張杰，張映，趙博 ，崔成斌，張國財(cái)*，王濱松

(1.東北林業(yè)大學(xué)a.生命科學(xué)學(xué)院；b.林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150040；2.黑龍江大學(xué)化學(xué)化工與材料學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150080)

醬油作為中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品調(diào)料之一，以其豐富的營養(yǎng)成分和滑膩的口感而深受人們喜愛，是人們餐桌上不可缺少的調(diào)味食品[1]。伴隨著人們對(duì)食品營養(yǎng)的高質(zhì)量要求，單調(diào)、傳統(tǒng)的發(fā)酵醬油已經(jīng)不能滿足人們的需求，開發(fā)具有保健功效的營養(yǎng)型醬油具有很大的市場(chǎng)前景[2]。醬油制曲的實(shí)質(zhì)是通過培養(yǎng)曲霉菌得到曲菌所分泌的蛋白酶和糖化酶。在醬醅發(fā)酵中，蛋白酶分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生的各類氨基酸是醬油的主要呈味物質(zhì)。糖化酶分解淀粉類物質(zhì)產(chǎn)生葡萄糖。葡萄糖和氨基酸在較高溫度下發(fā)生美拉德反應(yīng)，生成褐色物質(zhì)，使醬油呈紅棕色，可見，酶在制曲過程中起到了很重要的作用[3]。北蟲草培養(yǎng)基中不僅含有發(fā)酵基質(zhì)，還含有北蟲草中所特有的蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖等保健物質(zhì)[4]。筆者以米曲霉滬釀3.042 單菌種[5]進(jìn)行醬油制曲，研究北蟲草培養(yǎng)基添加量對(duì)醬油制曲及酶活性的影響，旨在為規(guī)?；a(chǎn)蟲草醬油提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種與原料

試驗(yàn)菌種米曲霉滬釀3.042 來自于山東省淄博市源康源生物科技有限公司。制曲原料豆粕和麥麩均為市售。

1.2 主要試劑

主要試劑有福林試劑(Folin)、二硝基水楊酸(DNS)試劑及緩沖液。

1.3 方法

1.3.1 種曲制備

將豆粕40g 和麩皮60g 混合均勻(豆粕和麩皮的質(zhì)量比為2∶3)，潤以100%的水，篩去粗粒，將混合好的料裝入1 000mL 三角瓶(裝入厚度1 cm 左右)，再于121℃、0.1 MPa 條件下維持30min 進(jìn)行高壓滅菌。冷卻后分別添加5、10、15、20g 北蟲草培養(yǎng)基(分別稱其為處理1、處理2、處理3、處理4)，以不添加北蟲草培養(yǎng)基的處理為對(duì)照，再分別以0.3%接種量加入滬釀3.042，30℃水浴恒溫加熱，轉(zhuǎn)入搖瓶培養(yǎng)以防止結(jié)塊，待瓶中充滿孢子即可使用，或置冰箱備用。

1.3.2 種曲質(zhì)量的測(cè)定

1) 孢子數(shù)的測(cè)定。 以每1g 曲料中孢子的含量為計(jì)量單位，采用血球計(jì)數(shù)板法檢測(cè)種曲孢子數(shù)。一般要求每1g 干基的孢子數(shù)在60億個(gè)以上。

2) 感官品質(zhì)的觀察。觀察制曲24～60 h 成曲的感官品質(zhì)。

1.3.3 酶活性的測(cè)定

蛋白酶活性采用Folin–酚法[6–8]進(jìn)行測(cè)定。將40℃下每1min 水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸所需的酶量定義為1個(gè)蛋白酶活力單位(U)。

糖化酶活性參照文獻(xiàn)[2,6]進(jìn)行測(cè)定。將溫度40℃、pH 5.0 條件下每1min 催化生成1mg 葡萄糖所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位(U)。

亮氨酸氨肽酶活性參考文獻(xiàn)[9]的方法進(jìn)行測(cè)定。將試驗(yàn)條件下每1min 水解L–亮氨酸–對(duì)硝基苯胺產(chǎn)生 1μg 對(duì)硝基苯胺所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位(U)。

纖維素酶活性參考文獻(xiàn)[2]進(jìn)行測(cè)定。將溫度50℃、pH 4.8 條件下每1min 催化生成1μg 葡萄糖所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位(U)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，用Excel 2007輔助作圖。利用SPSS One–Way ANOVA方差分析軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 各處理種曲在制曲過程中的感官變化

