基因組序列是開(kāi)展遺傳研究重要的信息基礎(chǔ)，自人類(lèi)基因組計(jì)劃完成以來(lái)，基因組學(xué)進(jìn)入功能研究時(shí)代。基因組研究技術(shù)引入水產(chǎn)動(dòng)物的研究后，推進(jìn)了水產(chǎn)動(dòng)物基因組的結(jié)構(gòu)和功能研究，解析和詮釋了水產(chǎn)動(dòng)物生物學(xué)現(xiàn)象的遺傳基礎(chǔ)和分子機(jī)制，在遺傳育種，疾病防治和醫(yī)藥等方面的研究應(yīng)用也取得較大進(jìn)展。本文介紹了第一、二和三代測(cè)序技術(shù)的整個(gè)發(fā)展歷程以及各自的優(yōu)缺點(diǎn)和主要測(cè)序技術(shù)或平臺(tái)。

第一代測(cè)序技術(shù)

1975年，Sanger等提出雙脫氧鏈合成終止法測(cè)序技術(shù)[1]，測(cè)定了第一個(gè)基因組序列—噬菌體X174 [2]，人類(lèi)首次實(shí)現(xiàn)了對(duì)生物遺傳信息的解碼，開(kāi)啟了全基因組測(cè)序時(shí)代。1977年，A.M.Maxam和W.Gilbert建立了DNA片段序列的測(cè)定方法，即 Maxam-Gilbert 化學(xué)降解法[3]，該測(cè)序法對(duì)未經(jīng)克隆的 DNA 片段可以直接測(cè)序。但是化學(xué)降解法過(guò)程操作繁瑣，對(duì)有毒化學(xué)品和放射性同位素接觸較多，逐漸被雙脫氧鏈終止法替代。20世紀(jì)80年代，在sanger法理論基礎(chǔ)上，出現(xiàn)了熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù)，1986年，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（Applied Biosystems Inc，ABI）推出的第一代商用ABI 370A測(cè)序儀可在雙脫氧核苷酸上直接標(biāo)記不同顏色熒光基團(tuán);1998年，ABI采用其開(kāi)發(fā)的毛細(xì)管凝膠電泳技術(shù)，推出的ABI Prism3700毛細(xì)管測(cè)序儀可同時(shí)進(jìn)行96個(gè)并行測(cè)序反應(yīng)，真正實(shí)現(xiàn)了測(cè)序規(guī)?；痆4-5]。

以上測(cè)序技術(shù)均被稱(chēng)為第一代測(cè)序技術(shù)，其中雙氧鏈終止法的應(yīng)用最為廣泛，因此第一代測(cè)序也常認(rèn)為是sanger測(cè)序。一代測(cè)序技術(shù)測(cè)序讀長(zhǎng)長(zhǎng)，準(zhǔn)確率高，主要用于PCR產(chǎn)物測(cè)序、小片段序列分析和基因分型等研究，對(duì)生物學(xué)研究具有重要意義，至今在世界范圍內(nèi)仍在使用。但是，一代測(cè)序的通量低，成本高，限制了其大規(guī)模高通量的應(yīng)用。

第二代測(cè)序技術(shù)

盡管第一代DNA測(cè)序技術(shù)以其可達(dá) 1000 bp 的測(cè)序讀長(zhǎng)、99.999% 的高準(zhǔn)確性幫助人們完成了大量的測(cè)序工作，但其測(cè)試速度慢、成本高、通量低等方面的不足，也致使其不能得到大眾化的應(yīng)用。進(jìn)入21世紀(jì)，隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步以及科研人員對(duì)測(cè)序技術(shù)的努力開(kāi)發(fā)，以Roche公司的454技術(shù)[6]、illumina公司的Solexa[7]，Hiseq技術(shù)和ABI公司的SOLiD技術(shù)[8]為標(biāo)志的第二代測(cè)序技術(shù)誕生，又稱(chēng)下一代測(cè)序技術(shù)（next generation sequencing，NGS）。

