高光劍，王興1,，潘耀振1,**

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 肝膽外科，貴州 貴陽 550001)

原發(fā)性肝癌(primary hepatic carcinoma，PHC)占我國癌癥死因第二位，其5年生存率不足20%[1]，且發(fā)病出現(xiàn)低齡化的現(xiàn)象[2]。每年全世界肝癌的新發(fā)病例約75萬人，而每年約有70萬人死于該病[3]，如此之高的死亡率提示必須重視該疾病研究，臨床對于進(jìn)展期肝癌缺乏有效的治療手段，故而對肝癌的早期診斷及治療顯得越來越重要。在腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程中，腫瘤與宿主相互作用或腫瘤細(xì)胞生長過程中釋放、合成一類特殊物質(zhì)，它們可以反映出腫瘤在體內(nèi)演變的狀態(tài)，這一類物質(zhì)便是腫瘤標(biāo)志物，由于肝癌血清學(xué)標(biāo)記物相對于有創(chuàng)檢查在早期篩查等方面具有一定的優(yōu)勢，故尋找易于采集、檢測方便、準(zhǔn)確率高的血清學(xué)標(biāo)記物已迫在眉睫。由于微小核糖核苷酸-21(micro Ribonucleic Acid-21,microRNA-21)和異常凝血酶原(proteins induced by vitamin K absence for factor II,PIVKA-Ⅱ)具有較好的穩(wěn)定性和對肝細(xì)胞癌(hepatic cell carcinoma，HCC)診斷的靈敏度，而甲胎蛋白(Alpha-Fetoprotein,AFP)又作為經(jīng)典的肝癌血清學(xué)標(biāo)志物，故本實(shí)驗(yàn)旨在探討microRNA-21聯(lián)合PIVKA-Ⅱ、AFP在肝細(xì)胞肝癌患者的診斷符合率、復(fù)發(fā)監(jiān)測的臨床實(shí)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1研究對象 收集2016年10月—2017年8月205例病歷資料，隨機(jī)分為HCC組54例、肝硬化組(LC組)75例和健康體檢組(CG)組76例。HCC組是來自手術(shù)后病理證實(shí)為HCC的患者54例，其中男性42例、女性12例，年齡28～78歲、平均(56.72±11.36)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：初診為HCC，術(shù)前均未接受過藥物化療、放療、肝動(dòng)脈栓塞或生物治療等處理；Child-Pugh分級A～B級；一般資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：Child-Pugh分級C級；彌漫型肝癌；排除合并有其他腫瘤或者嚴(yán)重感染。LC組為同期消化內(nèi)科住院的肝硬化患者(包括飲酒、慢性肝病等所致的肝硬化，但排除合并腫瘤、活動(dòng)性肝炎、妊娠、胚胎源性腫瘤等)75例，其中男性38例、女性37例，年齡29～80歲、平均(55.96±12.74)歲。CG組為同期體檢中心的健康體檢者76例，其中男性32例、女性44例，年齡21～88歲、平均(55.37±14.87)歲。

1.1.2試劑 黑龍江哈爾濱新海基因公司的快速全血miRNA提取試劑盒(貨號B1803)，HG Taqman miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號B1802)，HG Taqman miRNA-21定量PCR試劑盒(貨號TAP01108)，HG Taqman miRNA-16定量PCR試劑盒(內(nèi)參基因，貨號TAP01511)，日本富士瑞必歐公司的PIVKA-Ⅱ試劑盒，珠海麗珠試劑股份有限公司的AFP試劑盒。

1.1.3試驗(yàn)設(shè)備 7500 Fast Real-Time PCR System(applied biosystems，USA)、日本富士瑞必歐公司的Lumipulse G1200電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀、德國西門子的ADVIA Centaur?XP 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)、日本東芝公司的Aquilion TM Prime螺旋CT，以及離心機(jī)、真空采血管、EP管、恒溫冰箱等。

1.2 方法

1.2.1PIVKA-Ⅱ及AFP標(biāo)本收集及處理方法 抽取各組受試者(HCC組和LC組入院時(shí)，CG組體檢時(shí))的清晨空腹靜脈血液3 mL置BD促凝分離膠真空管，在室溫下靜置30 min，3 000 r/min離心10 min，取上層清液置于4 ℃冰箱中保存，一部分血清于4 h內(nèi)完成血清AFP的檢測，另一部分血清用于檢測PIVKA-Ⅱ；HCC組于手術(shù)后1月、3月、6月、9月、12月時(shí)再次檢測AFP、PIVKA-Ⅱ兩項(xiàng)指標(biāo)。

