段長(zhǎng)偉,柴彥杰,趙疆東,薛 桐,孫 權(quán),胡澤兵
1970年,F(xiàn)riedenstein首次從骨髓中分離出一種多能基質(zhì)細(xì)胞,呈梭形,可以進(jìn)行體外克隆和多向分化,被稱為CFU-Fs(colony-forming unit fibroblasts),隨后發(fā)現(xiàn)這種骨髓來源的基質(zhì)細(xì)胞是間葉組織細(xì)胞譜系的共同前體細(xì)胞,因其具有干細(xì)胞的部分特性,而被命名為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)。BMSCs是一種能夠進(jìn)行體外貼壁增殖、具有成纖維細(xì)胞樣形態(tài)和多向分化潛能的異質(zhì)性細(xì)胞群,其在特定誘導(dǎo)條件下可以分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等細(xì)胞譜系。由于BMSCs易于分離和保存,具有“歸巢”特性、免疫原性低、腫瘤風(fēng)險(xiǎn)低、倫理爭(zhēng)議小等優(yōu)勢(shì),其在細(xì)胞治療和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域表現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用價(jià)值。但因缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),BMSCs在體外擴(kuò)增時(shí)的純度、活性、表型和分化潛能差異很大,這成為導(dǎo)致基礎(chǔ)研究結(jié)論各異和臨床試驗(yàn)效果不一的重要原因[1]。因此,深入認(rèn)識(shí)BMSCs不同分離方法和培養(yǎng)條件的優(yōu)缺點(diǎn),并根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康淖龀鱿鄳?yīng)選擇,是進(jìn)行BMSCs實(shí)驗(yàn)研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本文主要就BMSCs在分離培養(yǎng)中的實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)和研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。
BMSCs的種屬來源豐富、分離培養(yǎng)簡(jiǎn)單,目前研究中主要使用的BMSCs來自于人、大鼠、小鼠、犬等,采用的方法主要有差速貼壁法、密度梯度離心法、免疫磁珠分選法、流式細(xì)胞分選法等。但是不同的種屬來源和分離方法對(duì)BMSCs的細(xì)胞表型和增殖分化能力具有較大影響,應(yīng)根據(jù)具體試驗(yàn)?zāi)康倪x取合適的技術(shù)才能最大程度地減少BMSCs研究的差異性。
1.1 差速貼壁法:差速貼壁法是傳統(tǒng)的BMSCs分離方法,它利用了BMSCs與骨髓中其他細(xì)胞的貼壁性能差異及酶消化敏感性差異而逐步達(dá)到純化擴(kuò)增目的。骨髓中細(xì)胞譜系復(fù)雜,貼壁生長(zhǎng)能力差異較大,其中以巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞最容易貼壁,其次是成纖維細(xì)胞和成纖維樣細(xì)胞,最差是脂肪細(xì)胞和造血干細(xì)胞,同時(shí)BMSCs的酶消化敏感性較高,因此可以通過差速貼壁和胰酶消化的方式逐漸分離出富含BMSCs的細(xì)胞群。傳統(tǒng)操作方法是用培養(yǎng)基將骨髓沖制成細(xì)胞懸液,接種在培養(yǎng)皿中后每3 d換液以去除未貼壁細(xì)胞,經(jīng)過3~4次消化傳代后逐漸純化BMSCs[2]。由于換液和酶消化是貼壁法的關(guān)鍵步驟,也有研究從細(xì)化換液和消化時(shí)間、調(diào)整首次酶消化順序等方面做了調(diào)整[3],而huang等人則嘗試先用骨髓團(tuán)塊法貼壁,以保留BMSCs原始環(huán)境而促進(jìn)其快速增殖[4]。差速貼壁法是一種快速、簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)的BMSCs分選方法,但是獲得的細(xì)胞純度相對(duì)不高。和消化時(shí)間、調(diào)整首次酶消化順序等方面做了調(diào)整[3],而huang等人則嘗試先用骨髓團(tuán)塊法貼壁,以保留BMSCs原始環(huán)境而促進(jìn)其快速增殖[4]。差速貼壁法是一種快速、簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)的BMSCs分選方法,但是獲得的細(xì)胞純度相對(duì)不高。