2005年，Roche 公司的454 技術(shù)是第一個(gè)商業(yè)化的二代測(cè)序平臺(tái)，初期被很多研究者使用， 454技術(shù)優(yōu)勢(shì)測(cè)序讀長(zhǎng)較長(zhǎng)，平均可達(dá)400bp[9]，缺點(diǎn)是無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)量類(lèi)似于PolyA的情況時(shí)，測(cè)序反應(yīng)會(huì)一次加入多個(gè)T，可能導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。也正是由于這一原因，454技術(shù)會(huì)在測(cè)序過(guò)程中引入插入和缺失的測(cè)序錯(cuò)誤。

Solexa 分析儀通常也被稱(chēng)為 Illumina 測(cè)序儀，所使用的方法是克隆單分子陣列技術(shù)。Illumina的測(cè)序技術(shù)每次只添加一個(gè)dNTP的特點(diǎn)能夠很好的地解決同聚物長(zhǎng)度的準(zhǔn)確測(cè)量問(wèn)題，它的主要測(cè)序錯(cuò)誤來(lái)源是堿基的替換。而讀長(zhǎng)短（200bp-500bp）也讓其應(yīng)用有所局限。

HeliScope測(cè)序儀在第二代的基礎(chǔ)上引入了單分子測(cè)序[10]的概念，被稱(chēng)為2.5代，測(cè)序前不進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，克服了第二代測(cè)序技術(shù)中需要用PCR擴(kuò)增來(lái)增強(qiáng)瑩光信號(hào)的技術(shù)難題，不進(jìn)行DNA 擴(kuò)增避免了擴(kuò)增時(shí)引入的錯(cuò)誤和偏好性，但是讀長(zhǎng)較短（25 ～ 30 bp），導(dǎo)致拼接困難、質(zhì)量低，儀器成本高，并未大規(guī)模應(yīng)用。

除此之外，Ion Torrent 測(cè)序儀是第一個(gè)不需要光學(xué)系統(tǒng)的商業(yè)測(cè)序儀，是非常適合擴(kuò)增子測(cè)序的革命性技術(shù)。與其他技術(shù)相比，Ion Torrent 測(cè)序不需要昂貴的物理成像設(shè)備，實(shí)現(xiàn)了高密度高通量陣列的制作[11]，它測(cè)序時(shí)間短，速度快，儀器設(shè)備便宜，但芯片的通量并不高，非常適合小基因組和外顯子驗(yàn)證的測(cè)序。

在過(guò)去的十多年里，二代測(cè)序技術(shù)迅猛發(fā)展，憑借其低成本、高通量的優(yōu)勢(shì)在很多領(lǐng)域得到了應(yīng)用，在很多探索性研究中，如對(duì)新物種基因組的de novo 測(cè)序、目標(biāo)區(qū)域或全基因組重測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、宏基因組測(cè)序、表觀修飾測(cè)序等領(lǐng)域都取得了突破性的進(jìn)展。第二代測(cè)序技術(shù)雖然已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，在各技術(shù)方面趨于成熟，但是依然依賴(lài)于模板擴(kuò)增、熒光分析、序列讀長(zhǎng)限制等缺點(diǎn)，以及不可避免的系統(tǒng)誤差，這些缺點(diǎn)都在一定程度上的制約了第二代測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。

第三代測(cè)序技術(shù)

測(cè)序技術(shù)經(jīng)過(guò)第一代、第二代的發(fā)展，讀長(zhǎng)從一代測(cè)序的近1000bp，降到了二代測(cè)序的幾百bp，通量和速度大幅提升，那么第三代測(cè)序的發(fā)展思路在于保持二代測(cè)序的速度和通量?jī)?yōu)勢(shì)同時(shí)，彌補(bǔ)其讀長(zhǎng)較短的劣勢(shì)。三代測(cè)序與前兩代相比，最大的特點(diǎn)就是單分子測(cè)序，測(cè)序過(guò)程無(wú)需進(jìn)行PCR擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)了對(duì)每一條DNA分子的單獨(dú)測(cè)序。第三代測(cè)序技術(shù)也叫從頭測(cè)序技術(shù)，即單分子實(shí)時(shí)DNA測(cè)序。

