劉俊霞 趙 萍 萬小輝 別玲玲 金文剛,3

(1. 陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723001；2. 陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 漢中 723001；3. 陜西理工大學(xué)大鯢研究所，陜西 漢中 723001)

大鯢(Andriasdavidianus)為中國(guó)特有珍稀物種，是現(xiàn)存?zhèn)€體最大的兩棲動(dòng)物，也是中國(guó)《人工繁育國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)水生野生動(dòng)物名錄》(第一批)物種之一[1]，具有較高的食用價(jià)值和藥用價(jià)值[2]。目前，有關(guān)大鯢營(yíng)養(yǎng)組成[3]、活性肽[4]、膠原蛋白/明膠[5]、魚油[6]、胴體分割加工與貯藏保鮮[7]等方面的研究較多。一些大鯢養(yǎng)殖龍頭企業(yè)也推出了大鯢膠原蛋白、日化用品、速凍肉丸等深加工產(chǎn)品[8]，一定程度上促進(jìn)了大鯢產(chǎn)業(yè)鏈的延伸。

肝臟是大鯢內(nèi)臟的主要組成部分，約占內(nèi)臟的50%～60%，是大鯢加工的主要副產(chǎn)物。動(dòng)物肝臟含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[9]。目前對(duì)大鯢肝臟的研究主要涉及到營(yíng)養(yǎng)組分及比例[10]、蛋白質(zhì)種類[11]、脂肪酸種類及比例[12]等。飼養(yǎng)大鯢以魚餌料為主，商品鯢不同分割部位特別是肝臟有較重腥味，限制了部分消費(fèi)者的接受度和進(jìn)一步應(yīng)用開發(fā)。水產(chǎn)品中腥味物質(zhì)種類多樣[13]，其主要檢測(cè)方法為感官分析和儀器檢測(cè)[14]。揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的檢測(cè)技術(shù)如氣相色譜—嗅聞、電子鼻、氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用、全二維氣相色譜—飛行時(shí)間質(zhì)譜和氣相—離子遷移譜等被廣泛運(yùn)用[15-19]。與傳統(tǒng)氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)相比，氣相—離子遷移色譜(GC-IMS)是新興的揮發(fā)性有機(jī)物分離和檢測(cè)技術(shù)，具有樣品制備簡(jiǎn)單、高靈敏度和風(fēng)味成分可視化等優(yōu)點(diǎn)，被逐漸用于水產(chǎn)品加工貯藏、烹飪過程中揮發(fā)性成分檢測(cè)[20-21]。

目前，脫腥方法主要是基于物理法、生物法、復(fù)合法等[22]，其中感官掩蔽法的使用最為廣泛。感官掩蔽法[23]主要通過浸泡、腌制等工藝，利用特殊風(fēng)味掩蓋腥味物質(zhì)，具有低成本、易操作等優(yōu)點(diǎn)。茶葉是一種優(yōu)良的脫腥原料，具有降低腥味、提高茶葉清香的能力。采用綠茶水作為脫腥劑對(duì)金槍魚進(jìn)行脫腥處理，不僅可以降低金槍魚腥味，還不會(huì)引起魚肉污染[24]。張淼等[25]通過響應(yīng)面法優(yōu)化綠茶復(fù)合脫腥劑對(duì)銀鱈魚的脫腥效果。張朝敏等[26]發(fā)現(xiàn)茶多酚—海藻糖不僅能夠?qū)︺y鱈魚的腥味進(jìn)行脫除，還能有效抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。此外，用紅茶對(duì)美國(guó)大口胭脂魚[27]進(jìn)行處理，也取得了一定的脫腥效果。

