惠靖茹，程洋洋，黃占旺

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330045)

茶樹(shù)菇(Agrocybeaegerita)，又名茶新菇，是一種藥食兩用的真菌[1-2]?？诟写嗄矍逑?，味道鮮美[3]；營(yíng)養(yǎng)極其豐富，其蛋白質(zhì)含量高達(dá)29.5%，含有多種人體必需氨基酸，以及多種B族維生素和礦物質(zhì)元素[4-5]。此外，茶樹(shù)菇具有抗衰老[6]，免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤[7]，改善心腦血管功能[8]等天然優(yōu)勢(shì)。目前茶樹(shù)菇主要分布在我國(guó)的福建、江西等地，江西省種植的茶樹(shù)菇產(chǎn)量在全國(guó)位居前列，但當(dāng)?shù)厥秤镁募庸ぜ夹g(shù)不夠成熟，大多為產(chǎn)品單一且附加值低的初級(jí)加工產(chǎn)品[9]。因此，利用茶樹(shù)菇和成曲發(fā)酵制成具有豐富營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、口感鮮美的調(diào)味料，不僅可以提高茶樹(shù)菇的利用率而且使其深加工產(chǎn)品種類更加豐富。

米曲霉As3.042屬于黃曲霉群，菌落生長(zhǎng)快，產(chǎn)孢能力強(qiáng)，可以更好適應(yīng)環(huán)境，是傳統(tǒng)釀造食品級(jí)醬料和醬油的生產(chǎn)菌種[10-11]。由于米曲霉As3.042是一種產(chǎn)復(fù)合酶的菌種[12]，如蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等[13]，其較高的酶活力可以更好地分解原料，且在一定程度上提高了醬類產(chǎn)品中的氨基酸態(tài)氮含量，進(jìn)而更好地改善終產(chǎn)品的風(fēng)味、色澤和口感[14]。

本文以米曲霉As3.042作為菌種，以糯米粉和黃豆粉作為菌種的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并通過(guò)恒溫恒濕培養(yǎng)得到成曲。以蛋白酶活力、淀粉酶活力和纖維素酶活力作為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，對(duì)在制曲過(guò)程中的顯著影響因素即原料質(zhì)量比、潤(rùn)水量和培養(yǎng)時(shí)間，依據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以成曲中蛋白酶活力為響應(yīng)值進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，得到最佳的制曲工藝，并對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料

米曲霉As3.042：濟(jì)寧玉園生物科技有限公司；糯米：江西撫州荊公農(nóng)產(chǎn)品合作社；黃豆：贛州康瑞農(nóng)產(chǎn)品有限公司。

1.2 試劑

干酪素(生物試劑)、3,5-二硝基水楊酸試劑(3,5-dinitrosalicylic acid, DNS)、福林酚：均為分析純，北京索萊寶科技有限公司；可溶性淀粉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、無(wú)水碳酸鈉、葡萄糖：均為分析純，西隴化工股份有限公司；羧甲基纖維素鈉(化學(xué)純)：上海展云化工有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱、立式壓力蒸汽滅菌器、SHZ-C水浴恒溫振蕩器 上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 揚(yáng)州市三發(fā)電子有限公司；FA2004G電子天平 常州萬(wàn)泰太平儀器有限公司；酶標(biāo)儀 Molecular Devices Corporation。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 制曲工藝流程

糯米、黃豆→粉碎→過(guò)篩→干蒸→冷卻→接種→加入涼開(kāi)水→拌勻→培養(yǎng)→成曲。

將原料粉碎過(guò)篩，置于蒸鍋中干蒸后，待糯米粉與黃豆粉于室溫下冷卻至40 ℃以下時(shí)，按照一定比例混合后接種米曲霉As3.042，拌勻。再加入一定量的涼開(kāi)水拌勻后，置于托盤中壓平，切分成2 cm大小的方塊狀。放置霉菌培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，平均每間隔12 h翻曲1次，利于米曲霉As3.042均勻生長(zhǎng)進(jìn)而提高成曲品質(zhì)，直至制曲結(jié)束。

1.4.2 單因素試驗(yàn)

設(shè)置原料質(zhì)量比(糯米粉∶黃豆粉)、接種量、潤(rùn)水量、培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)溫度5個(gè)影響因素，不同原料質(zhì)量比(糯米粉的含量在原料總量中的占比為20%、40%、60%、80%、100%，即糯米粉∶黃豆粉為1∶4、2∶3、3∶2、4∶1、5∶0)、不同米曲霉接種量(0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%)、不同潤(rùn)水量(加水量在原料總量中的占比為35%、45%、55%、65%、75%)、不同培養(yǎng)時(shí)間(24，36，48，60，72 h)、不同培養(yǎng)溫度(22，26，30，34，38 ℃)。依據(jù)1.4.1中的工藝流程進(jìn)行制曲后，再將其置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中干燥，以成曲中的蛋白酶活力、淀粉酶活力和纖維素酶活力的大小為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察以上5個(gè)因素對(duì)制曲過(guò)程的影響，確定單因素的最佳取值范圍。每個(gè)試驗(yàn)平行進(jìn)行3次，取其測(cè)量結(jié)果的平均值。

