李 杰 錢云開 王 偉 申應(yīng)德 姜 慶 張文萌 王建昌

1.臨沂市檢驗檢測中心 山東臨沂 276000 2.秦皇島海關(guān)技術(shù)中心 河北秦皇島 066004 3.石家莊海關(guān)技術(shù)中心 河北石家莊 050000

動物血制品是中國飲食文化中常見的食材，口感細膩、味道鮮美的鴨血便是其中之一[1]。

鴨血僅占鴨重量的4%左右，蛋白質(zhì)、氨基酸含量較高，同時含有多種生物活性物質(zhì)，因此鴨血具有很高的營養(yǎng)價值[2，3]。

鴨血還可以被制作成鴨血豆腐，是火鍋、麻辣燙的重要食材[4]。

鴨血作為名小吃“鴨血粉絲湯”的原料而供不應(yīng)求。由于鴨血含量較低，加之需求巨大，因此鴨血的價格相對于牛血、鵝血等明顯偏高[5]，由于動物血液在外觀和色澤上基本相似，普通消費者很難將鴨血和其他血液區(qū)分，部分不法商販便在鴨血中摻入其他物種的血液，甚至直接用其他物種的血液冒充鴨血[6]。

2012年，媒體曝光了北京“第五肉聯(lián)廠”和“稻香村”等知名企業(yè)利用豬血冒充鴨血進行加工出售；2015年，媒體報道了“呷哺呷哺”、“小肥羊”等知名企業(yè)利用豬血冒充鴨血進行加工出售[7]。

2021年，濟南市市場監(jiān)管局會同公安機關(guān)，根據(jù)舉報線索對生產(chǎn)“假鴨血”的“黑窩點”及使用“假鴨血”的餐飲單位聯(lián)合開展執(zhí)法檢查。經(jīng)查證位于濟南市槐蔭區(qū)的一家“黑窩點”使用雞血冒充鴨血，加工成“假鴨血”，銷往火鍋店、川菜館[8]。

隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，聚合酶鏈式反應(yīng)已成為檢測肉類摻假最常用的方法之一。以DNA分子特異基因擴增技術(shù)為基礎(chǔ)的實時熒光PCR(Real-Time PCR)技術(shù)具有簡單、快速、靈敏度高和準確性高的優(yōu)點，目前已是肉制品物種源性成分鑒定普遍采用的方法[9]。

本研究利用普通PCR和熒光定量PCR方法，參考國家標準、行業(yè)標準和自行設(shè)計的引物和探針對臨沂市市售的53批鴨血制品進行動物源性成分分析，判斷樣品是否摻假，為居民食用鴨血制品提供指導意見，也為監(jiān)管部門的風險監(jiān)控提供理論數(shù)據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

鴨血及其制品，雞肉、豬肉、鵝肉、牛肉、狗肉、兔子肉、驢肉，購于臨沂市各大超市和商場；狐貍?cè)猓跞?，購于臨沂市某屠宰場；火雞肉、鴕鳥肉，購于京東商城。

1.1.2 試劑

DNA提取試劑，QIAamp Fast DNA Tissue Kit組織基因組DNA提取試劑盒；

熒光PCR試劑，寶生物 Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)，寶生物豬源性成分實時熒光PCR檢測試劑盒；

普通PCR試劑，寶生物 Premix TaqTM；

qPCR引物和探針合成，上海生工生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

熒光定量PCR儀，LightCycler96，瑞士羅氏；

定性PCR儀，C1000 Touch，美國伯樂；

凝膠成像儀，GelDoc XR+，美國伯樂；

水平電泳系統(tǒng)，PowerPac Universal Mini-Sub-Cell GT，美國伯樂；

超微量分光光度計，ND2000，美國Thermo；

微量管離心機，MIKRO 200R，德國Hettich。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品DNA的提取

用無菌剪刀取樣品25mg，搗碎成肉糜，置于DNA提取試劑盒提供的管中，按照DNA提取試劑盒的步驟進行操作。

1.3.2 引物和探針

通過GenBank下載鴕鳥、雞、鴨、鵝、火雞、豬、牛、羊、驢、狗、狐貍、兔子、貂、水貂的cytb基因序列，利用clustalx軟件對上述物種cytb基因序列進行比對，找出序列差異處，通過NCBI網(wǎng)站的引物設(shè)計工具Primer-BLAST和探針設(shè)計軟件Primer Express 3.0設(shè)計一組鴕鳥特異性引物和探針，如表1所示。

豬源性成分試驗由于采用了試劑盒法，引物和探針在標準中未能體現(xiàn)，其他物種源性成分試驗所用的引物和探針如表1中采用的標準所示。

表1 引物、探針及標準Table 1 Information of primer, probe and standard

續(xù)表1

1.3.3 源性成分試驗

鴕鳥源性成分試驗的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下。

熒光PCR反應(yīng)體系：10μL Premix Ex TaqTM，上下游引物、TaqMan探針各0.4μL(濃度為10μM)，提取DNA模板1μL，用滅菌水補足至總體積20μL。

PCR反應(yīng)程序：95℃預變性30s；95℃、15s，60℃、30s，40個循環(huán)。

其他物種源性成分試驗涉及的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件按照表1中標準要求的方法進行試驗。