課題組[8]前期研究利用GC-IMS對(duì)大鯢不同部位揮發(fā)性氣味成分進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)大鯢肝臟與其他部位揮發(fā)性成分具有較大差異。但是有關(guān)大鯢肝臟脫腥前后揮發(fā)性氣味成分的研究尚未見報(bào)道。研究擬利用GC-IMS技術(shù)分析茶葉水提液處理對(duì)大鯢肝臟揮發(fā)性有機(jī)物的動(dòng)態(tài)變化，并結(jié)合主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)等多元統(tǒng)計(jì)方法篩選潛在特征揮發(fā)性化合物，旨在為大鯢肝臟脫腥及開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

大鯢肝臟：漢中市龍頭山水產(chǎn)養(yǎng)殖開發(fā)有限公司，試驗(yàn)當(dāng)天大鯢分割生產(chǎn)線取樣，2 h內(nèi)低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后4 ℃冷藏備用；

漢中綠茶：市售；

蘆丁、沒食子酸：優(yōu)級(jí)純，上海源葉生物科技有限公司；

兒茶素：色譜純，上海源葉生物科技有限公司；

福林酚、碳酸鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

乙酸：色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

乙腈：色譜純，美國(guó)默克公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

風(fēng)味分析儀：FlavourSpec?型，德國(guó)GAS公司；

高速低溫離心機(jī)：BR4I型，賽默飛世爾科技有限公司；

紫外可見分光光度計(jì)：8453型，安捷倫科技有限公司；

分析天平：FA3204B型，上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；

液相色譜儀：1260型，安捷倫科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

(1)茶葉水提液的制備：將綠茶粉碎，過40目，按茶水比(m綠茶∶V水)1∶200 (g/mL)加入100 ℃蒸餾水，浸泡2 h(每30 min搖動(dòng)一次)，冷卻至(25±2)℃，取上清液，3 000 r/min離心10 min，收集上清液備用(含茶多酚1.25 g/100 mL，兒茶素74.05 mg/L，總黃酮0.06 g/100 mL)。

(2)大鯢肝樣品制備：大鯢肝臟經(jīng)流水清洗后，切為薄片(厚度約0.7 cm)，準(zhǔn)確稱取5 g大鯢肝臟薄片，加入25 mL茶葉水提液，分別浸泡0，5，10，15，20 min，流水清洗，用廚房紙吸干表面水分，分別標(biāo)記為TE-0 min、TE-5 min、TE-10 min、TE-15 min和TE-20 min，裝入自封袋4 ℃冷藏備用。

1.2.2 感官評(píng)價(jià) 按GB/T 16291.2—2010執(zhí)行，并參照王妍等[28]的方法制定如表1所示的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。

表1 大鯢肝臟脫腥評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Evaluation standard of giant salamander liver smell

1.2.3 大鯢肝揮發(fā)性成分分析 采用GC-IMS對(duì)脫腥處理后的大鯢肝臟揮發(fā)性氣味進(jìn)行分析。精密稱取不同處理時(shí)間的大鯢肝臟勻漿2.0 g，置于20 mL頂空瓶中進(jìn)行自動(dòng)頂空進(jìn)樣。進(jìn)樣體積500 μL，孵育時(shí)間15 min，孵育溫度60 ℃，進(jìn)樣針溫度85 ℃，孵化轉(zhuǎn)速500 r/min。GC-IMS參數(shù)：MXT-5色譜柱，15 mL，0.53 mm ID，1 μm FT，柱溫60 ℃，載氣/漂移氣為N2，IMS溫度45 ℃，分析時(shí)間20 min。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析(P<0.05)。利用風(fēng)味儀LAV和 Reporter、Dynamic插件分析風(fēng)味物質(zhì)數(shù)據(jù)。SIMCA-P 14.1軟件進(jìn)行PCA、OPLS-DA分析，繪制散點(diǎn)圖、置換檢驗(yàn)擬合曲線和VIP值圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同脫腥時(shí)間下大鯢肝腥味值評(píng)分

