A型肉毒素重鏈干預(yù)神經(jīng)細(xì)胞組蛋白3乙?；降某醪窖芯?/h1>
2018-06-26 07:27:22李志強(qiáng)趙明偉袁海霞李夏青
中國比較醫(yī)學(xué)雜志 2018年6期
蘭 婧，劉 福，高 揚(yáng)，李志強(qiáng)，劉 雅，趙明偉，袁海霞，李夏青*
(1.山西醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室，太原 030001； 2.山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，太原 030001)
A型肉毒素(botulinum neurotoxin serotype A，BoNT/A)是目前研究較為廣泛、也是臨床作為藥物應(yīng)用的主要生物毒素制劑之一，例如：利用BoNT/A阻止神經(jīng)突觸前膜神經(jīng)遞質(zhì)釋放的毒性機(jī)制將其用于緩解或治療某些與肌肉收縮過度有關(guān)的臨床疾患(斜頸、面肌痙攣、尿失禁、偏頭痛、簇集性頭痛、多汗癥、皮膚除皺等)。BoNT/A分子由一條重鏈(heavy chain-HC, 分子量為100×103)和一條輕鏈(light chain-LC，分子量為50×103)構(gòu)成，由二硫鍵相互連接。重鏈的羧基端含有與突觸前膜蛋白受體結(jié)合的位點(diǎn)，可與膜受體結(jié)合形成毒素-受體復(fù)合物，輕鏈隨重鏈內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮毒性作用[1]。本研究團(tuán)隊(duì)的前期研究結(jié)果顯示人工重組的BoNT/A重鏈可促進(jìn)體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞突起生長；在體實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)BoNT/A重鏈可干預(yù)脊髓損傷后局部多種分子量水平的蛋白表達(dá)[2-3]。然而，就目前而言，BoNT/A的很多功能并不能單獨(dú)用毒素的致毒機(jī)理解釋。毒素分子中的重鏈與宿主細(xì)胞膜受體結(jié)合所引起的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)系統(tǒng)的改變及其影響已受到重視。
經(jīng)典遺傳學(xué)信息提供了各種蛋白(包括表觀遺傳學(xué)修飾蛋白在內(nèi))、RNA的結(jié)構(gòu)信息，而表觀遺傳學(xué)信息則提供何時(shí)、何處合成何種蛋白及 RNA的指令，從而嚴(yán)密地控制著蛋白及RNA的功能[4]。組蛋白乙?；瘜儆诮M蛋白表觀修飾的表現(xiàn)之一，組蛋白的乙?；?去乙?；嗷プ饔每尚纬商厥獾拿艽a而影響其他蛋白因子的活動(dòng)[5]。在所有的組蛋白中，組蛋白3(H3)和組蛋白4(H4)的乙酰化對(duì)基因表達(dá)調(diào)控及隨后的蛋白合成表達(dá)的影響已有較為廣泛的研究[4]。
神經(jīng)損傷后的再生修復(fù)依賴于蛋白合成、尤其是生長相關(guān)蛋白的合成。有文獻(xiàn)報(bào)道[6]，BoNT/A重鏈可以促進(jìn)體外培養(yǎng)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞突起增長，本研究團(tuán)隊(duì)的前期實(shí)驗(yàn)也觀察到在體應(yīng)用BoNT/A重鏈可以使脊髓損傷局部蛋白表達(dá)出現(xiàn)多種變化。這些研究結(jié)提示：BoNT/A重鏈可干預(yù)蛋白合成相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)各種信號(hào)途徑?；诮M蛋白乙?；瘜?duì)蛋白合成及表達(dá)的重要作用，本研究擬通過離體和在體兩種方法觀察BoNT/A對(duì)組蛋白亞型3的乙?；降挠绊?，旨在對(duì)BoNT/A重鏈的生物學(xué)作用有更進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。
1 材料和方法
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
SPF級(jí)SD大鼠48只，雄性，體重200～220 g，6周齡，來源于北京海淀興旺實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場[SCXK(京)2014-0013]，飼養(yǎng)于本實(shí)驗(yàn)室獨(dú)立動(dòng)物房[SYXK(晉)2015-0001]。動(dòng)物模型的手術(shù)操作按照山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物使用倫理委員會(huì)的規(guī)定執(zhí)行(IACUC2017-001)。
1.2 主要試劑與儀器