1.4.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

培養(yǎng)成曲所需原料的總質(zhì)量固定不變，原料質(zhì)量比即糯米粉與黃豆粉的質(zhì)量比，隨著糯米粉添加量的增多或減少，黃豆粉相應(yīng)地減少或增多。因此在響應(yīng)面試驗(yàn)中，將原料質(zhì)量比因素改為糯米粉添加量，通過(guò)單因素試驗(yàn)所篩選的條件，選擇糯米粉添加量(A)、潤(rùn)水量(B)、培養(yǎng)時(shí)間(C)3個(gè)因素為影響因素，每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)水平，以蛋白酶活力為響應(yīng)值，使用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化并確定最佳制曲工藝條件。試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素水平表Table 1 The factors and levels of response surface optimization test

1.4.4 酶活力測(cè)定方法

中性蛋白酶活力的測(cè)定：參照SB/T 10317-1999《蛋白酶活力測(cè)定法》中的福林酚法；水分含量的測(cè)定：采用國(guó)標(biāo)GB 5009.3-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》中的常壓干燥法；淀粉酶活力和纖維素酶活力的測(cè)定：參考王海洋等[15]的方法。

1.4.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析采用SPSS 25.0軟件，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)、優(yōu)化分析采用Design-Expert 8.0.6軟件，繪圖處理采用OriginPro 2018軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 原料質(zhì)量比對(duì)成曲中酶活力的影響

以糯米粉作為淀粉質(zhì)原料，可為制曲時(shí)微生物的生長(zhǎng)提供碳源，同時(shí)將黃豆粉作為蛋白質(zhì)原料，為制曲過(guò)程中微生物的生長(zhǎng)提供氮源。當(dāng)具有充足的碳源和氮源時(shí)，微生物會(huì)迅速生長(zhǎng)繁殖，代謝產(chǎn)物大大增加[16]。

圖1 原料質(zhì)量比對(duì)3種酶活力的影響Fig.1 The effect of raw material mass ratio on the activity of three enzymes

由圖1可知，淀粉酶活力在原料質(zhì)量比為2∶3時(shí)達(dá)到最大值，為255.95 U/g。而原料質(zhì)量比為3∶2時(shí)，蛋白酶活力和纖維素酶活力均達(dá)到最大值，分別是4834.787, 17.1274 U/g。綜合考慮，選擇原料質(zhì)量比(糯米粉∶黃豆粉)3∶2為最佳水平。

2.1.2 接種量對(duì)成曲中酶活力的影響

當(dāng)接種量過(guò)小時(shí)，米曲霉對(duì)底物即原料利用不充分，導(dǎo)致酶活力較低；而隨著接種量的增加，原料中可利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足以滿足米曲霉自身生長(zhǎng)需要，使得其中部分微生物由于養(yǎng)分不足而生長(zhǎng)緩慢，并影響了最終菌種孢子的成熟，其蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶等酶系的分泌量也隨之減少，進(jìn)而導(dǎo)致其酶活力降低[17]。王瑩[18]通過(guò)對(duì)米曲霉As3.042在醬油釀造中的性能檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)米曲霉As3.042具有較高的蛋白酶活力，可以更好分解蛋白質(zhì)含量較多的原料，且采用米曲霉As3.042制曲時(shí)，其中的酯類物質(zhì)含量較高，醬油的酯香濃郁，香氣綿長(zhǎng)飄逸。

由圖2可知，當(dāng)接種量為0.3%時(shí)，米曲霉生長(zhǎng)所需的碳源和氮源充足，蛋白酶活力、淀粉酶活力和纖維素酶活力均達(dá)到最大值，分別為4979.43, 244.87, 14.75 U/g。所以，接種量的最佳條件為0.3%。

圖2 米曲霉接種量對(duì)3種酶活力的影響Fig.2 The effect of Aspergillus oryzae inoculation amount on the activity of three enzymes

2.1.3 潤(rùn)水量對(duì)成曲中酶活力的影響

在微生物的生長(zhǎng)過(guò)程中，水不僅直接參與微生物的代謝反應(yīng)，還作為介質(zhì)存在其中。米曲霉通過(guò)孢子繁殖，而孢子在生長(zhǎng)過(guò)程中需要吸入一定量的水分使其膨脹，有利于加快米曲霉的生長(zhǎng)速度。此外，微生物代謝產(chǎn)物溶解到水中，才能通過(guò)細(xì)胞表面釋放出來(lái)。同時(shí)，當(dāng)基質(zhì)水分含量過(guò)高時(shí)，會(huì)造成基質(zhì)缺氧，不利于米曲霉生長(zhǎng)[19]。