通過對(duì)種曲孢子數(shù)進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得處理1、處理2、處理3、處理4 每1g 發(fā)酵液中的孢子數(shù)分別為334億、355億、343億、336億個(gè)，處理2 中每1g 發(fā)酵液中的孢子數(shù)比對(duì)照高30億個(gè)。由表1 可見，在制曲過程中，不同蟲草培養(yǎng)基添加量對(duì)種曲感官產(chǎn)生的影響不同，與對(duì)照組相比，處理組米曲霉菌絲體生長厚實(shí)，處理2 米曲霉菌絲體在培養(yǎng)制曲48 h 曲料蓬松，菌絲豐滿，米曲霉孢子呈淡黃色，接近成熟，孢子生長旺盛，在54 h 后蓬松的曲料中出現(xiàn)黃綠色豐滿的成熟米曲霉孢子。綜合孢子數(shù)分析和感官觀察，認(rèn)為處理2 發(fā)酵基料中的種曲質(zhì)量最優(yōu)。

2.2 各處理種曲在制曲過程中酶活性的變化

2.2.1 蛋白酶酶活性的變化

滬釀3.042 制曲能夠產(chǎn)生3 種蛋白酶，且堿性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶的酶活性依次減小，其原因是在單菌種米曲霉制曲過程中，初期制曲的pH 值較高，呈現(xiàn)出堿性，隨著蛋白的分解，pH 值逐漸降低。

中性蛋白酶活性的變化：由圖1 可知，對(duì)照和各處理在制曲36～48 h 均呈上升趨勢(shì)，在制曲48～60 h均呈下降趨勢(shì)；對(duì)照和各處理均在制曲48 h 出現(xiàn)最大值，且以處理2 的酶活性最大(每1g 干基的酶活性達(dá)1 801.21 U，比對(duì)照高9.01%)；與對(duì)照相比較，在整個(gè)制曲過程中，各處理的中性蛋白酶活性均顯著高于對(duì)照；各處理之間相比較，在制曲過程中，處理2 的中性蛋白酶活性均顯著高于其他處理。

圖1 制曲過程中各處理中性蛋白酶的活性 Fig.1 Neutral proteinase activity in the propagation process

堿性蛋白酶活性的變化：由圖2 可見，對(duì)照和各處理在制曲36～48 h 均呈較快的上升趨勢(shì)，在制曲48～60 h 呈緩慢下降趨勢(shì)；對(duì)照和各處理均在制曲48 h 出現(xiàn)最大值，每1g 干基的酶活為2 078.05～2 253.96 U，其中處理2 的酶活性最大(每1g 干基的酶活性為2 253.96 U，比對(duì)照高8.46%)；與對(duì)照相比，整個(gè)制曲過程中各處理的堿性蛋白酶活性均顯著高于對(duì)照；各處理之間相比較，整個(gè)制曲過程中處理2 的堿性蛋白酶活性均顯著高于其他處理。

圖2 制曲過程中各處理堿性蛋白酶的活性 Fig.2 Alkaline protease activity in the propagation process

酸性蛋白酶活性的變化：由圖3 可知，酸性蛋白酶的活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于中性蛋白酶和堿性蛋白酶的活性；對(duì)照和各處理在制曲36 ～42 h 呈緩慢上升趨勢(shì)，酶活性整體相差不大，且在制曲48～60 h 呈下降趨勢(shì)；對(duì)照和各處理酶活性均在制曲42 h 出現(xiàn)最大值，其中處理2 的酶活性最大(每1g 干基的酶活為259.66 U，比對(duì)照高6.02%)；與對(duì)照相比，除60 h 外，整個(gè)制曲過程中各處理的酶活性均顯著高于對(duì)照；各處理之間相比較，整個(gè)制曲過程中處理2的酸性蛋白酶活性均高于其他處理(在制曲36、60 h，處理2 均顯著高于其他處理，在制曲42 h，處理2、處理3 顯著高于處理1 和處理4，在制曲48 h，處理2 顯著高于處理1 和處理4)。

圖3 制曲過程中各處理酸性蛋白酶的活性 Fig.3 Acid proteinase activity in the propagation process

2.2.2 α–淀粉酶活性的變化

由圖4 可知，在制曲36～48 h，對(duì)照和各處理α–淀粉酶的活性呈上升趨勢(shì)，在制曲48～60 h 呈下降趨勢(shì)；在制曲48 h，對(duì)照和各處理均出現(xiàn)酶活性最大值，且以處理2 的酶活性最大(每1g 干基的酶活性為50.37 U，比對(duì)照高38.27%)；與對(duì)照相比，在制曲36 h 和42 h，各處理組與對(duì)照組酶活性的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在制曲48 h，處理1 和處理2 的酶活性均顯著高于對(duì)照；在制曲54 h 和60 h，處理1、處理2 和處理3 的酶活性均顯著高于對(duì)照，處理4 與對(duì)照酶活性的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；各處理之間相比較，在制曲36 h，各處理間酶活性的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在制曲42～60 h，處理1、處理2 與處理3 酶活性的差異均達(dá)顯著水平，與處理4 的差異也均達(dá)顯著水平。