由表2可知，大鯢肝初始腥味值為4.43，經(jīng)茶葉水提液處理5 min后，腥味值顯著降低(P<0.05)；處理10 min后，隨著脫腥時(shí)間的增加，腥味降低幅度逐漸平緩，與項(xiàng)怡等[29]的結(jié)論相似。這可能是茶葉水提液中茶多酚類、黃酮類物質(zhì)與大鯢肝揮發(fā)性成分發(fā)生相互作用，經(jīng)脫腥處理后的大鯢肝帶有淡淡的茶香味[24]。

表2 不同脫腥時(shí)間下大鯢肝腥味值評(píng)分?Table 2 Smell score of giant salamander liver at different deodorization time

2.2 脫腥時(shí)間對(duì)大鯢肝臟揮發(fā)性成分的影響

由圖1可知，不同脫腥時(shí)間處理的大鯢肝中揮發(fā)性有機(jī)物在組間差異性觀察方面存在一定難度，故將三維譜圖進(jìn)行降維處理以更好地分析脫腥時(shí)間對(duì)大鯢肝風(fēng)味物質(zhì)的影響。

離子峰兩側(cè)的每個(gè)點(diǎn)代表1種揮發(fā)性成分，顏色的深淺表示含量的高低圖1 不同脫腥時(shí)間下大鯢肝臟GC-IMS三維譜圖Figure 1 Three dimentional GC-IMS spectrum of the liver of giant salamander at different deodorization times

圖2(a)為圖1的二維俯視圖，圖2(b)為差異譜圖，為了使樣品間的差異性可視化，將未脫腥大鯢肝的譜圖作參照，其余4組樣品依次扣背景色至灰色。當(dāng)樣品中的揮發(fā)性物質(zhì)含量高于參比含量時(shí)，該物質(zhì)顯示白色，反之顯示黑色。經(jīng)歸一化處理后的反應(yīng)離子峰位于橫坐標(biāo)1.0處，1.0豎線兩側(cè)任意一點(diǎn)的顏色深淺可以反映出揮發(fā)性物質(zhì)濃度的高低。

圖2 不同脫腥時(shí)間下大鯢肝臟GC-IMS二維譜圖Figure 2 Two dimentional GC-IMS spectrum of the liver of the salamander at different deodorization times

2.3 不同脫腥時(shí)間下大鯢肝臟GC-IMS揮發(fā)性成分定性分析

由表3可知，不同脫腥時(shí)間下大鯢肝樣品中共鑒定出32種揮發(fā)性有機(jī)物成分，包括10種醇類、8種醛類、5種酯類、5種酮類、3種烯烴類和1種醚類化合物。

由圖3可知，未經(jīng)脫腥處理的大鯢肝臟中揮發(fā)性成分主要以醇類(29.80%)和酮類(44.00%)化合物為主，醛類(8.66%)、酯類(7.05%)、醚類(9.51%)和烯烴類(0.99%)化合物含量較少。經(jīng)茶葉水提液處理后的揮發(fā)性成分組成發(fā)生了變化，脫腥20 min后的大鯢肝臟中揮發(fā)性成分仍以醇類(25.57%)和酮類(48.73%)為主，其次為醛類(12.36%)、酯類(4.80%)、醚類(7.79%)和烯烴類(0.75%)。5 min后，隨著脫腥時(shí)間的增長(zhǎng)，肝臟中的揮發(fā)性成分并未大幅度波動(dòng)。

圖3 不同脫腥時(shí)間下大鯢肝臟揮發(fā)性成分相對(duì)含量變化Figure 3 Relative content changes of volatile components in liver of giant salamander at different deodorization time

