農藥登記階段。本研究通過對HMB19198菌株全基因組序列進行比對分析，獲得 HMB19198菌株的特異性基因序列，基于此序列，設計出針對HMB19198菌株的特異性引物和探針，建立了HMB19198的熒光定量PCR定量檢測技術，利用該技術對HMB19198菌株在番茄葉片上的定殖動態(tài)進行了檢測。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

枯草芽胞桿菌 HMB19198菌株（國家發(fā)明專利：ZL201610879296.8）在含有 30%甘油的 LB（Luria Bertani）培養(yǎng)基中于-80 ℃長期保存，使用前在LB固體培養(yǎng)基上37 ℃活化。

1.2 菌株HMB19198特異性引物和TaqMan探針的設計

目前已獲得 HMB19198菌株的全基因組序列及全部的開放閱讀框序列。將所有開放閱讀框序列在NCBI（National Center for Biotechnology Information）進行批量比對，篩選該菌株獨有基因。利用Primer Premier 5.0軟件在該基因內部設計特異性檢測菌株HMB19198的上下游引物和探針，引物由金唯智公司合成，探針由賽默飛公司合成，探針的5′端標記FAM，3′端標記MGB。

1.3 引物和探針的特異性驗證

利用細菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取32株枯草芽胞桿菌及其近緣種菌株DNA；利用新型植物基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取番茄葉片DNA，細菌和番茄葉片DNA均用無菌水稀釋為10 ng/μL。利用菌株HMB19198特異性引物和探針進行熒光定量PCR分析，以菌株HMB19198基因組DNA為陽性對照，以番茄葉片DNA為陰性對照，無菌水為空白對照，每個處理3次重復。熒光定量PCR擴增條件為Probe qPCR Mix 10 μL，特異性引物（10 μmol/L）各 0.4 μL，TaqMan 探針（5 μmol/L）0.4 μL，模板 DNA 2 μL，用無菌 ddH2O 補足至 20 μL。擴增的反應程序為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 S，58 ℃ 45 S，40個循環(huán)。

1.4 引物和探針的靈敏性檢測

利用HMB19198菌株特異性引物對HMB19198基因組DNA進行PCR擴增，擴增片段插入到pMD19-T載體，經PstI限制性內切酶線性化后進行系列梯度稀釋，獲得101～107拷貝/μL的DNA稀釋液。以系列稀釋液為模板進行熒光定量PCR擴增，擴增條件同1.3部分。以質?？截悢?shù)的對數(shù)值為橫坐標，以熒光定量PCR循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）為縱坐標，建立標準曲線。

1.5 番茄葉片DNA對擴增效率和檢測靈敏性的影響

為檢測番茄葉片DNA對熒光定量PCR擴增效率的影響，本研究利用1 ng/μL的番茄葉片DNA稀釋液對1.4部分中的線性化質粒進行10倍系列稀釋，獲得101～107拷貝/μL的靶標DNA稀釋液。以含有不同拷貝數(shù)DNA的稀釋液為模板進行熒光定量PCR擴增，以質粒拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標，以熒光定量PCR循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）為縱坐標，建立擴增曲線。通過與標準曲線進行比較分析，明確番茄葉片DNA對擴增效率和檢測靈敏性的影響。

1.6 菌株HMB19198在葉片定殖能力檢測

1.6.1 菌落計數(shù)法分析菌株HMB19198在番茄葉片上的定殖動態(tài) 將HMB19198菌株在LB液體培養(yǎng)基中37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，離心收集菌體并用無菌水調整菌體濃度為108cfu/mL。用小型噴霧器將HMB19198菌體懸浮液均勻地噴灑在4片真葉期的番茄（品種為合作918）葉片上，分別于0（葉片干燥后立即取樣）、2、4、6和8 d采集葉片。稱取0.5 g葉片，在滅菌研缽中充分研磨，加入10 mL無菌水充分混勻，雙層滅菌紗布過濾，過濾液10倍梯度稀釋，取100 μL稀釋液涂布于LB培養(yǎng)基上，37 ℃過夜培養(yǎng)，次日根據HMB19198菌株的形態(tài)特征，統(tǒng)計HMB19198菌落數(shù)，計算單位質量葉片上含有的HMB19198菌體數(shù)量（cfu/g葉片）。