圖4 制曲過程中各處理α–淀粉酶的活性Fig.4 α–amylase activity in the propagation process

2.2.3 亮氨酸氨肽酶活性的變化

由圖5 可以看出，在制曲36～42 h，對(duì)照和各處理亮氨酸氨肽酶的活性呈緩慢上升趨勢(shì)，42 h 后迅速增加，在48 h 出現(xiàn)酶活性峰值，之后迅速下降，其中處理2 的酶活性最高(每1g 干基的酶活為842.33 U，比對(duì)照高1.10%)；整個(gè)制曲過程中，各處理的亮氨酸氨肽酶酶活性與對(duì)照間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖5 制曲過程中各處理亮氨酸氨肽酶的活性 Fig. 5 Leucine aminopeptidase activity in the propagation process

2.2.4 纖維素酶活性的變化

由圖6 可見，在制曲36～48 h，對(duì)照和各處理纖維素酶的活性緩慢上升，48～60 h 緩慢下降；對(duì)照和各處理均在制曲48 h 出現(xiàn)酶活性峰值，其中以處理2 的酶活性最高(每1g 干基的酶活為1 801.53 U，比對(duì)照高18.56%)；與對(duì)照相比，整個(gè)制曲過程中，在制曲48、54、60 h，各處理的酶活性均顯著高于對(duì)照；各處理之間相比較，整個(gè)制曲過程中處理2 的酶活性均高于其他處理(在制曲36、54 h，處理2 均顯著高于其他處理組，在制曲48 h，處理2、處理3 均顯著高于處理1 和處理4)。

圖6 制曲過程中各處理纖維素酶的活性 Fig.6 Cellulase activity in the propagation process

3 結(jié)論與討論

制曲是醬油發(fā)酵的關(guān)鍵。充分利用原料，改善醬油風(fēng)味，提高制曲工藝水平，從而提升醬油品質(zhì)，豐富醬油品種是醬油產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必然趨勢(shì)[10–11]。本研究結(jié)果表明：

在醬油發(fā)酵基料中分別添加5、10、15、20g北蟲草培養(yǎng)基，以添加10g 北蟲草培養(yǎng)基處理中每1g 發(fā)酵液中的孢子數(shù)最多，為355億個(gè)，比對(duì)照高30億個(gè)。該處理種曲的孢子數(shù)最多，孢子生長旺盛，制曲48 h 時(shí)曲料蓬松，菌絲豐滿，米曲霉孢子為淡黃色；制曲54 h 時(shí)，蓬松的曲料中長出黃綠色豐滿的成熟米曲霉孢子，由孢子數(shù)分析結(jié)果和感官觀察結(jié)果可知，該處理發(fā)酵基料中的種曲質(zhì)量最優(yōu)。這與向培養(yǎng)基中添加丟糟和黃水提高制曲質(zhì)量的研究結(jié)果[12–13]相似，且產(chǎn)生的孢子數(shù)有所增加。

醬油制曲過程中米曲霉產(chǎn)酶活性的高低將影響原料的利用率及產(chǎn)品的品質(zhì)，因此，提高成曲酶活性是提高醬油品質(zhì)的重要途徑[14]。本研究結(jié)果表明，所測(cè)各酶的活性數(shù)值均呈先上升、后下降的趨勢(shì)。除酸性蛋白酶在制曲42 h 出現(xiàn)最大值外，其余各 酶的活性均在制曲48 h 出現(xiàn)峰值。在整個(gè)制曲過程中，除亮氨酸氨肽酶酶活性各處理間與對(duì)照間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，各處理中性蛋白酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶、α–淀粉酶及纖維素酶的酶活性均高于對(duì)照，且在酶活高峰時(shí)，處理2 酶活性均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，表明添加北蟲草培養(yǎng)基可以提高制曲過程中酶的活性，且以添加10g 北蟲草培養(yǎng)基處理的酶活性較高。

將北蟲草培養(yǎng)基作為原料加入到醬油發(fā)酵基料中，不僅能實(shí)現(xiàn)廢物利用，解決醬油發(fā)酵的原料問題，而且能制造出具有蟲草風(fēng)味的功能型醬油。

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