1.3.4 鴕鳥成分特異性試驗

利用超微量分光光度計測定樣品DNA在260nm和280nm處的吸光值A(chǔ)260和A280。當A260/A280比值在1.7～1.9之間，適宜于PCR擴增。利用1.3.3中鴕鳥源性成分試驗的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，分別以鴕鳥、雞、鴨、鵝、火雞、豬、牛、羊、驢、狗、狐貍、兔子、貂、水貂動物的DNA為模板，利用超微量分光光度計測定上述樣品DNA濃度，將DNA濃度稀釋成1ng/μL,以純水為模板作為空白對照，進行實時熒光PCR，驗證引物的特異性。并對樣品的擴增產(chǎn)物進行測序，將測序結(jié)果在NCBI中進行比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 鴕鳥成分特異性試驗結(jié)果

檢測結(jié)果顯示，只有鴕鳥樣品出現(xiàn)陽性擴增曲線，其他樣品均無信號檢出，空白對照也無信號檢出。將鴕鳥陽性樣本擴增產(chǎn)物的測序序列在NCBI進行BLAST比對，樣本序列與鴕鳥cytb基因序列相似度大于99%。說明鴕鳥源性成分的引物和探針有良好的特異性。

2.2 源性成分試驗結(jié)果

鴕鳥源性成分試驗中，當Ct值≤35時，判定樣品中含有鴕鳥源性成分，當Ct值≥40時，判定樣品中不含鴕鳥源性成分，當35

其他物種的源性成分的結(jié)果分析參照表1中所列的標準作為判定標準。

結(jié)果顯示，53批樣品中,所有檢品均能檢出鴨源性成分，樣品43號檢出鵝源性成分，Ct值為28.76；樣品16號檢出牛源性成分，Ct值為32.55；其他源性成分均未檢出。鵝、牛源性成分檢測擴增曲線如圖1、圖2所示。

注：1-陽性對照；2-43號樣品；3-陰性對照；4-空白對照圖1 鵝源性成分檢測Fig.1 Detection ofgoose-derived ingredients

注：1-陽性對照；2-16號樣品；3-陰性對照；4-空白對照圖2 牛源性成分檢測Fig. 2 Detection of cow-derived ingredients

3 結(jié)論與討論

近年來，我國畜牧業(yè)產(chǎn)業(yè)蒸蒸日上，肉牛養(yǎng)殖業(yè)的養(yǎng)殖規(guī)模也在不斷擴大[10]。但是作為副產(chǎn)物的牛血，卻在我國食品工業(yè)上應(yīng)用還不多，牛血不能夠被充分利用[11]。肉鵝養(yǎng)殖業(yè)也在我國各地蓬勃發(fā)展，目前我國是世界第一的養(yǎng)鵝大國，鵝血資源豐富。但是，目前肉鵝養(yǎng)殖的主要方向是鵝肉、鵝肝、鵝絨、鵝蛋，鵝血的利用卻微乎其微[12，13]。許多不法商販利用養(yǎng)殖業(yè)中產(chǎn)生的過剩的牛血和鵝血，對鴨血制品進行冒充或摻假，從中獲利。

2018年南京市食品藥品監(jiān)督檢驗局對南京市場中鴨血制品進行檢測，發(fā)現(xiàn)在33批鴨血制品中，20批出現(xiàn)摻假問題，其中3批檢測結(jié)果為鵝血[14]。廣西質(zhì)量監(jiān)督導報于2008年，報道了北京市場上，火鍋店里出售的散裝鴨血，基本上全部有假(都是用豬血、牛血制成的)。2017年3月有媒體曝光了哈爾濱一家鴨血加工廠用牛血兌水冒充鴨血，其產(chǎn)品直供包貝爾所開辣莊火鍋?？梢钥闯鲇鸣Z血和牛血冒充鴨血的現(xiàn)象時有發(fā)生。

本研究通過現(xiàn)行行業(yè)標準，國家標準以及自行設(shè)計的引物和探針，利用普通PCR和熒光定量PCR方法檢測臨沂市售53批鴨血制品的鴨、雞、豬、鵝、牛、火雞、鴕鳥、狐貍、狗、兔子、貂、水貂、驢源性成分，結(jié)果顯示所有檢品均能檢出鴨源性成分，1批檢出鵝源性成分，1批檢出牛源性成分，摻假檢出率為3.77%。檢測結(jié)果說明存在鴨血中摻入鵝血和牛血的欺騙消費者的行為，但是總體摻假率較低。

本研究建立了一種可以快速檢測鴕鳥源性成分的實時熒光PCR法，特異性強，反應(yīng)時間短，反應(yīng)時間約為1h，大大節(jié)約了時間成本，為動物源性成分檢測提供有效技術(shù)手段。本研究為加強鴨血制品的監(jiān)管力度，為監(jiān)管部門的風險監(jiān)控提供理論數(shù)據(jù)，也為居民食用鴨血制品提供指導意見，對打擊鴨血摻假行為，保護消費者的合法權(quán)益提供了有效的技術(shù)支撐。