1.6.2 熒光定量PCR技術分析HMB19198菌株在番茄葉片上的定殖動態(tài) 將108cfu/mL菌株HMB19198懸浮液均勻的噴施在4片真葉期的番茄葉片上，分別于0、2、4、6 d和8 d采集葉片。稱取0.5 g葉片，利用新型植物基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取番茄葉片DNA，具體操縱步驟參照試劑盒說明書進行。將DNA稀釋為10 ng/μL，取2 μL進行熒光定量PCR分析，根據方法1.5中構建的擴增曲線，計算單位質量番茄葉片上HMB19198的濃度（拷貝/g葉片）。

1.7 菌株HMB19198防治番茄灰霉病的持效期

將108cfu/mL的HMB19198菌體懸浮液均勻地噴灑在4片真葉期的番茄葉片上，分別于0、2、4、6和8 d采集大小和葉齡一致的健康葉片，用脫脂棉包裹住葉柄，放入鋪有濾紙的玻璃皿中，濾紙和脫脂棉都滴加適量無菌水保持濕潤，番茄葉片中央接種直徑5 cm的灰霉菌餅，以不噴灑HMB19198接種灰霉菌餅的番茄葉片作為對照。培養(yǎng)皿置于25 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，之后采用十字交叉法測定病斑大小，計算病斑面積（長×寬）。不同處理對番茄灰霉病的防治效果（%）＝（對照病斑面積－處理病斑面積）/對照病斑面積×100。

1.8 數(shù)據統(tǒng)計與分析

本試驗數(shù)據采用Microsoft Excel 2010進行整理，IBM SPSS Statistics Version 20進行單因素方差分析，并且使用Duncan法進行顯著性檢驗（P＜0.05），采用Origin Pro 8.6進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 序列比對結果

將菌株HMB19198全基因組序列在NCBI數(shù)據庫中進行序列比對，發(fā)現(xiàn)該菌株存在一段獨有基因片段，該基因功能未知，全長102 bp（Genbank序列號：OK086768），BLAST分析沒有發(fā)現(xiàn)同源序列。其上游開放式閱讀框（HMB19198-608）和下游開放式閱讀框（HMB19198-608）均為功能未知蛋白（圖1）。根據HMB19198菌株特異性基因片段設計特異性引物19198F（5'-ATGTGTATAATAAGAAAAGTCGAATTG GAA-3'）/19198R（5'-TCATTTGATGTTGAAGTCAAGAAGT-3'）和TaqMan探針（5'-AACATTC GAAAAACATTCGAAAAACATTC-3'），引物和探針位點見圖1。

圖1 枯草芽胞桿菌HMB19198特異性引物和探針的位點及序列Fig. 1 Schematic diagram ofB.subtilisHMB19198 specific gene cluster and the sequences of specific primers andTaqMan probe

2.2 引物和探針的特異性驗證

利用菌株HMB19198的特異性引物和探針，對32株芽胞桿菌基因組DNA進行熒光定量PCR擴增。結果表明，以菌株HMB19198基因組DNA為模板可以獲得較強的擴增信號（Ct值＝21.66），而以其他31株芽胞桿菌基因組DNA為模板不能獲得擴增信號。以番茄葉片基因組DNA為模板也不能獲得擴增信號，而番茄葉片基因組DNA中加入相同濃度的菌株HMB19198基因組DNA后可以獲得較強的擴增信號（Ct值＝24.30）。以上結果證明，本研究所設計的引物和探針針對菌株HMB19198具有較高的特異性。