醇類化合物的相對(duì)含量在脫腥處理15 min時(shí)達(dá)到最小值23.4%，處理20 min時(shí)相對(duì)含量向上波動(dòng)達(dá)到25.57%，但與0 min相比總體呈下降趨勢(shì)，與徐永霞等[30]的結(jié)果一致。其中異戊醇、異丁醇、異丙醇的相對(duì)含量較高，但其閾值較高，對(duì)腥味的貢獻(xiàn)較小。蘑菇醇具有蘑菇味、土腥味，閾值較低，是大鯢肝臟主要的腥味成分之一[8]，其相對(duì)含量較高，隨著脫腥時(shí)間的增加，含量與0 min 相比明顯降低。庚醇閾值和相對(duì)含量較低，在整個(gè)脫腥過程中波動(dòng)較小。與庚醇變化趨勢(shì)相似，糠醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-2-丁醇在整個(gè)脫腥過程中相對(duì)含量波動(dòng)較小，且相對(duì)含量較低。正己醇的閾值較高，相對(duì)含量較低，經(jīng)脫腥處理其相對(duì)含量與未脫腥的相比明顯降低，但各脫腥時(shí)間下的相對(duì)含量無明顯差異。由表3可知，所有醇類化合物經(jīng)脫腥處理后，其相對(duì)含量均有降低的趨勢(shì)，表明茶葉水浸泡有一定的脫腥效果。其脫腥機(jī)理可能是低級(jí)醇能溶于茶葉水，且茶葉水中化學(xué)成分復(fù)雜，部分組分與部分醇類反應(yīng)使腥味減輕。

表3 不同脫腥時(shí)間下大鯢肝臟揮發(fā)性成分相對(duì)含量及定性分析?Table 3 Relative content and qualitative analysis results of volatile components in liver of giant salamander at different deodorization time

醛類化合物的相對(duì)含量呈先降低后增加的趨勢(shì)，脫腥處理15 min時(shí)的相對(duì)含量超過未脫腥的，脫腥處理5 min時(shí)的相對(duì)含量達(dá)到最小值7.69%。其中異戊醛、正己醛的相對(duì)含量較高且閾值較低[31]，對(duì)大鯢肉的腥味貢獻(xiàn)較大。異戊醛、正己醛、2-甲基丁醛在整個(gè)脫腥過程中的相對(duì)含量呈波動(dòng)的趨勢(shì)，并分別在脫腥處理10，15，20 min 時(shí)的相對(duì)含量超過未脫腥的，而(E)-2-庚烯醛、反-2-辛烯醛、2-甲基丁醛的相對(duì)含量較未脫腥的呈降低的趨勢(shì)。除芳醛以外，低級(jí)醛的羰基可以與水中的氫形成氫鍵可溶于水，故部分醛類化合物的相對(duì)含量降低，而一些醛類的增加，可能是減少的醇類化合物部分氧化形成醛類，也可能是茶葉水?dāng)y帶至大鯢肝臟所致，其變化機(jī)理尚不明確。

酮類化合物的相對(duì)含量為44.00%～53.18%，其相對(duì)含量在整個(gè)脫腥過程中占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，且均明顯高于未脫腥的。2,3-丁二酮的閾值較低，但其相對(duì)含量較低，在整個(gè)脫腥過程中波動(dòng)幅度較小。2-丁酮、2-戊酮的相對(duì)含量較高，但其閾值較高，對(duì)大鯢肉的腥味貢獻(xiàn)較小。脫腥后2-丁酮的相對(duì)含量較脫腥前降低，2-戊酮的相對(duì)含量呈波動(dòng)趨勢(shì)，但變化幅度不大。丙酮的相對(duì)含量最高，在酮類化合物中占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，在脫腥處理15 min時(shí)達(dá)最大值42.44%，脫腥處理20 min時(shí)降至36.48%，經(jīng)脫腥處理后丙酮的相對(duì)含量均高于未脫腥的，且處理前15 min，均隨脫腥時(shí)間的增加而增加，說明丙酮的相對(duì)含量主要來自于茶葉水[32]，而在脫腥處理20 min時(shí)出現(xiàn)小幅度的降低可能是大鯢肝臟吸收飽和且茶葉水中丙酮含量有限。