1.2 密度梯度離心法:密度梯度離心法是針對(duì)骨髓中不同細(xì)胞的大小和密度差異進(jìn)行分選。骨髓細(xì)胞懸液加入到密度梯度離心液上面,通過離心使得不同類型細(xì)胞沉降至其等密度點(diǎn),然后吸取特定位置富集的細(xì)胞。在離心分層時(shí),紅細(xì)胞及多核細(xì)胞因比重(1.080 g/mL)較大而沉降于底部,其次是單個(gè)核細(xì)胞(包括BMSCs、造血干細(xì)胞、單核細(xì)胞等),懸浮密度位于(1.053~1.075)g/mL,血漿及其溶解物懸浮密度位于1.050 g/mL,而脂肪細(xì)胞將漂浮于上層。常見的梯度離心液有Ficoll、Ficoll-Paque、percoll、Lymphopre等,其具有低粘性和低滲透性,使用密度約為1.077 g/mL,經(jīng)過800 g轉(zhuǎn)速離心20 min后,可見離心管內(nèi)液體明顯分層,位于分離液之上的灰白色云霧狀層即為單個(gè)核細(xì)胞層,在獲取該層細(xì)胞后再通過差速貼壁法去除未貼壁細(xì)胞[5-6]。密度梯度離心是一種非常經(jīng)濟(jì)的BMSCs分選技術(shù),但其分選的細(xì)胞特異性有限。此外,即使它是常見的實(shí)驗(yàn)室技術(shù),密度梯度離心也是一個(gè)難以掌握的、緩慢的操作過程。
1.3 細(xì)胞表面標(biāo)志物分選法:基于細(xì)胞表面標(biāo)志物的分選方式主要通過特異性識(shí)別BMSCs上的表面抗原而針對(duì)性篩選出目的細(xì)胞。BMSCs的特異性分選和鑒定是分不開的,用來鑒定的表面抗原也常被當(dāng)做識(shí)別靶標(biāo),但是由于BMSCs缺乏單一有效的特異性表面抗原,所以對(duì)于哪些標(biāo)志物適宜作為靶標(biāo)尚未有定論。目前已報(bào)道的有STRO-1、CD146、CD105、SUSD2、Sca-1/CD90/PDGFRa、leptin受體等[7-10]。在選定識(shí)別靶標(biāo)后又可以采用熒光和磁珠等方式對(duì)其相應(yīng)抗體進(jìn)行標(biāo)記或結(jié)合,即目前已經(jīng)成熟應(yīng)用于BMSCs富集的方式主要有流式細(xì)胞熒光分選法(FACS)和免疫磁珠分選法(MACS),二者分別以電場(chǎng)和磁場(chǎng)形式施加作用力而分離目的細(xì)胞。在實(shí)際應(yīng)用中,MACS操作簡(jiǎn)單而快速,細(xì)胞通量高,成本相對(duì)低,對(duì)細(xì)胞活性影響低,但是無法同時(shí)標(biāo)記兩個(gè)或多個(gè)生物標(biāo)志物;而FACS法操作較復(fù)雜,對(duì)實(shí)驗(yàn)要求高,價(jià)格昂貴,細(xì)胞通量低而分選時(shí)間長(zhǎng),對(duì)細(xì)胞活性影響相對(duì)較大,但是分選所獲細(xì)胞的純度更高,也可以同時(shí)對(duì)多個(gè)表面標(biāo)志物乃至細(xì)胞內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行識(shí)別[11]。
上述四種分選方法中,由于FACS和MACS分選法的細(xì)胞通量較低,難以滿足臨床BMSCs應(yīng)用研究中細(xì)胞用量較大的需要,同時(shí)經(jīng)過了磁場(chǎng)或電場(chǎng)的作用難以評(píng)估對(duì)細(xì)胞功能的影響程度。所以,目前在臨床試驗(yàn)中應(yīng)用的BMSCs分離技術(shù)還是以差速貼壁法和梯度離心法為主[12]。
BMSCs細(xì)胞形態(tài)呈梭形,可聚集成均勻集落,在光學(xué)纖維鏡下有類似成纖維細(xì)胞的特征。但是,體外培養(yǎng)的BMSCs缺乏特異性和唯一性的標(biāo)記物,現(xiàn)在普遍采用的鑒定方法是ISCT于2006年提出的關(guān)于人源MSCs的最低鑒定標(biāo)準(zhǔn)[13],包括:①在體外標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下,細(xì)胞必須是呈梭形形態(tài)的黏附細(xì)胞;②通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè),細(xì)胞表面抗原表達(dá)CD105,CD73和CD90必須≥95%,同時(shí)表達(dá)CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79α,或CD19 和HLA-DR必須≤2%;③細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)體外分化條件下能夠分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞。在其他物種來源的BMSCs鑒定中,大部分研究也借鑒了這些標(biāo)準(zhǔn),但是需要注意的是,不同物種來源的BMSCs某些表面抗原表達(dá)存在較大差異性。這些最低標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)定是在造血干細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞之間劃定了界限,旨在縮小因不同分離和培養(yǎng)條件而導(dǎo)致的研究差異性。但是,隨著MSCs臨床應(yīng)用研究的不斷增長(zhǎng),迫切需要開發(fā)能夠更好地表征分離所得BMSCs增殖分化潛能甚至是預(yù)判臨床治療效用的標(biāo)志物。BMSCs鑒定新標(biāo)準(zhǔn)的方向主要在于對(duì)表面抗原的細(xì)化分層分級(jí),以及融入其他功能性判定指標(biāo),比如旁分泌能力、低免疫原性、“干性”相關(guān)基因表達(dá)等[14- 15],而這一過程面臨的主要挑戰(zhàn)仍然是BMSCs的細(xì)胞異質(zhì)性問題。
當(dāng)前,已有不少文獻(xiàn)對(duì)BMSCs主要表面抗原或者功能相關(guān)分子的表達(dá)進(jìn)行了更為細(xì)致的報(bào)道,有研究小組對(duì)不同捐獻(xiàn)者骨髓分離出的BMSCs進(jìn)行了對(duì)比研究,按照體外擴(kuò)增速率將BMSCs分為高增殖組和低增殖組,2組患者都符合ISCT標(biāo)準(zhǔn),但是高增殖組BMSCs具有集落形成率高、體內(nèi)異位成骨能力強(qiáng)等特點(diǎn),存在細(xì)胞表面標(biāo)志物STRO-1、PDGFR‐α(CD140a)高表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)基因TWIST-1、DERMO-1高表達(dá)[16]。Jin等模擬天然骨細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)建了纖維內(nèi)礦化膠原蛋白支架并將其植入大鼠下頜骨缺損處,募集到更多的表達(dá)CD146+STRO-1+的BMSCs,骨再生能力得到顯著增強(qiáng)[17]。這些研究為更好地開展BMSCs實(shí)驗(yàn)和建立功能性鑒定標(biāo)準(zhǔn)提供了參考。
BMSCs在生物體骨髓中的含量非常少,直接分離所得的初代細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)無法滿足科學(xué)研究以及臨床試驗(yàn)需求,必須經(jīng)過體外擴(kuò)增以獲取更多的高純度、強(qiáng)活性克隆集落。BMSCs分離的難點(diǎn)在于保證細(xì)胞純度,而培養(yǎng)的難點(diǎn)卻在于保持細(xì)胞活性,不同種屬來源的BMSCs在體外培養(yǎng)擴(kuò)增方法基本相似,但是細(xì)微的營(yíng)養(yǎng)條件、培養(yǎng)環(huán)境等差異都將會(huì)對(duì)細(xì)胞性能產(chǎn)生影響,因此在研究中必須綜合考量并合理優(yōu)化。
3.1 培養(yǎng)條件:目前使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基多是αMEM或者DMEM培養(yǎng)基,二者在基本成分方面對(duì)BMSCs細(xì)胞特性影響不大,主要影響因素在于血清、葡萄糖、生長(zhǎng)因子、氧氣等。①血清。胎牛血清(FBS)已被證實(shí)可以用來為BMSCs體外生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng),使用濃度在為5%~20%,以10%為居多;但是,有研究者認(rèn)為FBS會(huì)給BMSCs培養(yǎng)帶來異種蛋白或微生物的輸入風(fēng)險(xiǎn),建議使用同源性血清提取物作為營(yíng)養(yǎng)來源,也有商用無血清培養(yǎng)基在人源BMSCs體外培養(yǎng)中顯示出良好性能[18]。②生長(zhǎng)因子。