由圖3可知，隨著潤(rùn)水量的增加，3種酶活力呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)。當(dāng)潤(rùn)水量達(dá)到55%時(shí)，蛋白酶活力、淀粉酶活力和纖維素酶活力均達(dá)到最大值，分別為4696.97, 218.95, 20.10 U/g。因此，選擇55%為最佳潤(rùn)水量。

圖3 潤(rùn)水量對(duì)3種酶活力的影響Fig.3 The effect of water quantity on the activity of three enzymes

2.1.4 培養(yǎng)溫度對(duì)成曲中酶活力的影響

成曲中的酶活力具有高度的溫度依賴性。低溫對(duì)酶具有鈍化作用，會(huì)減緩微生物的生長(zhǎng)及產(chǎn)物的代謝，降低酶活力；當(dāng)溫度超過(guò)38 ℃時(shí)，3種酶活力都趨于平緩，這是因?yàn)闇囟冗^(guò)高不利于微生物的生長(zhǎng)及代謝，甚至?xí)?dǎo)致酶失活。因此在制曲過(guò)程中，對(duì)培養(yǎng)溫度的選擇尤為重要[20]。

由圖4可知，當(dāng)溫度達(dá)到30 ℃時(shí)，蛋白酶活力和纖維素酶活力均達(dá)到最大值，分別為4624.95, 14.00 U/g；而在34 ℃時(shí)，淀粉酶活力達(dá)到最大值，為247.70 U/g。綜合考慮，選擇30 ℃為最佳培養(yǎng)條件。

圖4 培養(yǎng)溫度對(duì)3種酶活力的影響Fig.4 The effect of cultivation temperature on the activity of three enzymes

2.1.5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)成曲中酶活力的影響

制曲時(shí)間對(duì)成曲的品質(zhì)有較大影響。當(dāng)制曲時(shí)間較短時(shí)，微生物不能充分生長(zhǎng)，酶活力較小，成曲的風(fēng)味不足；而制曲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，微生物進(jìn)入衰亡期，會(huì)使其他雜菌生長(zhǎng)，導(dǎo)致成曲中酶活力減小，影響發(fā)酵階段的產(chǎn)品品質(zhì)[21]。

由圖5可知，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到48 h時(shí)，成曲中蛋白酶活力、淀粉酶活力和纖維素酶活力均達(dá)到最大值，分別為4668.38, 217.30, 12.67 U/g。因此，以48 h作為最佳培養(yǎng)時(shí)間。

圖5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)3種酶活力的影響Fig.5 The effect of cultivation time on the activity of three enzymes

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，固定米曲霉接種量0.3%、培養(yǎng)溫度30 ℃，篩選出對(duì)制曲過(guò)程影響較大的3個(gè)因素，即原料質(zhì)量比(A)、潤(rùn)水量(B)和培養(yǎng)時(shí)間(C)，以蛋白酶活力(Y)為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Response surface test design and results

根據(jù)Box-Behnken中心復(fù)合設(shè)計(jì)原理，建立回歸方程預(yù)測(cè)模型，對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)擬合分析，得到回歸方程為： Y=5048.60+846.74A-363.33B-1.21C+48.35AB+27.79AC+44.41BC-1396.00A2-812.27B2-881.92C2。

2.2.2 模型方差分析

利用軟件Design-Expert 8.0.6建立模型，得到蛋白酶活力的多元二次回歸響應(yīng)面模型，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)擬合分析，以驗(yàn)證回歸模型與因素的顯著性。方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 The variance analysis of regression model

由表3可知，建立的回歸模型中F=72.01，P<0.0001，表明回歸模型的差異極顯著；而失擬項(xiàng)的P為0.5825>0.05，模型差異不顯著，表明該方程可靠；回歸系數(shù)R2=98.93%>85%，說(shuō)明該方程擬合程度好，可用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)，來(lái)描述各變量與響應(yīng)值之間的關(guān)系。校正系數(shù)RAdj2=0.9756，說(shuō)明該模型可解釋97.56%蛋白酶活力的變化。表3中數(shù)據(jù)表明試驗(yàn)設(shè)計(jì)可靠，誤差小，適合實(shí)際情況，可用來(lái)對(duì)茶樹(shù)菇發(fā)酵調(diào)味料的制曲試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

