潘振 陳杰敏 胡成進

創(chuàng)傷弧菌是分布在江河、沿海水域的革蘭氏陰性桿菌。人通過生食或食用未經(jīng)煮熟的海產(chǎn)品如牡蠣等而受感染,可引起急性胃腸道癥狀和原發(fā)性創(chuàng)傷弧菌性膿毒癥[1]。還可由傷口暴露于含創(chuàng)傷弧菌的因素而直接受到感染,如清洗海鮮受傷及水上作業(yè),導致嚴重肌炎,壞死性筋膜炎[2-3]。尤其對患有肝病及血液系統(tǒng)疾病等免疫力低下人群更易受到感染。很快引起感染性休克,多死于菌血癥和多臟器功能衰竭[4-5]。

該病發(fā)病兇險,病死率高。在歐美、日本及我國沿江海水域感染時有發(fā)生。一份423例創(chuàng)傷弧菌傷口感染患者報道中[6],10%患者需要進行某種類型的截肢。在食源性患者病例中[7],創(chuàng)傷弧菌膿毒癥病死率最高(39%),且在就診時存在低血壓患者死亡率則超過90%。因此,患病后及時有效診斷是創(chuàng)傷弧菌感染治療及預后的關(guān)鍵。而臨床常規(guī)培養(yǎng)鑒定方法繁瑣,耗時較長,難以滿足臨床需求,故而建立及時有效的診斷方法迫切需要。

溶細胞素是創(chuàng)傷弧菌感染后分泌胞外的唯一外毒素,且序列保守,具有種屬特性[8]。既往研究證明[9],溶細胞素具有溶細胞毒性和細胞毒作用,是引起細胞組織損傷的主要毒力因子,在創(chuàng)傷弧菌感染中發(fā)揮重要作用。

抗體基因工程技術(shù)快速發(fā)展,使單克隆抗體制備更加高效便捷,依據(jù)單克隆抗體特異性高、穩(wěn)定好特點,可應用于病原體的快速診斷。用噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建鼠源性的單鏈抗體庫,可大量獲取針對溶細胞素的高特異性和均一性的單鏈抗體(single chain variable fragment antibody, scFv)[10]，對感染快速檢測及免疫治療具有重大意義。

資料與方法

一、一般材料

(一)材料

大腸桿菌XL1-Blue、噬菌粒載體pComb3XSS和輔助噬菌體VCSM13均為英國劍橋分子生物學實驗室。BALB/c小鼠為SPF級,購買于山東大學實驗動物中心。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、T4 DNA連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶SfiI、Taq酶等購自TaKaRa公司。質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司。高保真酶、焦碳酸二乙酯水(diethyl pyrocarbonate,DEPC)、辣根過氧化物酶(horseradish Peroxidase,HRP)標記的羊抗鼠IgG、TMB(3,3’,5,5′-Tetramethylbenzidine)顯色液購自上海生工。所用引物為上海Invitrogen公司合成。溶細胞素(cytolysin或vibrio vulnificus hemolysin,VvhA)為前期研究所得,分子量約為50 kDa[11]。

(二)方法

1.免疫小鼠

免疫前取小鼠尾端血作為陰性對照。免疫劑量按每只小鼠100 μg,初次免疫使用弗氏完全佐劑與溶細胞素蛋白等比例混合后注射。免疫2周后進行第二次免疫,采用弗氏不完全佐劑與抗原等比例混合后注射。1周后如上進行第三次免疫。免疫方法為皮下多點注射,在背部、腹部和腋窩處。第三次免疫1周后直接用抗原進行腹腔注射,為第四次免疫,此后隔3 d再免疫一次。免疫程序結(jié)束后,殺鼠取血,收集血清進行免疫效價測定。

2.ELISA方法檢測抗體效價

用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)稀釋溶細胞素蛋白為5 μg/mL,每孔加入100 μL,4℃冰箱過夜,第二天棄掉包被液,PBS洗滌3次并拍干。每孔加入150 μL含5%脫脂牛奶的PBS緩沖液,室溫封閉2 h,再用PBS洗滌3次并拍干。加入連續(xù)3倍稀釋免疫后鼠的血清100 μL/孔(1∶100,1∶300,1∶900,1∶2 700,1∶8 100,1∶24 300,1∶72 900,1∶218 700),同時加入陰性對照血清稀釋液100 μL/孔,空白對照孔中加入PBS 100 μL/孔。不同濃度樣本孔設(shè)置3個復孔。37℃孵育2 h,0.05%的PBST(含0.05% Tween-20的PBS)洗板3次,再用PBS洗2次并拍干。用封閉液把HRP標記的羊抗鼠單克隆抗體進行1:5 000稀釋,加入100 μL/孔,在37℃孵育1.5 h,0.05%的PBST洗板3次,PBS洗2次,并拍干。加入50 μL/孔TMB溶液。37℃孵育15 min后加入2 M濃硫酸50 μL終止反應,測定450 nm處吸光度。當P(樣本孔吸光度值)與N(陰性對照孔吸光度值)的比值≥2.1者判斷為陽性,免疫的抗體效價是P/N≥2.1時,對應的最大稀釋倍數(shù)為檢測的抗體效價。