酯類化合物在整個(gè)脫腥過程中呈降低的趨勢(shì)，與吳燕燕等[33]的結(jié)果相似。丙酸乙酯的相對(duì)含量較低，在整個(gè)脫腥過程中波動(dòng)較小，其余酯類化合物的相對(duì)含量均隨脫腥時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，說明茶葉水對(duì)大鯢肝臟酯類揮發(fā)性物質(zhì)的脫除具有一定的作用，其相對(duì)含量的降低可能與醇類物質(zhì)的減少有關(guān)。

烯烴類化合物在脫腥處理5 min時(shí)出現(xiàn)明顯的增加，其他時(shí)間的相對(duì)含量波動(dòng)不大，其波動(dòng)主要表現(xiàn)在雙戊烯的明顯波動(dòng)。烯烴類化合物在脫腥處理0 min時(shí)相對(duì)含量較低，表明大鯢肝臟本身含該類化合物的含量降低，脫腥處理5 min時(shí)含量明顯增加，表明該物質(zhì)為茶葉水?dāng)y帶至大鯢肝臟，而經(jīng)脫腥處理10，15，20 min的相對(duì)含量較5 min 的明顯降低，且與0 min的相比波動(dòng)不大，主要是因?yàn)殡p戊烯在環(huán)境中極不穩(wěn)定，容易發(fā)生反應(yīng)失去雙鍵。

二甲基二硫醚閾值較低，脫腥處理5 min時(shí)由9.51%增加到10.02%，但增加不明顯，而后降低，在脫腥處理20 min 時(shí)降至7.79%。二甲基二硫醚有臭味[34]，不溶于水，易與氧化劑反應(yīng)，其相對(duì)含量的減少主要是由于茶葉水中茶多酚、維生素C等氧化劑與其發(fā)生化學(xué)反應(yīng)所致。

綜上，茶葉水對(duì)大鯢肝臟的最佳脫腥時(shí)間為10 min，脫腥機(jī)理主要涉及兩方面：① 部分腥味化合物可溶于茶葉水；② 一些腥味化合物與茶葉中的化合物發(fā)生反應(yīng)。

2.4 不同脫腥時(shí)間下大鯢肝揮發(fā)性物質(zhì)主成分分析

由圖4可知，在95%的置信區(qū)間內(nèi)，前兩個(gè)主成分PC1和PC2的貢獻(xiàn)率分別為62.8%，19.2%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為82%，說明這兩個(gè)主成分可以解釋82%的原始數(shù)據(jù)。累積Q2為0.645，表示模型解釋度高，預(yù)測(cè)能力較好。脫腥處理0，5 min的樣品位于PC1的負(fù)方向，脫腥處理10，15，20 min的樣品位于PC1正方向，說明在脫腥過程中大鯢肝揮發(fā)性氣味化合物發(fā)生了較大變化。脫腥處理0 min 的樣品位于第2象限，脫腥處理5 min的樣品位于第3象限，脫腥處理10 min的樣品位于第4象限，脫腥處理15 min的樣品分布于第1象限和第4象限，脫腥處理20 min的樣品位于第1象限，組間能夠?qū)崿F(xiàn)較好的區(qū)分，但組內(nèi)聚集程度低，差異較大。

圖4 不同脫腥時(shí)間下大鯢肝揮發(fā)性成分主成分Figure 4 PCA score plot of volatile organic compounds of giant salamander liver at different deodorization time

2.5 正交偏最小二乘判別及模型驗(yàn)證

由圖5(a)可知，與無監(jiān)督的PCA得分散點(diǎn)圖相比，不同脫腥時(shí)間下大鯢肝樣品得到較大程度的分離，聚類良好，降低了樣品之間的組內(nèi)差異[35]。其中R2X為0.976，R2Y為0.964，Q2為0.806，說明OPLS-DA模型的解釋率和擬合度較高。由圖5(b)可知，截距值R2=0.641，Q2=-1.1，均小于OPLS-DA模型中的R2Y和Q2的原始值，回歸線呈向上的趨勢(shì)，模型未出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象。