Neuro-2a細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫; BoNT/A重鏈、A型肉毒素重鏈購自美國List Biological Laboratories, Inc; Bradford 法蛋白濃度測定試劑盒 (Sangon Biotech, C503031，China); EasySee Western blot kit (TRAN, DW101, China); 10%胎牛血清(美國Hyclone公司)；兔抗乙?；?H3抗體 (1∶1000，monoclone，CST，USA)；HRP標(biāo)記的goat anti rabbit二抗(1∶500，上海生工)；凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad，USA); 多功能酶標(biāo)儀(Molecular Devices, SpectraMax@190，USA);多功能電泳儀(Bio-Rad, USA)。
1.3 實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)
將Neuro-2a細(xì)胞懸浮含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM-HG培養(yǎng)液后、接種于用0.01%多聚賴氨酸鋪被的培養(yǎng)板內(nèi), 置于37℃ 5% CO2的孵箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。用于蛋白表達(dá)測定的細(xì)胞接種密度為1×106/mL，置于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，每6孔為一組，分為4組：(1)正常對(duì)照組；(2)BoNT/A重鏈處理24 h組；(3)BoNT/A重鏈處理48 h組；(4)BoNT/A重鏈處理72 h組。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，BoNT/A給予劑量為: 1 ng/L (終濃度)。待細(xì)胞完全貼壁生長后(4 h左右)加入BoNT/A重鏈，用于神經(jīng)突起測定的細(xì)胞接種密度為每孔1×105，置于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，分組和BoNT/A重鏈劑量同上。
1.3.2神經(jīng)突起測定
BoNT/A重鏈作用后Neuro-2a 細(xì)胞突起測定：細(xì)胞接種后隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組(0.1 nmol/L 組和1 nmol/L 組)每組8個(gè)孔，于細(xì)胞貼壁生長后4 h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的BoNT/A重鏈，陰性對(duì)照組加入等劑量的DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)液，分別于給藥后24 h、48 h 和72 h將細(xì)胞置于相差倒置顯微鏡攝影，每孔隨機(jī)視野拍攝2～3張圖片，每組共20張圖片，用于細(xì)胞突起的測定，包括：(1)具有突起的細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的比例(%)，細(xì)胞計(jì)數(shù)采用Photoshop CS軟件；(2)測量神經(jīng)突起長度，采用ImageJ軟件進(jìn)行。
1.3.3脊髓損傷及BoNT/A重鏈給藥
采用鞘內(nèi)注射給藥：6 μg/20 μL，BoNT/A重鏈+生理鹽水，收取不同時(shí)間點(diǎn)脊髓組織。經(jīng)皮腰骶部鞘內(nèi)給藥的方法參照文獻(xiàn)[3]略作改動(dòng)，具體方法如下：1%的戊巴比妥鈉腹注射麻醉，0.4 mL/100 g。將全身麻醉后的脊髓損傷模型大鼠后背位固定于鼠臺(tái)，大鼠腰骶部下方放置直徑約為3～5 cm圓柱狀筒物體，使L6～S1間隙充分張開便于實(shí)驗(yàn)操作。剪毛，碘伏消毒穿刺中心皮膚，拇指和中指觸摸大鼠雙側(cè)髂嵴并向兩側(cè)繃緊皮膚，食指于兩側(cè)髂嵴連線同一水平觸摸大鼠脊椎，觸及最高點(diǎn)即為L6 棘突，在 L6～S1 間隙采用 20 G穿刺針垂直刺入皮膚、皮下肌層，當(dāng)出現(xiàn)落空感、同時(shí)看到大鼠甩尾，證明針尖已經(jīng)進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔，此時(shí)將針頭旋轉(zhuǎn)180°，同時(shí)刺針向尾側(cè)傾斜約30°，繼續(xù)向前推進(jìn)1 mm 左右。隨后將充滿生理鹽水的經(jīng)改造的PE-10 聚乙烯導(dǎo)管從穿刺針內(nèi)部緩慢插入約1 cm，導(dǎo)管插入過程中可出現(xiàn)腦脊液流出、動(dòng)物甩尾等顯著特征以充分證明導(dǎo)管置入成功。此時(shí)用微量注射器將6 μg/20 μL，BoNT/A重鏈+生理鹽水沿PE-10管緩慢注射到鞘內(nèi)，注射完成后停留片刻再將20 μL的生理鹽水沿PE-10管注入鞘內(nèi)，以保證BoNT/A重鏈制劑全部進(jìn)入鞘內(nèi)。單獨(dú)脊髓損傷動(dòng)物注射相同劑量生理鹽水。在注射后保持頭低足高位約5 min。給藥后每只單獨(dú)飼養(yǎng)，分別于給藥后2 h、12 h、24 h、48 h、4 d、8 d收取大鼠脊髓標(biāo)本，每組6只。
