鄧思波，黃敏慧，張迎春，吳建偉，崔古貞，陳崢宏*，王濤*

(1.貴州醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省普通高等學校病原生物學特色重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是生物體抵抗外界病原體感染的小分子先天免疫功能多肽，能夠殺死細菌、真菌、病毒等多種病原微生物，具備開發(fā)成新型抗菌藥物的巨大潛力，有希望替代傳統(tǒng)抗生素用于臨床治療[1-3]。因此，探明AMPs的分子作用機制對研究AMPs生物特性、開發(fā)新的抗菌藥物非常重要。國內(nèi)外學者普遍認為微生物細胞膜是AMPs的天然作用靶點，通過與細胞膜的相互作用，破壞細胞膜完整性而快速殺滅病原微生物[4-7]。家蠅抗真菌肽-1A(Muscadomesticaantifungal peptide-1A，MAF-1A)是本課題組發(fā)現(xiàn)的天然家蠅抗菌肽MAF-1經(jīng)構(gòu)效優(yōu)化后所獲得的衍生多肽，由26個氨基酸殘基構(gòu)成的小分子陽離子多肽，其氨基酸序列結(jié)構(gòu)與目前發(fā)現(xiàn)的AMPs不同，是一個新型的AMPs[8]。MAF-1A對白念珠菌(Candidaalbicans)等多種致病性念珠菌及其耐藥菌株均具有殺菌效果，且具有溶血活性低、細胞毒性低的特點，具有新型抗真菌藥物開發(fā)潛力[9-13]。前期研究發(fā)現(xiàn)，與大多數(shù) AMPs 細胞膜裂解殺菌模式所產(chǎn)生的快速殺菌效應不同，其作用C.albicans后并不立即導致菌細胞裂解死亡，而是在作用2 h后逐漸發(fā)揮抗菌作用，但其具體的作用機制尚不清楚。本研究旨在探討MAF-1A對C.albicans細胞膜的作用機理，為MAF-1A的開發(fā)利用提供實驗依據(jù)，為抗C.albicans藥物研發(fā)提供作用靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1MAF-1A化學合成 MAF-1A的氨基酸序列為KKFKETADKLIESAKQQ LESLAKEMK委托生工生物工程(上海)股份有限公司采用9-芴甲氧羰基(9-fluorenylmethyloxycarbonyl，F(xiàn)MOC)固相合成法合成，高效液相色譜(reversed-phase high-performance liquid chromatography，HPLC)純化、液相色譜-質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS)驗證，多肽合成純度≥98%。

1.1.2菌株C.albicans(ATCC10231)由貴州醫(yī)科大學病原生物學特色重點實驗室保存。

1.1.3主要試劑及儀器 沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(sabouraud dextrose Agar，SDA)、沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(sabouraud dextrose broth，SDB)、氟康唑(fluconazole，F(xiàn)LC)、碘化丙啶(propidium iodide，PI)均購自Solarbio(北京)有限公司；RNAiso Plus試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Master Mix)、熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR)試劑盒(SYBR Premix Ex TaqTMⅡ)均購自TaKaRa(大連)有限公司；聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增儀(美國applied biosystem)，ND2000超微量紫外分光光度計(美國Nanodrop)，Bio-RAD CFX 96TM實時熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD)，Olympus FV1000激光共聚焦掃描顯微鏡(日本Olympus)。

1.1.4引物合成 使用SnapGene軟件設計引物序列，并在美國國立生物技術(shù)信息中心(national center for biotechnology information，NCBI)上進行引物序列比對，選擇特異性引物序列，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成細胞膜甾醇合成相關(guān)基因(ERG1、ERG6、ERG5、MET6)和內(nèi)參基因(ACT1)引物，相關(guān)引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR引物

1.2 方法

1.2.1菌株活化及菌懸液制備 無菌操作下取C.albicans凍存物劃線接種于SDA平板，置于37 ℃溫箱培養(yǎng)18～24 h，用SDB培養(yǎng)基制備濃度為2×109cfu/L菌懸液。

1.2.2MAF-1A對C.albicans細胞膜作用的檢測 以終濃度為0、625、1 250及2 500 mg/L MAF-1A分別處理C.albicans12 h，以4 mg/L FLC為藥物對照，置于37 ℃培養(yǎng)箱12 h、取出，3 000 r/min離心5 min收集菌體，無菌磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌3次，再用無菌PBS重懸菌懸液，使菌懸液的濃度為2×108CFU/L。各組加入PI染料、PI染料終濃度為10 mg/L，充分混勻，室溫避光染色5 min，無菌PBS洗滌3次、最后用PBS重懸菌懸液。將菌懸液轉(zhuǎn)移至激光共聚焦掃描顯微鏡特用的培養(yǎng)皿中，在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3C.albicans總核糖核酸(total ribonucleic Acid，total RNA)的提取 以終濃度為0、1 250 mg/L MAF-1A分別處理C.albicans12 h、3 000 r/min離心5 min收集沉淀，無菌PBS洗滌3次，棄上清保留菌體沉淀。根據(jù)TaKaRa公司的Yeast Processing Reagent(for total RNA preparation)試劑說明書進行RNA提取前預處理，菌體沉淀中加入加入 Yeast Processing Buffer 80 μL、輕柔混勻；接著加入Yeast Processing Enzyme Solution80 μL、輕柔混勻，置于30 ℃水浴鍋中水浴30～50 min。再參考TaKaRa公司的RNAiso Plus試劑說明書進行總RNA的提取。

1.2.4互補脫氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid，cDNA)的合成 參照TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑說明書，全程在冰上操作；配制反應液時，為減少配制過程的誤差，按多余預混合液總體積的10%進行配制混合液。使用RNase-free水將引物稀釋至10 μmol/L再用。