3.脾細胞總RNA提取及cDNA合成

免疫程序結(jié)束后將小鼠頸椎脫臼處死,取脾放入RNase-free的EP管中,研磨搗碎脾臟組織，以1 000 rpm 離心15 min后棄上清,用PBS洗滌細胞;用2 000 rpm離心10 min后棄上清;再加入PBS重復剛才步驟以獲取脾細胞。

將脾細胞加入PBS至10 mL。用一次性吸管取適量脾細胞懸液滴到血球計數(shù)板上,靜置2～3 min待細胞下沉后計數(shù),計算計數(shù)板四角大方格的細胞數(shù)N,選取折光強發(fā)亮,形態(tài)完整的細胞計數(shù),聚集一塊的的細胞當成一個細胞計數(shù)。當細胞壓在刻度線上,執(zhí)行“計上不計下,數(shù)左不數(shù)右”原則。每個小鼠脾細胞數(shù)量按公式:細胞數(shù)=N/4×105。

使用TRIzol試劑提取脾細胞總RNA,并凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量并測定濃度。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒把提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA模版。

4.多樣性scFv基因合成

第一輪聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR),通過不同引物組合從cDNA模板中得到小鼠抗體基因輕鏈可變區(qū)(Vκ、Vλ)和重鏈可變區(qū)(VΗ)。PCR反應結(jié)束后,進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測并進行膠回收獲得基因片段。第二輪PCR(OE-PCR)反應將抗體輕鏈可變區(qū)片段(Vκ、Vλ)和抗體重鏈可變區(qū)片段(VΗ)拼接成完整的scFv基因片段,該基因片段兩端含有酶切位點SfiI。PCR反應結(jié)束后同樣對DNA條帶進行鑒定和純化回收,測定濃度后將拼接好的scFv片段凍存在-20℃冰箱備用。

5.單鏈抗體庫構(gòu)建及其多樣性驗證

用SfiI酶切scFv基因及噬菌粒pComb3XSS。將酶切后的scFv片段和pComb3XSS載體進行T4連接。連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化到感受態(tài)菌XL1-Blue。電轉(zhuǎn)化結(jié)束后加入SB培養(yǎng)基震蕩生長1 h后,取出10 μL菌液連續(xù)稀釋從10-1到10-6,取出100 μL分別涂布2×YT-AT平板,37℃過夜生長。通過計數(shù)平板上單克隆菌落數(shù),計算抗體庫庫容。庫容=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×100。

將剩余菌液在37℃搖晃溫箱中繼續(xù)生長2 h后,離心棄掉培養(yǎng)液上清,保留少許涂布平板2×YT-AGT平板,37℃生長過夜。次日用2×YT培養(yǎng)基刮取過夜生長的菌落分裝到干凈的保種管中,并加入終濃度為15%甘油混勻后置于-80℃冰箱凍存。此即為構(gòu)建的單鏈抗體的噬菌體抗體庫。

(三)統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

一、ELISA方法檢測抗體效價

免疫前血清吸光度變化不大,穩(wěn)定在0.303左右;在稀釋倍數(shù)8 100倍時樣本吸光度為0.646,其比值>2.1,故免疫效價為8 100倍。在稀釋倍數(shù)24 300樣本吸光度和陰性對照相近,表明幾乎沒有結(jié)合性。見圖1。

圖1 小鼠免疫后血清效價分析

二、脾細胞計數(shù)和總RNA提取

用血球計數(shù)板計數(shù)脾細胞數(shù)量,得到一個中方格細胞數(shù)(N/4)大約為100個,故每個小鼠脾細胞總數(shù)為1×106/mL，獲得細胞數(shù)量較好。

使用TRIzol試劑提取小鼠脾臟細胞總RNA后,用1%瓊脂糖膠進行核酸電泳,凝膠成像儀中顯示有三條清晰條帶,分別是28 S、18 S和5 S,前兩條帶顏色較亮,第三條顏色較暗。通過測量得到總RNA濃度為220 μg/mL。說明RNA沒有降解,提取效果較好?？捎糜谙乱徊絚DNA合成。見圖 2。