2.3 標準曲線的建立

將含有菌株HMB19198特異性片段的線性化質粒系列稀釋，以101～107拷貝/μL的質粒稀釋液為模板，進行熒光定量PCR擴增，繪制標準曲線。標準曲線的線性方程為y＝-3.4552x＋41.188，擴增效率為94.7%，相關系數(shù)為R2＝0.9902，檢測閾值為101拷貝/μL（圖2a）。為驗證番茄葉片DNA是否抑制HMB19198菌株特異性片段的檢測，本研究利用番茄葉片DNA稀釋液對線性化質粒進行稀釋，利用稀釋液進行熒光定量PCR擴增，獲得擴增曲線。擴增曲線的線性方程為y＝-3.1881x＋41.634，擴增效率為105.9%，相關系數(shù)R2＝0.9879，檢測閾值為102拷貝/μL。同以線性化質粒為模板構建的標準曲線相比，加入番茄葉片DNA后體系的擴增效率沒有降低，但檢測靈敏度降低了10倍（圖2b）。

圖2 無菌水（a）和番茄DNA（b）10倍梯度稀釋重組載體建立的標準曲線Fig. 2 Standard curve of 10-fold diluted recombinant plasmids with sterile water (a) and DNA extracted from tomato leaves

2.4 菌株HMB19198在番茄葉片上定殖能力檢測

依據建立的熒光定量PCR體系，對不同時期提取的番茄葉片總DNA中菌株HMB19198的濃度進行定量檢測，同時利用傳統(tǒng)的菌落計數(shù)法分析菌株HMB19198在葉面的定殖數(shù)量，分析兩種方法的相關性。熒光定量PCR的結果顯示，菌株HMB19198在葉片上的定殖數(shù)量隨時間的延長呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢。接菌初期（0 d），菌株HMB19198的定殖濃度為1.7×108拷貝/g葉片，接菌2、4、6和8 d后菌體濃度分別為1.2×108拷貝/g葉片、4.7×107拷貝/g葉片、9.8×106拷貝/g葉片和1.0×107拷貝/g葉片。平板計數(shù)的檢測結果顯示，接菌初期（0 d）菌體數(shù)量為8.9×107cfu/g葉片，接菌2、4、6和8 d后菌體數(shù)量分別為6.3×107、2.8×107、3.0×107、和1.2×107cfu/g葉片，兩種方法的檢測結果具有較高的相關性（相關性系數(shù)R2＝0.87）（圖3）。

圖3 Real-time PCR和平板計數(shù)方法對HMB19198菌株進行定量檢測Fig. 3 Detection ofB.subtilisstrain HMB19198 by real-time PCR and plate count methods

2.5 菌株HMB19198防治番茄灰霉病的持效期

分別于噴施HMB19198菌株0、2、4、6和8 d后分析菌株HMB19198對番茄灰霉病的防治效果（圖4）。結果表明，噴施HMB19198菌株2 d內對番茄灰霉病的防治效果在80%以上，4 d后防治效果為63.4%，8 d后防治效果降至37.9%。

圖4 番茄噴施菌株HMB19198不同時期對番茄灰霉病的防治效果Fig. 4 Biocontrol efficiency for tomato gray mold after inoculation ofBacillus subtilisHMB19198 at different times

表1 枯草芽胞桿菌HMB19198探針的特異性檢測Table 1 Probe specific detection forB.subtilisHMB19198

3 討論

基于TaqMan探針的熒光定量 PCR技術是近年發(fā)展起來的可快速檢測環(huán)境中靶標生物的一種分子技術。該技術具有特異性強、靈敏度高、周期短的優(yōu)點，被廣泛應用于環(huán)境中微生物的定量檢測[18]。獲得靶標微生物特異性探針是開發(fā)熒光定量PCR檢測技術的關鍵，目前報道較多的是基于真菌的ITS序列和細菌的16S rDNA序列，對某種微生物進行定量檢測[19]，而針對特定菌株開展定量檢測的報道較少，主要原因是難以獲得菌株特異性的引物或探針。通過隨機擴增多態(tài)性DNA（random amplied polymorphic DNA，RAPD）和擴增片段長度多態(tài)性（amplied fragment length polymorphism，AFLP）等技術對不同菌株進行多態(tài)性分析，獲得菌株的特異性片段，進而根據特異性片段序列設計針對菌株的特異性引物或探針，該技術曾廣泛應用于開發(fā)菌株特異性引物，但這兩項技術要求提供不同菌株 DNA，在一定程度上限制了引物的特異性驗證范圍[20]。近年來，隨著基因組測序技術的普及及生物信息學技術的廣泛應用，通過菌株全基因組序列比對，獲得菌株的特異性堿基，據此設計針對菌株的特異性引物或探針已成為可能。目前僅 NCBI數(shù)據庫中提交的枯草芽胞桿菌類細菌的全基因組序列達到350條，方便了枯草芽胞桿菌類細菌全基因組序列比對?？莶菅堪麠U菌HMB19198是一株能有效防治番茄灰霉病的生防細菌，目前已獲得該菌株的全基因組序列。本研究基于全基因組序列比對技術，得到HMB19198菌株中的特異性片段19198-609，將此序列在NCBI數(shù)據庫中進行序列比對，未發(fā)現(xiàn)存在同源性較高的序列?；诖诵蛄性O計出針對HMB19198菌株的特異性引物和探針，首先利用32株芽胞桿菌進行特異性驗證，證明該引物和探針對HMB19198菌株具有較高的特異性，另外，以番茄葉片DNA為模板進行檢測，也未發(fā)現(xiàn)存在檢測信號，因此，該特異性引物和探針可用于開展HMB19198菌株在番茄葉片上的定量檢測。