由表3中P值可知,一次項(xiàng)中原料質(zhì)量比(A)和潤(rùn)水量(B)對(duì)蛋白酶活力的影響極顯著，培養(yǎng)時(shí)間(C)的影響不顯著；二次項(xiàng)中A2、B2和C2對(duì)蛋白酶活力的影響均為極顯著；交互項(xiàng)中AB、AC、BC對(duì)蛋白酶活力的影響均為不顯著。參照表3中F值的大小可得出結(jié)論：3個(gè)因素對(duì)成曲中蛋白酶活力的影響程度為原料質(zhì)量比(A)>潤(rùn)水量(B)>培養(yǎng)時(shí)間(C)。

2.2.3 各因素交互作用的響應(yīng)面圖與等高線圖

響應(yīng)曲面圖可以直觀地體現(xiàn)兩變量對(duì)因變量的影響情況，其坡度越陡峭，說(shuō)明該試驗(yàn)中的因變量對(duì)響應(yīng)值的影響越大，若曲面坡度越平緩，則影響越?。坏雀呔€圖呈橢圓形時(shí)，表明兩變量之間的交互作用越顯著，若等高線圖趨近圓形，則兩變量的交互作用幾乎可忽略[22]。利用響應(yīng)面回歸模型創(chuàng)建的原料質(zhì)量比、潤(rùn)水量、培養(yǎng)時(shí)間的交互效應(yīng)響應(yīng)面圖及等高線圖見(jiàn)圖6。

a1

將其中一個(gè)因素固定，考察其他2個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值的影響。由圖6中a1和a2可知，在固定因素培養(yǎng)時(shí)間(C)的情況下，隨著糯米粉添加量和潤(rùn)水量的提高，蛋白酶活力呈先升高后降低的趨勢(shì)。在糯米粉含量為58.4%～73.9%，潤(rùn)水量為47.8%～57.9%時(shí)，蛋白酶活力在較高范圍內(nèi)。由圖6中b1和b2可知，在固定因素潤(rùn)水量(B)的情況下，隨著糯米粉添加量和培養(yǎng)時(shí)間的增加，蛋白酶活力呈先升高后降低的趨勢(shì)。在糯米粉添加量為59.3%～73.2%，培養(yǎng)時(shí)間為42.7～53.3 h時(shí)，蛋白酶活力處于較高水平。由圖6中c1和c2可知，在固定因素糯米粉添加量(A)的情況下，隨著潤(rùn)水量和培養(yǎng)時(shí)間的增加，蛋白酶活力亦是先升高后降低的趨勢(shì)。在潤(rùn)水量為49.7%～55.8%，培養(yǎng)時(shí)間為44.4～51.5 h時(shí)，蛋白酶活力較高。

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

對(duì)回歸擬合方程進(jìn)行求解，得出最佳制曲條件：A=66.13，B=52.85，C=47.98，此條件下，預(yù)測(cè)蛋白酶活力為5219.89 U/g。根據(jù)試驗(yàn)和實(shí)際操作可行性，調(diào)整修正后的茶樹(shù)菇調(diào)味料制曲條件：糯米粉為66%，即原料比(糯米粉∶黃豆粉)為3.3∶1.7，接種量為0.3%，潤(rùn)水量為52.9%，培養(yǎng)時(shí)間為48 h，培養(yǎng)溫度為30 ℃。

在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到茶樹(shù)菇調(diào)味料成曲的蛋白酶活力為5118.16 U/g，同模型預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差僅為1.95%(<5%)，說(shuō)明響應(yīng)面法對(duì)茶樹(shù)菇調(diào)味料制曲的工藝條件優(yōu)化所得到的生產(chǎn)工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有一定應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

調(diào)味料的科學(xué)調(diào)味營(yíng)養(yǎng)化、多樣化和高檔化是未來(lái)調(diào)味料發(fā)展的趨勢(shì)。以蛋白酶活力、淀粉酶活力、纖維素酶活力的大小為指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)，在所得結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化確定了茶樹(shù)菇發(fā)酵調(diào)味料的最優(yōu)制曲工藝：原料質(zhì)量比(黃豆粉∶糯米粉)為3.3∶1.7，接種量為0.3%，潤(rùn)水量為52.9%，培養(yǎng)溫度為30 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為48 h。在該條件下所制得成曲中的蛋白酶活力為5118.16 U/g，酶系含量較高，將其切為2 cm大小的方塊狀，表面與切面均長(zhǎng)滿黃綠色孢子，具有成曲特殊的清香味，無(wú)雜菌生長(zhǎng)。本研究可為用成曲與茶樹(shù)菇為原料制備發(fā)酵調(diào)味料的工藝研究提供一定的理論基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)發(fā)酵過(guò)程中相關(guān)理化指標(biāo)的檢測(cè)提供了科學(xué)的試驗(yàn)依據(jù)。