楊莉莉 李冬娟 丁盼

摘要：消化道從生理上劃分，主要包括口腔、咽部、食道、胃和腸道，口腔微生物群可隨吞咽動作進入胃腸道，有研究提示口腔微生物群—生態(tài)平衡紊亂將引起一系列口腔感染性疾病及一些全身性疾病，為探究人口腔微生物群的均勻性、多樣性和組成，并預(yù)測菌群的功能變化。本文利用無菌拭子收集頰部黏膜樣本置于口腔拭子DNA保存液中。采用特殊的測序技術(shù)對口腔微生物進行測序，并通過生物信息分析，描述口腔微生物結(jié)構(gòu)和多樣性。

關(guān)鍵詞：口腔微生物;多樣性;測序

引言：微生物群系是指在一個生態(tài)系統(tǒng)（如人體）中共存的所有微生物生命體，微生物群分布在人體的不同部位，有著重要的作用，對維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、人類健康有密切關(guān)系。口腔微生物群由數(shù)十億種微生物組成，僅次于腸道菌群，口腔微生物群對口腔健康和炎癥有促進作用，如因口腔菌群失調(diào)促進了Th17介導(dǎo)的牙周炎癥。因此為保持口腔健康及全身健康，進行口腔微生物菌群多樣性及功能性分析十分有必要。

一、口腔微生物多樣性

口腔微生物組指包括細菌、古細菌、真菌、和病毒的微生物總和，因受年齡、環(huán)境、地區(qū)、飲食習慣等影響口腔微生物顯示出一定的差異性，目前研究表明，口腔微生物的組成中，占主導(dǎo)地位的門為變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、梭桿菌門和放線菌門;在屬水平，占主導(dǎo)地位的屬為普魯士菌屬、納瑟氏菌屬、梭桿菌屬、嗜血桿菌屬、鏈球菌屬等。

1、口腔細菌多樣性

口腔細菌中可鑒定出101個不同細菌屬，硬桿菌、放線菌、鏈球菌屬、螺旋桿菌較為常見。

收集健康的未患有口腔疾病且12h內(nèi)未進行口腔清潔人群的唾液樣本置于含等量裂解液的試管中，并提取DNA，設(shè)計引物來擴增微生物16S rRNA基因的一個片段并在核糖體數(shù)據(jù)庫中進行序列比，利用序列生成系統(tǒng)發(fā)育樹，隨后確定種屬。

2、口腔真菌屬多樣性

口腔中有74中可培養(yǎng)真菌屬和11種不可培養(yǎng)真菌屬，其中以曲霉屬、念珠菌屬、枝孢菌屬和酵母菌屬為主導(dǎo)

在飯后1h收集口腔樣本，研究參與者用無菌磷酸鹽緩沖鹽水漱口，將口腔內(nèi)容物吐于離心管中，離心后提取DNA進行PCR分析，選擇能夠檢測真菌ITS1區(qū)域的引物，將標記熒光值進行電泳圖轉(zhuǎn)化，從而獲得電泳圖中每個峰的歸一化豐度。真菌菌落分析采用多標記454焦磷酸測序技術(shù)，進而分析DNA序列。

3、口腔病毒組

相對細菌以及真菌而言，人體口腔中病毒的多樣性并不豐富，已被認知的多以噬菌體、皰疹病毒為主，絕大多數(shù)口腔病毒還未屬于未知種類。利用鳥槍測序在進行病毒數(shù)據(jù)庫比對獲取相關(guān)病毒的信息。

4、口腔古細菌組

在建康的人群和患有口腔疾病的人群中均可檢測出古細菌，但目前研究表明這些古細菌不具有致病性，其中口腔甲烷桿菌、史氏甲烷短桿菌可被分離培養(yǎng)。

二、口腔微生物的功能性分析

口腔微生物與宿主之間，存在著一種微妙的平衡關(guān)系。當微生物與宿主之間處于平衡狀態(tài)時，口腔中的微生物可作為第一道屏障，阻止外源性致病菌的入侵，其中免疫防護的功能;而當微生物與宿主間的平衡失調(diào)時，則會誘發(fā)多種口腔疾病，甚至會引起全身系統(tǒng)性疾病。

1、齲齒

齲齒屬于細菌性疾病，它可繼發(fā)牙髓炎和根尖周炎，甚至引起牙槽骨和頜骨炎癥。齲齒的繼發(fā)感染可以導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎、心骨膜炎等全身其他疾病。

