徐麗梅,陳煉紅
(西南民族大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,成都 610041)
紫薯(Ipomoeabatatas),屬于旋花科,又叫黑薯,薯肉呈紫色至深紫色[1],有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,且具有抗衰老,降血壓,預(yù)防動(dòng)脈硬化,改善機(jī)體功能,降低基因突變的可能性等保健作用[2-4]。人體衰老、心血管病甚至癌癥等疾病的產(chǎn)生與惡化的主要誘因是人體內(nèi)活性氧自由基(包括超氧陰離子、羥自由基和過(guò)氧化氫等)以及其代謝產(chǎn)物的增多[5-6],生活中,人們攝入適量含有抗氧化劑的食品能一定程度上清除或抑制自由基化合物,減少其對(duì)人體的傷害。
多聚糖,又叫多糖,是一類(lèi)維持生命所需生命有機(jī)體、不具有甜味和強(qiáng)還原性的天然的大分子物質(zhì),具有復(fù)雜的生物活性與功能,例如儲(chǔ)存能量、防御功能和抗氧化性等[7-8],還包括調(diào)節(jié)免疫力[9-11],協(xié)助消化系統(tǒng)分解食物,保護(hù)肝臟[12-13]和調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)等[14-15]保健作用。目前多糖的提取方法主要有酸堿提取法、超聲波輔助提取法[16]、超高壓輔助結(jié)合水提法和酶法等[17-18]。紫薯多糖作為植物多糖,可采用酶法提高提取效率,利用酶在適宜條件下催化水解細(xì)胞壁,從而加快多糖釋放的速度。
目前國(guó)內(nèi)對(duì)于紫薯多糖的研究大多集中于提取方法和對(duì)油脂以及動(dòng)物為試驗(yàn)體的抗氧化試驗(yàn)。本試驗(yàn)則是通過(guò)對(duì)紫薯多糖的羥基自由基(·OH)、超氧陰離子自由基(O2-·)和1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH·)清除能力的測(cè)定,并以相應(yīng)濃度的抗壞血酸作為對(duì)照,對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià),將為后續(xù)相關(guān)研究奠定理論基礎(chǔ)。
紫薯:購(gòu)自河南南陽(yáng),放置在55 ℃恒溫干燥箱中烘干,粉碎,過(guò)100目篩,得紫薯粉,在干燥器中保存,備用;纖維素酶(40 U/mg)、果膠酶(BR)、木瓜蛋白酶(2 U/mg)、無(wú)水乙醇、苯酚、檸檬酸、三氯乙酸、抗壞血酸、濃硫酸、1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH·)、水楊酸、過(guò)氧化氫、丙酮、硫酸亞鐵、Tris-HCl、乙醚、鄰苯三酚:均為分析純,成都市科龍化工試劑廠(chǎng)。
AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;TD4A臺(tái)式離心機(jī) 長(zhǎng)沙英豪儀器有限公司;FW100高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 北京中興偉業(yè)儀器有限公司;HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司;MP511 pH計(jì) 上海三信儀表廠(chǎng);BCD-243K冰箱 河南新飛電器公司;DHG-9203A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司;UV-2102C/PC/PCS紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司。
1.2.1 復(fù)合酶法提取紫薯多糖工藝
工藝流程:紫薯→前處理→溶解→調(diào)節(jié)pH→添加復(fù)合酶→酶解→滅酶→離心取上清液→除蛋白→靜置→離心取上清液→醇沉→離心取沉淀→洗滌→烘干→復(fù)溶→粗多糖溶液[19-21]。
1.2.2 紫薯多糖含量的測(cè)定方法
1.2.2.1 葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制
使用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液作為標(biāo)準(zhǔn)物,采用苯酚-硫酸法[22],于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)吸光度。以吸光度值OD(A)為縱坐標(biāo),葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo),制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。所得回歸方程為:A=17.177x-0.0223(x為葡萄糖質(zhì)量濃度(mg/mL),A為吸光度),R2=0.9981,線(xiàn)性關(guān)系良好。