圖5 不同脫腥時(shí)間下大鯢肝揮發(fā)性成分OPLS-DA得分圖和置換檢驗(yàn)Figure 5 OPLS-DA score and permutation of liver volatile components in giant salamander at different time of deodorization

2.6 潛在揮發(fā)性化合物的篩選

由圖6可知，S-plot圖兩端的變量對(duì)分型貢獻(xiàn)較大，對(duì)分型貢獻(xiàn)較小的變量聚集原點(diǎn)附近。各個(gè)組別之間Q2和R2均大于0.8，表明各組別間能很好區(qū)分。對(duì)不同組別分型貢獻(xiàn)較大的化合物有丙酮、2-丁酮單體、2-丁酮二聚體、蘑菇醇、2-戊酮、二甲基二硫醚、雙戊烯二聚體等。

圖6 組間S-plotFigure 6 S-plot between groups

以VIP>1為指標(biāo)進(jìn)行篩選[36]，大鯢肝脫腥過程中共篩選出10種潛在特征揮發(fā)性化合物[圖7(a)]，包括4種酮類(丙酮、2-丁酮單體、2-丁酮二聚體和2-戊酮)、2種醇類(蘑菇醇和異戊醇單體)、2種醛類(異戊醛單體和正己醛單體)、1種烯類(雙戊烯二聚體)和1種醚類(二甲基二硫醚)。由圖7(b)可知，脫腥過程中，隨著脫腥時(shí)間的延長(zhǎng)，蘑菇醇、2-丁酮二聚體、異戊醇單體、2-丁酮單體含量總體呈下降趨勢(shì)；正己醛單體、異戊醛單體、丙酮相對(duì)含量呈上升趨勢(shì)；雙戊烯二聚體、2-戊酮、二甲基二硫醚相對(duì)含量在脫腥處理5 min時(shí)最高。

圖7 大鯢肝脫腥過程中揮發(fā)性成分Figure 7 Volatile components in giant salamander sliver during deodorization

3 結(jié)論

利用茶葉水提液對(duì)大鯢肝進(jìn)行脫腥處理，采用感官評(píng)價(jià)結(jié)合GC-IMS技術(shù)對(duì)大鯢肝腥味進(jìn)行分析，初步確定了利用茶葉水提液脫腥處理前后大鯢肝揮發(fā)性有機(jī)物成分的變化。結(jié)果表明，隨著脫腥時(shí)間的增加，腥味值逐漸降低。利用GC-IMS技術(shù)共鑒定出32種揮發(fā)性有機(jī)化合物，包括10種醇類、8種醛類、5種酯類、5種酮類、3種烯烴類和1種醚類。主成分分析表明，兩個(gè)主成分累積貢獻(xiàn)率達(dá)到82%，組間聚類較好，組內(nèi)差異較大。采用正交偏最小二乘法判別分析建立了穩(wěn)定性和預(yù)測(cè)能力較好的判別模型，依據(jù)VIP>1篩選出10種揮發(fā)性化合物，包括4種酮類(丙酮、2-丁酮單體、2-丁酮二聚體和2-戊酮)、2種醇類(蘑菇醇和異戊醇單體)、2種醛類(異戊醛單體和正己醛單體)、1種烯類(雙戊烯二聚體)和1種醚類(二甲基二硫醚)。脫腥過程中，隨著脫腥時(shí)間的延長(zhǎng)，蘑菇醇、2-丁酮二聚體、異戊醇單體、2-丁酮單體含量總體呈下降趨勢(shì)，正己醛單體、異戊醛單體、丙酮相對(duì)含量呈上升趨勢(shì)。后續(xù)仍需對(duì)大鯢肝不同脫腥時(shí)間下的潛在揮發(fā)性化合物標(biāo)記進(jìn)行驗(yàn)證。