目前多數(shù)研究認為遠遠鏈球菌和變形鏈球菌在齲齒發(fā)生過程中具有重要作用，但分子生物學研究表明，在齲齒發(fā)生過程中，以乳酸菌、放線菌和雙歧桿菌是優(yōu)勢菌種。在進行患有齲齒和健康人群的樣本采集中，無齲齒的人群口腔微生物組構(gòu)成穩(wěn)定，而不同年齡段的齲齒患者的口腔微生物組變異較大，其中普雷沃氏菌屬、韋榮球菌屬豐度較高，表現(xiàn)出一定的生物學功能，研究表明部分口腔細菌可能是齲齒患者所缺失或被抑制的，這部分細菌的功能對于齲齒的發(fā)生具有重要意義，比如，在兒童患齲齒的患者中，表現(xiàn)出厚壁菌門減少、納瑟氏菌屬增加的特點，而在青年和成年組中，則表現(xiàn)出厚壁菌門增加、變形菌門、納瑟氏菌屬減少的特點，也說明部分菌株隨著年齡的改變功能也在發(fā)生改變。

2、牙周炎

慢性牙周炎是由菌斑及其產(chǎn)物導(dǎo)致的慢性感染性疾病，通過比對慢性牙周炎患者和健康人群的口腔微生物，確定優(yōu)勢菌屬，為慢性牙周炎的治療以及預(yù)防提供理論支撐。在該疾病患者的樣本中顯示出螺旋體屬、卡氏菌屬、單胞菌屬的高豐度，其中以革蘭氏厭氧菌為主。同時能夠引起牙周炎的菌屬在其他疾病中有一定的致病性功能，比如牙齦炎、口腔癌及其他系統(tǒng)性疾病。

3、口臭

口臭是指口腔異味，通常是因口腔微生物分解物質(zhì)而產(chǎn)生揮發(fā)性硫化物造成的，而引起口臭的微生物多存在于舌背。通過與健康人群對比，口臭患者口腔微生物表現(xiàn)出更高豐度，其中以韋德纖毛菌和口炎消化鏈球菌為代表，而健康人群則以唾液鏈球菌、真桿菌屬為優(yōu)勢菌屬。

4、口腔潰瘍

口腔潰瘍常被人們認為是上火的表現(xiàn)，但該病的誘發(fā)也與口腔微生物失調(diào)有關(guān)，表現(xiàn)出一定的周期復(fù)發(fā)性的特點，而口腔中的鏈球菌、納瑟氏菌屬以及革蘭氏陰性菌的含量降低會使口腔潰瘍的發(fā)作頻率升高，而這些菌株是健康人群的優(yōu)勢菌株，這些菌屬的降低，使得宿主與微生物的相互作用平衡遭到破壞，一些病原體入侵導(dǎo)致口腔疾病，這則體現(xiàn)出口腔微生物的屏障功能。

5、口腔鱗癌

口腔鱗癌被列為全球第八大常見惡性腫瘤，是指發(fā)生在口腔包括舌、牙齦、頰、顎等部位的鱗狀上皮癌。在以往研究中，通產(chǎn)認為罹患這種疾病的原因主要是由于吸煙、飲食、病毒感染、紫外線輻射以及個體遺傳，而在最新的研究中發(fā)現(xiàn)一些口腔微生物也與癌癥的發(fā)生有密切聯(lián)系。從口腔鱗癌組織中分離菌株并進行功能性測序，發(fā)現(xiàn)某些微生物只定植于腫瘤組織內(nèi)，說明該菌株后續(xù)可作為腫瘤標志物進行研究，比如在癌組織中發(fā)現(xiàn)鏈球菌屬、羅氏菌屬顯著減少，微小微單胞菌、梭桿菌屬顯著增加為特點?？谇晃⑸锟赏ㄟ^抑制凋亡、激活細胞增殖通路、促進細胞侵襲從而誘導(dǎo)炎癥進而引發(fā)癌癥。

結(jié)束語：隨著對口腔中的微生物的多樣性研究以及功能預(yù)測的深入研究，為后續(xù)研究口腔疾病以及預(yù)防提供了思路，可進行檢測疾病中的特定菌種，來進行菌種的抑制或擴大優(yōu)勢來減緩疾病，甚至作為全身性疾病的預(yù)警;在口腔微生物多樣性和功能性的測定中，利用的16SrRNA和焦磷酸測序技術(shù)都是十分新穎的，可檢測到許多在口腔微生物庫中未被認知的菌種，而這些菌種是否具有功能，需要進一步的研究，而這對于豐富基因庫和疾病預(yù)防具有重要意義。

參考文獻：

[1]楊曉霞，闕國鷹.16S核糖體RNA基因測序技術(shù)在口腔微生物多樣性中的研究進展[J].中南大學學報（醫(yī)學版），2020，45（07）：849-855.

[2]倪瑩，李寧，李蕙蘭，代蕓潔，梁燕.高齲均和重度牙周炎患者口腔微生物多樣性差異的研究[J].牙體牙髓牙周病學雜志，2018，28（12）：695-699+740.DOI：10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2018.012.003.

[3]周爽，蔡葉.口腔微生物群落及疾病相關(guān)性研究[J].臨床醫(yī)藥文獻電子雜志，2017，4（82）：16039-16044.

【課題項目】天樂酒廠釀造環(huán)境中微生物多樣性及功能分析（課題編號：KJ2020A1146）

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