1.2.2microRNA-21檢測 抽取3組受試者(HCC組和LC組入院時(shí)，CG組體檢時(shí))的清晨空腹靜脈血液5 mL置BD抗凝真空采血管，經(jīng)細(xì)胞裂解、脫水、離心、吸附柱吸附、洗脫，獲得的洗脫產(chǎn)物即為提取的microRNA；經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA產(chǎn)物進(jìn)行realtime PCR反應(yīng)，收集信號采用FAM染料通道，microRNA-21相對定量用2-ΔΔCt表示[4]。按照microRNA-21指標(biāo)的定量中位數(shù)值，對54例HCC組患者進(jìn)行高表達(dá)和低表達(dá)分層，分別于術(shù)后1月、3月、6月、9月、12月對HCC組患者進(jìn)行規(guī)律隨訪。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般資料

3組被檢者的性別、年齡、HBsAg及肝功能分級的數(shù)值比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

表1 3組被檢者一般資料

2.2 血清microRNA-21、PIVKA-Ⅱ、AFP

HCC組microRNA-21、PIVKA-Ⅱ、AFP血清學(xué)指標(biāo)分別高于肝硬化組和對照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而肝硬化組與對照組比較，microRNA-21、PIVKA-Ⅱ、AFP血清學(xué)指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

注:A為PIVKA-Ⅱ表達(dá)量，B為AFP表達(dá)量，C為microRNA-21表達(dá)量；(1)與肝硬化組及健康體檢組比較,P<0.05。

2.3 microRNA-21、PIVKA-Ⅱ、AFP單獨(dú)或聯(lián)合時(shí)診斷HCC的效能

microRNA-21、PIVKA-Ⅱ、AFP聯(lián)合檢測對HCC診斷的準(zhǔn)確度高于任何一項(xiàng)指標(biāo)單獨(dú)或者任意兩項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合的準(zhǔn)確度，因此，microRNA-21、PIVKA-Ⅱ及AFP聯(lián)合檢測對HCC患者具有更高的診斷率。見表2。

表2 microRNA-21、PIVKA-Ⅱ、AFP單獨(dú)或聯(lián)合檢測對HCC的診斷效能

2.4 microRNA-21、PIVKA-Ⅱ、AFP單獨(dú)或聯(lián)合檢測對HCC診斷價(jià)值

將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 19.0軟件中繪制ROC曲線，得到HCC組microRNA-21、PIVKA-Ⅱ、AFP指標(biāo)單獨(dú)及上述3項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合的AUC，microRNA-21、PIVKA-Ⅱ、AFP這3項(xiàng)指標(biāo)均陽性的AUC大于microRNA-21、PIVKA-Ⅱ、AFP每一項(xiàng)的AUC，證實(shí)microRNA-21、PIVKA-Ⅱ及AFP聯(lián)合檢測較上述3項(xiàng)指標(biāo)單獨(dú)檢測對HCC具有更高的診斷價(jià)值。見圖2。

注:A為AFP的ROC曲線，B為PIVKA-Ⅱ的ROC曲線，C為microRNA-21的ROC曲線，D為microRNA-21、PIVKA-Ⅱ及AFP三者聯(lián)合的ROC曲線。

2.5 microRNA-21表達(dá)水平與HCC患者治療預(yù)后

54例的HCC組患者根據(jù)中位數(shù)值而得到了高表達(dá)(n=28)和低表達(dá)(n=26)兩個(gè)分層，截止隨訪時(shí)間結(jié)束時(shí)未出現(xiàn)失訪者。從復(fù)發(fā)曲線(圖3)可見microRNA-21高表達(dá)分層的無復(fù)發(fā)曲線明顯低于低表達(dá)分層，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示microRNA-21的過表達(dá)與HCC患者術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)有著密切聯(lián)系。

圖3 HCC組中患者腫瘤復(fù)發(fā)情況

2.6 HCC組患者腫瘤復(fù)發(fā)的單因素及多因素分析

根據(jù)HCC組患者的相關(guān)資料分別進(jìn)行了腫瘤復(fù)發(fā)的單因素及多因素分析(表3)，單因素分析結(jié)果顯示腫瘤的復(fù)發(fā)與腫瘤直徑、PIVKA-Ⅱ、microRNA-21、門靜脈侵犯、腫瘤分化程度、微血管侵犯、AJCC分期有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；多因素分析結(jié)果顯示，腫瘤復(fù)發(fā)與PIVKA-Ⅱ、microRNA-21、門靜脈侵犯、分化程度、微血管侵犯及AJCC分期有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 HCC組患者腫瘤復(fù)發(fā)的單因素和多因素分析