1.2.2.2 多糖含量的測(cè)定
取1.0 mL粗多糖溶液置于帶塞比色管中,加UP水至2.0 mL。將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的苯酚溶液1.0 mL及濃硫酸5.0 mL分別用1.0 mL和5.0 mL的移液管加入到帶塞比色管中,10 min室溫靜置,搖勻,放于30 ℃恒溫水浴鍋中水浴20 min,取出冷卻至室溫,于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度,并計(jì)算樣品中多糖得率。
式中:ω為樣品中多糖得率,%;c為樣液的質(zhì)量濃度,mg/mL;V為定容的體積,mL;M為所取紫薯粉末重量,g。
1.2.3 復(fù)合酶法提取紫薯多糖單因素試驗(yàn)
在紫薯多糖提取工藝的基礎(chǔ)上,對(duì)提取工藝中的液料比、復(fù)合酶添加量、酶解pH、酶解時(shí)間、酶解溫度等因素進(jìn)行工藝優(yōu)化,并通過(guò)計(jì)算多糖得率確定最佳的工藝參數(shù),具體單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。
1.2.4 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選提取紫薯多糖關(guān)鍵因素
根據(jù)單因素試驗(yàn)確定5個(gè)影響因素復(fù)合酶添加量、酶解溫度、液料比、酶解時(shí)間、酶解pH值合適的反應(yīng)范圍,運(yùn)用Minitab 17軟件進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及關(guān)鍵因素篩選試驗(yàn)[23],試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。
表2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素、水平和編碼
1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化復(fù)合酶法提取紫薯多糖
在單因素試驗(yàn)及關(guān)鍵因素篩選設(shè)計(jì)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,設(shè)置酶解溫度、液料比、酶解時(shí)間、復(fù)合酶添加量為試驗(yàn)變量,將多糖得率設(shè)置為響應(yīng)值,根據(jù)Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)原理,并運(yùn)用Design-Expert 8.0.2 軟件設(shè)計(jì)出試驗(yàn)組,從而開(kāi)展四因素三水平響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn),并對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和分析,得出復(fù)合酶法紫薯多糖最佳提取工藝參數(shù)[24]。其中,響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素與水平見(jiàn)表3。
表3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素與水平Table 3 The factors and levels of response surface design
1.2.6 紫薯多糖的抗氧化活性試驗(yàn)
運(yùn)用體外抗氧化活性研究的方法,測(cè)定紫薯多糖對(duì)·OH、O2-·及DPPH·的清除能力,并在一定條件下與抗壞血酸做對(duì)比來(lái)評(píng)價(jià)紫薯多糖的抗氧化活性。
1.2.6.1 紫薯多糖對(duì)·OH清除能力的測(cè)定
分別取濃度為0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 mg/mL的多糖溶液2.0 mL,依次加入9 mmol/L水楊酸-乙醇2 mL,9 mmol/L FeSO42 mL,在37 ℃下,添加8.8 mmol/L H2O22 mL,反應(yīng)時(shí)間0.5 h,以加入U(xiǎn)P水為空白對(duì)照組,以相同質(zhì)量濃度的Vc溶液作為對(duì)照,在510 nm下測(cè)量吸光度?!H自由基清除率(Q,%)計(jì)算公式如下:
Q(%)=[1-(HX-HX0)/H0]×100%。
式中:H0為空白組的吸光度;HX為試驗(yàn)組的吸光度;HX0為UP水代替H2O2溶液作為參比的吸光度。
1.2.6.2 紫薯多糖對(duì)DPPH·清除能力的測(cè)定
分別取2.0 mL濃度為0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 mg/mL的多糖溶液,依次加入2.0 mL 0.1 mmol/L 濃度DPPH溶液,混勻后暗室靜置40 min,以蒸餾水作空白,用相同質(zhì)量濃度的Vc溶液作為對(duì)照,在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度值。DPPH·自由基清除率(Q,%)計(jì)算公式如下:
Q(%)=[1-(HX-HX0)/H0]×100%。
式中:H0為空白組的吸光度;HX為試驗(yàn)組的吸光度;HX0為參比的吸光度。
1.2.6.3 紫薯多糖對(duì)O2-·清除能力的測(cè)定
分別取濃度為0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 mg/mL的多糖溶液,加入4.5 mL Tris-HCl緩沖液(pH 8.2),置于25 ℃恒溫水浴鍋中,水浴20 min,再加入0.4 mL 25 mmol/L鄰苯三酚溶液混勻后于25 ℃水浴中靜置5 min;以蒸餾水作空白試驗(yàn),以相同質(zhì)量濃度的Vc溶液作為對(duì)照,測(cè)定其在325 nm處的吸光度值。O2-·清除率(Q,%)計(jì)算公式如下:
Q(%)=[1-(HX-HX0)/H0]×100%。
式中:H0為空白組的吸光度;HX為試驗(yàn)組的吸光度;HX0為參比的吸光度。
2.1.1 不同液料比對(duì)紫薯多糖提取率的影響
由圖1可知,當(dāng)液料比在20∶1~30∶1之間時(shí),多糖提取率隨之增加而增加,超過(guò)30∶1(mL/g)時(shí),提取率逐漸下降,即在30∶1(mL/g)處達(dá)到最大值2.701%。導(dǎo)致該現(xiàn)象的原因可能是液料比的增大,短時(shí)間達(dá)到多糖提取的平衡點(diǎn);相反,當(dāng)液料比過(guò)小時(shí),所有多糖未充分溶出而呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。因此,由液料比單因素試驗(yàn)可知,將液料比設(shè)置為30∶1(mL/g)時(shí)紫薯多糖的提取效果最佳。
圖1 不同液料比對(duì)紫薯多糖提取率的影響
2.1.2 不同復(fù)合酶添加量對(duì)紫薯多糖提取率的影響
由圖2可知,酶的添加量低于4%時(shí),紫薯多糖得率緩慢上升,4%時(shí)達(dá)到頂峰,為2.739%。酶的添加量超過(guò)4%時(shí),紫薯多糖得率略下降,可能是由于酶分子過(guò)飽和,影響酶分子與底物結(jié)合。因此,通過(guò)復(fù)合酶添加量的單因素試驗(yàn)結(jié)果可得,若想得到紫薯多糖最佳提取率,則復(fù)合酶添加量為4%。
圖2 復(fù)合酶添加量對(duì)紫薯多糖提取率的影響
2.1.3 不同酶解溫度對(duì)紫薯多糖提取率的影響
由圖3可知,35~45 ℃范圍內(nèi),隨著溫度的上升,多糖得率逐漸上升;45~60 ℃范圍內(nèi),多糖得率出現(xiàn)大幅度下降;酶解溫度為45 ℃時(shí),多糖得率最大,為2.752%。這也許是由于酶解溫度過(guò)低,使多糖不能有效溶出;隨著酶解溫度升高,反應(yīng)速度加快,酶的活性增強(qiáng),多糖溶出量增大,多糖得率升高;當(dāng)酶解溫度高于一定范圍,部分酶發(fā)生變性而失去活力,同時(shí)部分多糖可能被降解為單糖,使多糖得率隨之降低。因此通過(guò)單因素試驗(yàn)可得,最佳酶解溫度為45 ℃。
圖3 酶解溫度對(duì)紫薯多糖得率的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the extraction yield of polysaccharides from purple sweet potato
2.1.4 不同酶解時(shí)間對(duì)紫薯多糖提取率的影響
由圖4可知,當(dāng)酶解時(shí)間在0.5~1 h之間時(shí),多糖提取率隨之增加而增加,超過(guò)1.5 h時(shí),提取率逐漸下降,即在1.5 h處達(dá)到最大值。導(dǎo)致該現(xiàn)象的原因可能是酶解時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng),多糖和復(fù)合酶可能在熱作用下發(fā)生分解,多糖得率降低。這可能是由于隨著時(shí)間的延長(zhǎng),有越來(lái)越多的細(xì)胞被破壞,多糖溶出;超過(guò)1.5 h后,已經(jīng)被釋放出的多糖可能有部分被水解,從而導(dǎo)致多糖得率下降。因此,通過(guò)酶解時(shí)間單因素試驗(yàn)可知,將酶解時(shí)間設(shè)置為1.5 h時(shí)紫薯多糖的提取效果最佳。
圖4 酶解時(shí)間對(duì)紫薯多糖提取率的影響
2.1.5 不同酶解pH對(duì)紫薯多糖提取率的影響
由圖5可知,隨著酶解pH值的升高,多糖的提取率也明顯增加;當(dāng)pH值為加入復(fù)合酶后的原液pH(5.71±0.2)時(shí),多糖得率最大,為2.721%;之后隨著pH值的進(jìn)一步增加,紫薯多糖得率下降。pH值是影響酶活性的一個(gè)重要因素,pH值升高影響酶與底物的親和力,酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,活性遭到破壞,使得多糖提取率降低。因此,最佳酶解pH值為原液pH(5.71±0.2)。