1.2.5qPCR反應 參照TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑說明書在qPCR儀上進行qPCR反應，反應條件設置為：95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)，溶解條件為儀器默認條件。根據(jù)每個樣本的Ct值，依照公式2-ΔΔCt計算細胞膜麥角甾醇合成相關(guān)基因mRNA的相對表達量，以無菌超純水處理的C.albicans為對照組。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 MAF-1A對C. albicans細胞膜的影響

在激光共聚焦顯微鏡下可見，陰性對照組的C.albicans細胞未被熒光染料PI染上熒光；但經(jīng)過不同濃度MAF-1A處理之后，C.albicans細胞可被熒光染料PI染上紅色熒光，且隨著MAF-1A濃度的增加，顯微鏡視野里出現(xiàn)帶紅色熒光的C.albicans菌細胞數(shù)量隨之增加；而經(jīng)FLC(藥物對照)作用后，C.albicans細胞也未見PI熒光(圖1)。

注：DIC為無熒光通道白場圖，PI為PI熒光通道圖，Merge為白場與熒光通道合并通道圖；A、B、C、D分別代表0、625、1 250、2 500 mg/L MAF-1A，E代表4 mg/L FLC(藥物對照)。

2.2 MAF-1A對麥角甾醇合成相關(guān)基因mRNA表達水平的影響

與陰性對照組相比，經(jīng)MAF-1A處理之后的C.albicans細胞膜甾醇相關(guān)基因ERG1(t=3.227，P<0.05)、ERG6(t=81.41，P<0.01)、ERG5(t=12.81，P<0.01)、MET6(t=3.674，P<0.05)在mRNA水平的相對表達量出現(xiàn)明顯降低(圖2)。qPCR擴增曲線和溶解曲線結(jié)果所示，內(nèi)參基因ACT1和C.albicans細胞膜甾醇合成相關(guān)基因均為單一片段特異性擴增(圖3)。

注：與對照組比較，(1)P<0.01；(2)P<0.001。

注：1表示擴增曲線，2表示溶解曲線；A、B、C、D、E、F分別代表ACT1、ERG1、ERG6、ERG5、MET6基因。

3 討論

細胞膜是真菌細胞的重要結(jié)構(gòu)，其完整性是真菌細胞進行正常生長繁殖和新陳代謝的保障。而真菌細胞膜也是AMPs抗真菌作用的重要靶點之一，是目前AMPs抗真菌作用機制研究最為廣泛的方面[14-16]。實驗研究發(fā)現(xiàn)，細胞膜通透性增加，可使得一些本不能透過完整細胞膜的分子穿過細胞膜，進入到胞質(zhì)中；同時，細胞膜通透性的改變使得胞質(zhì)內(nèi)一些重要物質(zhì)流失，進而導致細胞死亡[16-18]。熒光染料PI是一種核酸染料，它不能透過完整細胞膜，但能穿過破損的細胞膜進入細胞內(nèi)[19]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，MAF-1A處理后的C.albicans能被PI染成紅色，表明PI染料可以穿過經(jīng)MAF-1A作用后的C.albicans菌細胞膜，結(jié)果提示MAF-1A能夠增加細胞膜的通透性。

麥角甾醇是C.albicans細胞膜的重要組成成分，它的存在不僅增強了細胞膜的穩(wěn)定性，此外還具有保持細胞膜內(nèi)酶的活性，參與細胞物質(zhì)交換，參與C.albicans分裂等多項重要生命活動的作用[20-22]。麥角甾醇的生物合成途徑可分3個階段:乙酰輔酶A到甲羥戊酸、甲羥戊酸到焦磷酸法呢酯和焦磷酸法呢酯到麥角甾醇[23-25]?；駿RG1是真菌中麥角甾醇合成所必需的酶之一，其編碼的是角鯊烯環(huán)氧化酶，將角鯊烯環(huán)氧化成2，3(S)-氧化角鯊烯；ERG6基因編碼的是甾醇C24甲基轉(zhuǎn)移酶，基因ERG6缺失C.albicans菌株，膜通透性改變、不能利用呼吸能源、交配能力低下和不能輸入色氨酸等功能問題；基因ERG5編碼的是固醇C-22甾醇去飽和酶，催化麥角-5，7，24(28)三烯醇還原為麥角-5，7，22，24(28)四烯醇，是生物合成麥角甾醇的細胞色素P450酶，催化甾醇側(cè)鏈上C-22(23)雙鍵的形成；MET6基因編碼的是5-甲基四氫蝶酰基三谷氨酸-高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，是麥角甾醇合成調(diào)控基因之一[25-28]。由此可見，ERG1、ERG6、ERG5、MET6這6個基因中，ERG1、ERG6編碼的是C.albicans是麥角甾醇合成過程中的限速酶；ERG5、MET6所編碼的酶類物質(zhì)可以調(diào)節(jié)C.albicans細胞膜麥角甾醇合成過程，對麥角固醇的順利合成具有重要意義。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，MAF-1A作用后，C.albicans細胞膜麥角甾醇合成相關(guān)基因ERG1、ERG6、ERG5、MET6的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了不同程度的下調(diào)(P<0.05)，表明MAF-1A能抑制C.albicans細胞膜麥角甾醇的合成，提示MAF-1A可以通過抑制C.albicans細胞膜麥角甾醇合成相關(guān)基因mRNA的表達，從而影響細胞膜的穩(wěn)定性來發(fā)揮抗C.albicans作用。

綜上所述，MAF-1A不僅能使C.albicans細胞膜通透性增加，還可以通過抑制細胞膜麥角甾醇合成相關(guān)基因mRNA的表達，二者共同破壞C.albicans細胞膜的完整性，從而發(fā)揮其對C.albicans細胞膜的破壞作用。