圖2 小鼠的脾細胞抽提總RNA結(jié)果

三、多樣性scFv基因合成

以cDNA為模板,擴增鼠抗體輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)基因片段得到Vκ、Vλ和VΗ,片段大小都在350 bp左右,符合要求。見圖 3～5。

圖3 PCR擴增輕鏈可變區(qū)Vλ

圖4 PCR擴增輕鏈可變區(qū)Vκ

圖5 PCR擴增重鏈可變區(qū)VΗ

通過OE-PCR反應拼接抗體輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū),得到所需的scFv片段。拼接后的片段大小都在750 bp左右。見圖6。

圖6 OE-PCR擴增拼接scFv基因片段

四、單鏈抗體庫其多樣性驗證及庫容計算

從2×YT-AT平板上隨機挑取18個單克隆菌落進行菌液PCR驗證重組質(zhì)粒,從瓊脂糖凝膠上示有14個克隆含有目的條帶750 bp。見圖 7。

圖7 電轉(zhuǎn)化后重組子的PCR驗證

標記好這14個單克隆菌落,并提取質(zhì)粒,使用限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒,通過跑膠驗證,發(fā)現(xiàn)14個克隆含有4 300 bp和750 bp的兩個條帶。由此計算插入率為78%。見圖 8。

圖8 圖8 重組質(zhì)粒pComb3XSS-scFv的酶切驗證

重組質(zhì)粒pComb3XSS-scFv的電轉(zhuǎn)化后,計數(shù)單克隆菌落計算庫容,結(jié)果顯示在10-5稀釋倍數(shù)中有30個單克隆,由此可得噬菌體抗體庫庫容為3×108。見圖 9。

圖9 pComb3XSS-scFv噬菌體庫容

討 論

理論上從不經(jīng)免疫的天然抗體庫或半合成抗體庫,可以獲得針對任何種類抗原的高親和力的抗體。而在試驗中卻發(fā)現(xiàn)經(jīng)過免疫程序構(gòu)建的抗體庫更易于獲得穩(wěn)定好、特異性高的單克隆抗體[12]。目前研究抗體與待檢測抗原、多肽及某些小分子物質(zhì)作用機制并獲得相應的優(yōu)質(zhì)抗體,免疫是最佳的選擇。從免疫庫中獲得親和抗體仍是主要研究方向。同時也是研究抗體生物學必要反應的途徑[13]。

為了建立高特異性和高親和性的溶細胞素單鏈抗體庫,首先需要獲得大容量的單鏈抗體基因片段:(1)本研究輔以弗氏佐劑通過對小鼠五次免疫程序,經(jīng)間接ELISA方法得到較高的免疫血清滴度8 100倍,保證較好免疫效果。選擇脾臟,獲取產(chǎn)生抗體的所有淋巴細胞,數(shù)量達到1×107,獲得大容量的總RNA,再通過RT-PCR技術(shù)獲得隨機化的cDNA。(2)參照《噬菌體表達實驗室手冊》[14]對鼠源單鏈抗體基因引物設(shè)計,以獲取最大數(shù)量的抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)基因片段。其次,構(gòu)建抗體庫使用高效的實驗設(shè)計方案:①通過重疊延伸PCR反應拼接scFv抗體片段,使得抗體輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)基因片段得以隨機重組,增加scFv片段的重排數(shù)量。②使用重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化方法,將重組噬菌粒載體pComb3XSS-scFv轉(zhuǎn)化到宿主菌中,相比常規(guī)氯化鈣轉(zhuǎn)化方法,轉(zhuǎn)化效率提高上千至上萬倍,大大降低建庫過程中scFv基因片段的丟失。③所用載體為美國Scripps研究所改進的第三代噬菌粒載體pComb3X家族載體,在pComb3載體基礎(chǔ)上改進,增加包括穩(wěn)定和引進SfiI盒的以克隆多種多肽片段,如Fab片段、scFv片段、多肽和展示的其他類型蛋白質(zhì)。含有6×his標簽和HA標簽用于純化和檢測。引入琥珀終止密碼子,使在非抑制性大腸桿菌終止PIII融合蛋白表達,用于產(chǎn)生可溶性蛋白等。

總之,本研究成功構(gòu)建了重組率為78%、庫容量為3×108的抗體文庫。為下一步溶細胞素特異性單鏈抗體篩選奠定了基礎(chǔ)，開發(fā)的單鏈抗體為疾病感染診斷開辟新的途徑。