圖5 酶解pH對(duì)紫薯多糖提取率的影響
采用Minitab 17軟件對(duì)表2進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果效應(yīng)評(píng)價(jià)[25],結(jié)果見(jiàn)表4和表5。
表4 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值 Table 4 The design and response values of Plackett-Burman experiments
表5 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)各因素效應(yīng)評(píng)價(jià)Table 5 The effect evaluation of various factors of Plackett-Burman experimental design
由表5可知,影響多糖得率因素最強(qiáng)的是P1(液料比),其余因素的強(qiáng)弱排序是P3(酶解時(shí)間)>P2(復(fù)合酶添加量)>P4(酶解溫度)>P5(酶解pH)。因此,選擇酶解時(shí)間、酶解溫度、復(fù)合酶添加量和液料比這4個(gè)因素進(jìn)一步做響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析。根據(jù)單因素試驗(yàn),將酶解pH定在較好水平上,即酶解pH為復(fù)合酶添加后pH(5.71±0.2)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。
由Design-Expert軟件將上述4個(gè)因素分析后設(shè)計(jì)出29組試驗(yàn)方案,根據(jù)軟件給出的試驗(yàn)順序進(jìn)行試驗(yàn),試驗(yàn)方案及其結(jié)果見(jiàn)表6。
表6 紫薯多糖提取的響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 6 Response surface design scheme and experimental results of polysaccharides from purple sweet potato
續(xù) 表
2.4.1 模型方程的建立與顯著性檢驗(yàn)
利用Design-Expert 8.0.2軟件,通過(guò)對(duì)表6中紫薯多糖提取試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,獲得多糖得率對(duì)編碼自變量的回歸方程:
Y=2.63+0.16A+0.12B+0.040C-0.086D-0.053AB+0.018AC-0.12AD-2.500E-003BC+0.050BD+0.12CD-0.56A2-0.28B2-0.24C2-0.13D2。
(2)
對(duì)模型進(jìn)行方差分析,見(jiàn)表7。
表7 擬合二次多項(xiàng)式模型的方差分析Table 7 Analysis of variance (ANOVA) for the fitted quadratic polynomial model
續(xù) 表
由表7方差分析結(jié)果可知,該試驗(yàn)二次模型擬合性極顯著(P模型<0.0001<0.001),表明模型極顯著;而粗多糖得率失擬項(xiàng)不顯著(P模型失擬項(xiàng)=0.7451>0.05),表明無(wú)失擬因素存在,此結(jié)果說(shuō)明數(shù)據(jù)與模型的擬合程度較高,試驗(yàn)誤差小,所得二次回歸模型合適。對(duì)回歸方程系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),分析表明一次項(xiàng)A、B、D差異極顯著(P<0.01),即酶解溫度、酶解時(shí)間和液料比對(duì)紫薯多糖得率有顯著影響;交互項(xiàng)AD、CD差異顯著(P<0.05),即液料比和酶解溫度的交互作用以及復(fù)合酶添加量和酶解溫度的交互作用對(duì)紫薯多糖得率有顯著影響;二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2差異極顯著(P<0.01),即酶解溫度的二次項(xiàng)、復(fù)合酶添加量的二次項(xiàng)、酶解時(shí)間的二次項(xiàng)和液料比的二次項(xiàng)對(duì)紫薯多糖得率有顯著影響。
2.4.2 復(fù)合酶法紫薯多糖提取的響應(yīng)面分析
根據(jù)Design-Expert 8.0.2軟件擬合所得方程做二維等高線(xiàn)圖和三維圖來(lái)直觀(guān)展示各因素的交互作用,并分析交互作用的影響程度。在二維等高線(xiàn)圖中,若最內(nèi)側(cè)等高線(xiàn)為圓形,表明圖中兩個(gè)因素的交互作用不明顯,最內(nèi)側(cè)等高線(xiàn)為橢圓形則表明相互影響較大[26]。得到響應(yīng)面三維圖及其等高線(xiàn),見(jiàn)圖6~圖11。