第三代測(cè)序技術(shù)主要包括第三代測(cè)序技術(shù)主要包括Helicos公司的真正單分子測(cè)序技術(shù)、Oxford Nanoporetech公司的單分子納米孔測(cè)序技術(shù)、Pacific Biosciences （PacBio）公司的單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)等。Helicos 公司的Heliscope是第一個(gè)商業(yè)化的單分子測(cè)序平臺(tái)，該技術(shù)基于邊合成邊測(cè)序的思想，將DNA隨機(jī)打斷成小片段分別進(jìn)行dNTP熒光標(biāo)記，經(jīng)過(guò)不斷地重復(fù)合成、洗脫、成像、淬滅過(guò)程完成測(cè)序。但是其讀長(zhǎng)短，存在很多技術(shù)限制，并未得到廣泛應(yīng)用。

ONT（Oxford Nanopore Technologies）納米孔單分子測(cè)序技術(shù)優(yōu)點(diǎn)是讀長(zhǎng)很長(zhǎng)，大約在幾十kb，甚至100 kb;通量很高;數(shù)據(jù)可實(shí)時(shí)讀取;樣品制備簡(jiǎn)單又便宜;可直接測(cè)序RNA。但錯(cuò)誤率目前相比較高，且是隨機(jī)錯(cuò)誤，而不是聚集在讀取的兩端。

下一代測(cè)序技術(shù)已成為基因組學(xué)研究中應(yīng)用最廣泛的測(cè)序技術(shù)，但在處理高GC含量基因組時(shí)也存在固有缺陷。最近，由美國(guó)Pacific Bioscience開(kāi)發(fā)的單分子實(shí)時(shí)測(cè)序 （inglemolecule Real-time，SMRT）作為第三代測(cè)序策略被引入，以彌補(bǔ)這一不足。雖然現(xiàn)在Oxford Nanopore 測(cè)序儀也逐漸投入了市場(chǎng)，但是由于它的推廣及使用都不如PacBio，因此，目前三代的測(cè)序主流還是以PacBio為主[12]。

二代和三代測(cè)序各有所長(zhǎng)，二代測(cè)序讀長(zhǎng)短、通量高、準(zhǔn)確度和性?xún)r(jià)比高，而讀長(zhǎng)長(zhǎng)、通量低、錯(cuò)誤率高、單堿基成本高是三代測(cè)序的特點(diǎn)。利用二代測(cè)序高通量和準(zhǔn)確度高的短讀長(zhǎng)片段對(duì)三代測(cè)序的長(zhǎng)讀長(zhǎng)片段進(jìn)行修正，以降低三代測(cè)序的費(fèi)用和錯(cuò)誤率。三代測(cè)序技術(shù)在基因組測(cè)序（多倍體或大量重復(fù)序列），甲基化研究，突變鑒定以及RNA直接測(cè)序等領(lǐng)域有顯著優(yōu)勢(shì)。除此之外，三代測(cè)序的缺點(diǎn)也存在缺陷：?jiǎn)巫x長(zhǎng)的錯(cuò)誤率偏高，需重復(fù)測(cè)序以糾錯(cuò)（增加測(cè)序成本）;依賴(lài)DNA聚合酶的活性;成本較高（二代Illumina的測(cè)序成本是每100萬(wàn)個(gè)堿基0.05-0.15美元，三代測(cè)序成本是每100萬(wàn)個(gè)堿基0.33-1.00美元）。生信分析軟件不夠豐富、數(shù)據(jù)積累少等。

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王錦秀 遼寧師范大學(xué)