3 討論

肝癌是一種惡性程度高、治療效果欠理想、病死率相對較高的惡性腫瘤之一。隨著研究的進(jìn)展，以根治性手術(shù)為主的綜合治療已逐步建立起來，小肝癌和非小肝癌的手術(shù)切除率的差別，在一項(xiàng)研究中得到了證實(shí)，分別為95.70%和51.20%，而術(shù)后5年生存率亦表現(xiàn)出了顯著的差異，分別為71.90%和15.40%[5]，若患者能夠通過體檢早期篩查發(fā)現(xiàn)小肝癌，經(jīng)治療后能夠在很大程度上得到痊愈。自AFP在1963年發(fā)現(xiàn)以后被臨床廣泛應(yīng)用，但是，經(jīng)過長期且大樣本的分析后發(fā)現(xiàn)其對肝癌診斷的敏感性僅為54%～63%，特異性為82%～89%[6]，且有30%～40%的的肝細(xì)胞肝癌患者呈陰性或低濃度[7]，單純依靠AFP診斷肝癌容易漏診和誤診。故而，在肝癌的早期診斷上，需要尋找到更準(zhǔn)確的指標(biāo)進(jìn)行早期診斷和監(jiān)測。1984年由Liebman發(fā)現(xiàn)的新指標(biāo)PIVKA-Ⅱ，其在HCC患者血清中會(huì)特異性表達(dá)。肝細(xì)胞微粒體羧化酶系和環(huán)氧化物還原酶是合成PIVKA-Ⅱ的重要生物酶系，其主要有4個(gè)功能域：1個(gè)γ-羧基谷氨酸區(qū)(Gla區(qū))，2個(gè)環(huán)狀區(qū)和1個(gè)催化區(qū)。在維生素K充足時(shí)，上述的Gla區(qū)將全部轉(zhuǎn)化成γ-羧基谷氨酸，從而形成正常的凝血酶原，反之則無法合成正常的凝血酶原。有實(shí)驗(yàn)表明在肝癌組織中γ-谷氨酸羧化酶活性下降明顯，而正常肝組織中未檢測到γ-谷氨酸羧化酶活性異常，從而肝癌組織中合成了異常凝血酶原[8-9]。肝癌組織產(chǎn)生PIVKA-Ⅱ的原因有很多[10]，關(guān)于HCC細(xì)胞過度分泌PIVKA-Ⅱ具體機(jī)制的研究顯示，編碼凝血酶的DNA以及mRNA的過度表達(dá)均未發(fā)現(xiàn)異常，因此，HCC細(xì)胞過度分泌PIVKA-Ⅱ認(rèn)為發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后階段。血清PIVKA-Ⅱ水平的升高與肝癌的腫瘤大小、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移與否、有無血管侵犯及腫瘤分期等臨床預(yù)后指標(biāo)相關(guān)[11]，也能預(yù)測門脈侵襲性轉(zhuǎn)移[12]。血清PIVKA-Ⅱ水平能夠預(yù)測能否完成根治性手術(shù)，還可以預(yù)測術(shù)后有無復(fù)發(fā)。大部分肝癌患者行根治性手術(shù)后血清PIVKA-Ⅱ水平迅速下降甚至恢復(fù)正常水平，而血清AFP水平由于伴有肝炎或者肝硬化仍然高于正常水平，而且術(shù)后PIVKA-Ⅱ水平持續(xù)升高或下降后又升高常預(yù)示手術(shù)不徹底或復(fù)發(fā)[13]。而且肝癌的早期診斷應(yīng)著重對慢性肝病定期監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)了PIVKA-Ⅱ升高的高危人群應(yīng)定期隨訪并結(jié)合影像學(xué)等檢查以提高早期肝癌的診斷符合率，從而能夠降低肝癌的漏診率和誤診率[14]。