盡管FBS已被接受用于臨床試驗(yàn)級(jí)別的人源BMSCs體外培養(yǎng),但是很多研究者將目光轉(zhuǎn)向生長(zhǎng)因子添加物,以替代FBS進(jìn)行培養(yǎng)條件優(yōu)化,包括人血清、血漿、血小板衍生生長(zhǎng)因子、TGF-β1、IGF等[19-21],其在保持人源BMSCs細(xì)胞特異性方面顯示出較好效果。③葡萄糖。葡萄糖是培養(yǎng)基中最常見的添加劑,由于健康生物體血清內(nèi)的葡萄糖生理水平維持在1 mg/mL,所以也建議BMSCs培養(yǎng)時(shí)使用低糖培養(yǎng)基(1 mg/mL)[22];葡萄糖濃度變化會(huì)影響B(tài)MSCs的細(xì)胞性能,高糖培養(yǎng)基(4.5 mg/mL)會(huì)減弱BMSCs的增殖能力并誘發(fā)過早衰老。④谷氨酰胺。谷氨酰胺是一種蛋白和氨基糖合成所必需的氨基酸,其與葡萄糖一樣在BMSCs培養(yǎng)中必不可少,尤其是在低糖低氧培養(yǎng)而又所需能量比較高時(shí),可以作為BMSCs生長(zhǎng)的補(bǔ)充能量來源[23]。⑤氧氣濃度。BMSCs所處的骨髓內(nèi)微環(huán)境屬于低氧環(huán)境,根據(jù)離血管網(wǎng)的距離而在1%~8%之間變化[24],因此體外培養(yǎng)的給氧濃度也應(yīng)以低氧為宜,一般多選擇2%~5%[9,25],低氧環(huán)境會(huì)降低BMSCs體外生長(zhǎng)時(shí)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激物濃度、減少DNA損傷、延緩細(xì)胞衰老并維持細(xì)胞分化能力[26]。
3.2 接種、傳代及凍存:細(xì)胞接種密度是BMSCs體外擴(kuò)增時(shí)的重要問題。在骨髓細(xì)胞懸液的初代培養(yǎng)中,差速貼壁法分離時(shí)一般多以1×106~2×106個(gè)/cm2進(jìn)行接種[2- 3],密度梯度離心法分離時(shí)以約1×104個(gè)/cm2密度接種為宜[27]。而在傳代過程中,BMSCs接種密度多在2 000~5 000個(gè)/cm2。有研究顯示,低密度接種可能會(huì)因減少接觸抑制而有利于細(xì)胞的增殖,而且低密度接種不易影響細(xì)胞表面抗原表型和細(xì)胞分化能力[28-30]。與接種密度同樣重要的還有傳代次數(shù),隨著體外擴(kuò)增的進(jìn)行,BMSCs會(huì)出現(xiàn)復(fù)制性衰老,表現(xiàn)為染色體端粒逐漸縮短、 “干性”減弱、突變風(fēng)險(xiǎn)增加[31- 32]。由于培養(yǎng)體系和判斷標(biāo)準(zhǔn)的不同,BMSCs體外培養(yǎng)的代數(shù)尚未有定論,一般認(rèn)為1 520代已經(jīng)屬于近衰老狀態(tài)[1,33]。凍存是細(xì)胞儲(chǔ)存的重要手段,其在BMSCs體外保存和運(yùn)輸中同樣適用,但是對(duì)于凍存是否影響細(xì)胞的活性尚有爭(zhēng)議。SOUKAINA等比較了不同凍存條件(凍存程序、時(shí)間、次數(shù),凍存液成分、凍存細(xì)胞濃度等)對(duì)BMSCs性能(標(biāo)志物表達(dá)、分化潛能、生長(zhǎng)能力、遷移特性、基因表達(dá)等)的影響,對(duì)于BMSCs保存與運(yùn)輸以及相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)的制定具有一定參考價(jià)值[34]。
BMSCs研究一直是細(xì)胞治療和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一,但是隨著研究的深入,在細(xì)胞的分離、鑒定、培養(yǎng)以及儲(chǔ)存等方面遇到很多問題,這些問題的核心在于尚未建立統(tǒng)一的研究標(biāo)準(zhǔn),這也是導(dǎo)致BMSCs研究結(jié)果復(fù)雜各異的重要原因之一,也是BMSCs應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要障礙。本文總結(jié)了BMSCs實(shí)驗(yàn)研究中的一些基礎(chǔ)問題,旨在為該領(lǐng)域研究者提供宏觀上的認(rèn)識(shí)和具體操作細(xì)節(jié)上的參考。盡管關(guān)于BMSCs實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法的研究還不夠徹底,但是研究者正在不斷努力改進(jìn)相關(guān)方法技術(shù),可以預(yù)見會(huì)有更好的方法獲得均一、高活性的BMSCs,其所具有的自我復(fù)制、多向分化、免疫抵抗、分泌效應(yīng)等生物學(xué)特性會(huì)在臨床疾病的治療發(fā)揮更大作用。