從響應(yīng)面三維圖像中可直觀(guān)地看出各因素對(duì)響應(yīng)值的影響,圖6~圖11的響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖以及表7的擬合二次多項(xiàng)式模型的方差分析表明,4個(gè)因素中對(duì)紫薯多糖提取率影響最大的是液料比,影響最小的是復(fù)合酶添加量。復(fù)合酶法提取紫薯多糖的最佳提取工藝響應(yīng)值最大為2.743%,此時(shí)工藝參數(shù)為酶解時(shí)間95.00 min,酶解溫度43.75 ℃,復(fù)合酶添加量4.04%,液料比30.96∶1(mL/g)。
2.4.3 驗(yàn)證試驗(yàn)
為驗(yàn)證模型的可預(yù)測(cè)性,同時(shí)綜合考慮最佳提取工藝參數(shù)下,即酶解溫度43.75 ℃,酶解時(shí)間95.00 min,復(fù)合酶添加量4.04%,液料比30.96∶1(mL/g),在操作可行的基礎(chǔ)上,最終將復(fù)合酶法紫薯多糖最佳提取工藝條件修正為:酶解溫度44 ℃,酶解時(shí)間95 min,液料比31∶1(mL/g),復(fù)合酶添加量4%,對(duì)模型所得到的最佳工藝條件進(jìn)行檢驗(yàn)和驗(yàn)證。所得平均多糖得率為2.759%,與理論值2.743%相比,相對(duì)誤差為0.016%,說(shuō)明回歸方程可以較真實(shí)地反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響,證明運(yùn)用響應(yīng)面優(yōu)化復(fù)合酶法提取紫薯多糖工藝的回歸模型可以使用。
2.5.1 紫薯多糖對(duì)·OH的清除能力
由圖12可知,紫薯多糖濃度越高,對(duì)·OH的清除能力越大。相同濃度抗壞血酸對(duì)羥自由基的清除率高于紫薯多糖,在0.5 mg/mL時(shí)清除率為80.1%,而紫薯多糖為59.5%。結(jié)果表明,紫薯多糖能高效去除羥自由基且濃度越高清除率越大,但效果低于同樣濃度下的抗壞血酸。
圖12 紫薯多糖對(duì)·OH的清除能力Fig.12 The scavenging ability of polysaccharides from purple sweet tomato on ·OH
2.5.2 紫薯多糖對(duì)DPPH·的清除能力
由圖13可知,在濃度為0.5 mg/mL時(shí),抗壞血酸對(duì)1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH·)的清除率為95.4%。而紫薯多糖對(duì)1,1-二苯基-2-苦肼基的清除率隨濃度增大而逐步增強(qiáng),在濃度為0.5 mg/mL時(shí),紫薯多糖對(duì)DPPH·的清除率為61.8%。結(jié)果表明,紫薯多糖對(duì)1,1-二苯基-2-苦肼基具有一定的清除能力,但其清除效果較相同濃度下的抗壞血酸弱。
圖13 紫薯多糖對(duì)DPPH·的清除能力Fig.13 The scavenging ability of polysaccharides from purple sweet tomato on DPPH·
2.5.3 紫薯多糖對(duì)O2-·的清除能力
由圖14可知,在濃度為0.5 mg/mL時(shí),抗壞血酸對(duì)超氧陰離子自由基(O2-·)清除率為95.3%。而紫薯多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除率隨濃度增大而逐步增強(qiáng),在濃度為0.5 mg/mL時(shí),紫薯多糖對(duì)O2-·的清除率達(dá)到最大,為46.3%。結(jié)果表明,紫薯多糖對(duì)超氧陰離子自由基具有一定的清除能力,但其清除效果較相同濃度下的抗壞血酸弱。
圖14 紫薯多糖對(duì)O2-·的清除能力Fig.14 The scavenging ability of polysaccharides from purple sweet tomato on O2-·
在復(fù)合酶配比預(yù)試驗(yàn)與單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行關(guān)鍵因素篩選試驗(yàn),從而依據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,運(yùn)用響應(yīng)曲面分析法展開(kāi)四因素三水平試驗(yàn),得到紫薯多糖提取工藝的較優(yōu)提取參數(shù)為:液料比31∶1(mL/g),酶解時(shí)間95 min,復(fù)合酶添加量4%,酶解溫度44 ℃。
經(jīng)體外抗氧化活性試驗(yàn),結(jié)果顯示:紫薯多糖能顯著清除·OH、DPPH·、O2-·,且與多糖濃度呈正相關(guān),存在一定的抗氧化活性。本試驗(yàn)對(duì)紫薯多糖復(fù)合酶法的最優(yōu)提取參數(shù)與抗氧化活性進(jìn)行了初步探究,為紫薯多糖的深入研究奠定了基礎(chǔ),并為多糖開(kāi)發(fā)與利用提供了一定的參考意義。