利用熒光定量PCR檢測靶標微生物的靈敏性時受提取DNA的質量以及DNA中腐殖酸和有機酸等物質的影響[21]。菌株 HMB19198為葉面噴施，因此，重點檢測菌株在葉片上的定殖能力?？紤]到番茄葉片DNA可能影響HMB19198菌株的檢測，本研究分別用HMB19198基因組DNA和混入番茄葉片DNA的HMB19198基因組DNA構建了標準曲線，比較了兩種情況下的檢測靈敏度，結果發(fā)現(xiàn)沒有番茄葉片DNA干擾的條件下，對HMB19198菌株的檢測極限為10拷貝/μL，混入番茄葉片DNA后，體系檢測效率沒有明顯的改變，但檢測極限降低為 102拷貝/μL。前期研究發(fā)現(xiàn)，噴施 HMB19198菌株后，番茄葉片上菌株的濃度在105cfu/g葉片以上，因此，即使存在番茄葉片的干擾，本研究建立的檢測體系依然可用于葉片上菌株HMB19198的定量檢測。

菌株HMB19198田間應用間隔期為5～8 d，在施藥間隔期間進行菌株HMB19198在葉片上的數(shù)量動態(tài)檢測有助于指導田間施藥和研究生防菌的作用機制。本研究利用所建立的熒光定量PCR技術結合菌落計數(shù)法，對噴施菌株HMB19198 0～8 d后葉片上菌體數(shù)量進行了動態(tài)檢測發(fā)現(xiàn)，在接種前期（0、2和4 d）熒光定量PCR檢測結果略高于菌落計數(shù)法檢測結果，但接種后期（6和8 d）熒光定量PCR檢測結果略低于菌落計數(shù)法檢測結果，推測隨著番茄的生長，葉片中的有機酸等物質含量增多，對熒光定量PCR的擴增效率有影響，從而降低了檢測結果。熒光定量PCR檢測和平板菌落計數(shù)檢測結果相近，菌體數(shù)量隨著時間的延長呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，結果與劉錦霞[22]等檢測生防菌株SW11在番茄葉片上的定殖數(shù)量變化趨勢一致。本研究結果顯示，用藥2 d后菌株HMB19198在葉面的數(shù)量為6.3×107cfu/g葉片，對灰霉病的防效在80%以上，而用藥8 d后在葉面的定殖數(shù)量為1.2×107cfu/g葉片，但此時的防效僅為37.9%。對于防治葉部病害的生防細菌，其葉面的定殖能力和產生的抑菌物質均影響其生防效果[23]。由于HMB19198菌株是以菌體形態(tài)噴灑在番茄葉面上，其在轉變?yōu)樾菝唧w芽胞的過程中將分泌微量的抑菌活性物質，會在一定程度上抑制了病原菌的侵染，因此在施藥初期對灰霉病的防治效果較好。但隨著時間的延長，菌株HMB19198轉化為芽胞或菌體死亡，對病害的防效降低，另外，其所分泌的抑菌物質在溫室高濕環(huán)境下也會有所流失。