microRNA是一類在逆轉(zhuǎn)錄后靶向作用于目的基因的微小核糖核苷酸，并對目的基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程起調(diào)控作用，其參與細(xì)胞增殖、分化代謝、凋亡等多種生物學(xué)過程[15]。近年來，microRNA與腫瘤的相互關(guān)系、抗癌活性以及安全穩(wěn)定性得到了廣大醫(yī)務(wù)工作者的關(guān)注，并且逐漸被研究佐證[16]。其中microRNA-21是近幾年研究最為熱門的microRNA之一，現(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)其在多種腫瘤組織中可顯著升高，其在血液升高可能為HCC瘤體因血供不足，部分腫瘤細(xì)胞缺血壞死，導(dǎo)致microRNA-21釋放入血液中，再者HCC患者合并有脈管癌栓的，microRNA-21可直接釋放入血液中，這些均會(huì)導(dǎo)致microRNA-21水平上升，這些特性導(dǎo)致microRNA-21在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)作用已不斷被重視。有研究表明microRNA-21是多種消化道腫瘤進(jìn)行術(shù)后復(fù)發(fā)監(jiān)測的指標(biāo)之一，但是缺乏組織特異性[17]。然而，由于microRNA-21具有較好的穩(wěn)定性及對HCC診斷的靈敏度，即使缺乏組織特異性，與其他腫瘤標(biāo)志物的聯(lián)合檢測對肝癌仍具有較高的研究價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)方案中HCC組microRNA-21、PIVKA-Ⅱ、AFP血清學(xué)指標(biāo)分別高于肝硬化組和對照組指標(biāo)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而肝硬化組及對照組比較上述3種血清學(xué)指標(biāo)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，排除了其他因素導(dǎo)致的microRNA-21、PIVKA-Ⅱ和AFP結(jié)果的偏差，表明肝癌會(huì)導(dǎo)致上述3項(xiàng)指標(biāo)的升高。從表2中可直觀的得出3項(xiàng)血清學(xué)指標(biāo)聯(lián)合檢測的準(zhǔn)確度高于上述任何1項(xiàng)或者任意2項(xiàng)組合，說明3項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測的準(zhǔn)確度明顯高于單一指標(biāo)，并且能彌補(bǔ)AFP在診斷效能上的不足，對HCC患者的診斷具有重要意義。圖2亦能證明microRNA-21和PIVKA-Ⅱ能彌補(bǔ)AFP在肝癌診斷效能上的不足，具有較單一AFP更高的診斷價(jià)值。將HCC組各項(xiàng)資料進(jìn)行腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)指標(biāo)的單因素及多因素分析，結(jié)果顯示，單因素分析中，腫瘤復(fù)發(fā)與腫瘤直徑、PIVKA-Ⅱ、microRNA-21、門靜脈侵犯、分化程度、微血管侵犯、AJCC分期有關(guān)(P<0.05)，而多因素分析顯示，腫瘤復(fù)發(fā)與PIVKA-Ⅱ、microRNA-21、門靜脈侵犯、分化程度、微血管侵犯、AJCC分期有關(guān)(P<0.05)，而與腫瘤直徑無明顯關(guān)系(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)將HCC組共54例患者的microRNA-21定量數(shù)值利用中位數(shù)分別進(jìn)行高表達(dá)(n=28)和低表達(dá)(n=26)分層，分析microRNA-21能否對HCC患者進(jìn)行復(fù)發(fā)監(jiān)測。隨訪時(shí)間為1～12月，分別于術(shù)后1月、3月、6月、9月、12月對HCC組患者隨診。截止隨訪時(shí)間結(jié)束時(shí)未出現(xiàn)失訪者，使用SPSS 19.0軟件中的Kaplan-Meier生存分析比較了兩種分層在HCC術(shù)后隨訪過程中的復(fù)發(fā)曲線(見圖3)。圖中可見microRNA-21高表達(dá)組的復(fù)發(fā)曲線明顯低于microRNA-21低表達(dá)組，說明microRNA-21高表達(dá)組的復(fù)發(fā)率高，microRNA-21的過表達(dá)與HCC患者術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)有著密切聯(lián)系。

綜上所述，microRNA、PIVKA-Ⅱ和AFP這3項(xiàng)指標(biāo)能對肝臟的腫瘤起到提高診斷符合率以及復(fù)發(fā)監(jiān)測等作用，因此，microRNA、PIVKA-Ⅱ和AFP這3者之間通過優(yōu)勢互補(bǔ)作用，能明顯提高彼此的診斷效能，對于我國早期肝癌，尤其是HCC患者的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療具有良好的臨床實(shí)用價(jià)值，經(jīng)過早期診斷、早期治療后能夠服務(wù)于更多的肝癌患者，為他們的健康牟取福音。