模型動(dòng)物術(shù)后的大體解剖及組織學(xué)觀察皆顯示明顯的脊髓單側(cè)損傷(圖1)。
注：箭頭：損傷部位。圖1 脊髓損傷的大體及組織學(xué)觀察(Bar=100 μm)Note.The arrow heads indicate the injury sites.Fig.1 Gross and histological changes of spinal cord injury in a rat
1.3.4Western blot
組織和細(xì)胞樣本經(jīng)Bradford protein assay確定蛋白含量后，每個(gè)樣本上量樣為30 μg。進(jìn)行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)至PDVF膜，將膜浸于5%脫脂奶粉溶液內(nèi)封閉1 h，加入兔抗乙?；?H3抗體(1∶1000，monoclone，CST，USA)，4℃搖床過夜，次日用TBST液充分洗滌(5次× 5 min)，HRP標(biāo)記的goat anti rabbit二抗(1∶500)孵育1 h，TBST洗膜(5次× 5 min)，發(fā)光液作用3 min，暗室曝光，Bio-Rad圖像處理。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
2 結(jié)果
2.1 BoNT/A重鏈的促神經(jīng)突起生長與細(xì)胞內(nèi)H3乙酰化水平相匹配
將不同濃度的BoNT/A 重鏈加入Neuro-2a細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間可見細(xì)胞突起生長明顯增長，尤以濃度為1 nmol/L時(shí)作用最為顯著。24，48，72 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的突起測定結(jié)果顯示，1 nmol/L濃度時(shí)神經(jīng)突起增長的長度約是對(duì)照組細(xì)胞突起長度的2倍以上(P< 0.001)。但是，1 nmol/L濃度各時(shí)間點(diǎn)所測得的神經(jīng)突起長度之間的差異無顯著性。除此外，在重鏈作用下，具有突起的細(xì)胞占所計(jì)數(shù)細(xì)胞的百分比較對(duì)照組明顯增加，以濃度為1 nmol/L、作用24 h最為明顯，其百分比約為對(duì)照組的2.5倍(P< 0.001)。(圖2)
注：與同一時(shí)間段對(duì)照組相比，***P< 0.001。圖2 不同濃度BoNT/A 重鏈對(duì)Neuro-2a 細(xì)胞生長的影響及β-tublin免疫熒光染色(Bar=50 μm)Note. Compared with the control group at the same time point,***P< 0.001.Fig.2 The effect of BoNT/A heavy chain on the growth of Neuro-2a cells and the immunofluorescence staining of β-tubulin
注：BoNT/A HC為A型肉毒素重鏈；AcH3為乙?；慕M蛋白3； 與對(duì)照組相比，***P< 0.001。圖3 BoNT/A 重鏈對(duì)Neuro-2細(xì)胞組蛋白H3乙酰化水平的影響(Bar=50 μm)Note. BoNT/A HC: Botulinum neurotoxin serotype A heavy chain. AcH3: Acetylated histone 3. Compared with the control group，***P< 0.001.Fig.3 The effect of BoNT/A heavy chain on the acetylation of H3 in the Neuro-2a cell cultures
SDS-PAGE 和Western blot 結(jié)果顯示：給予BoNT/A 重鏈后，在不同時(shí)間段(短時(shí)程 1～8 h；長時(shí)程48～72 h)，H3的乙?；尸F(xiàn)雙時(shí)相增多現(xiàn)象(圖3)。第一個(gè)H3乙?；皆龈叩臅r(shí)間出現(xiàn)于重鏈作用后的1 h和2 h，此時(shí)H3乙?；绞菍?duì)照組的2倍(P< 0.001)；第二個(gè)H3乙?；叻鍟r(shí)間點(diǎn)為BoNT/A重鏈作用后48 h，Neuro-2細(xì)胞的組蛋白H3乙?；揭策_(dá)到對(duì)照組的2倍(P< 0.001)。
從神經(jīng)突起的增長及H3乙?；降淖兓厔菁俺潭瓤梢酝茰y，BoNT/A重鏈引起的Neuro-2a細(xì)胞乙酰化水平增高似乎與細(xì)胞突起生長之間有一定的內(nèi)在聯(lián)系。
2.2 在體應(yīng)用BoNT/A 重鏈促進(jìn)脊髓損傷局部H3乙酰化
結(jié)果顯示：脊髓損傷同時(shí)給予BoNT/A重鏈的動(dòng)物其損傷局部H3乙?；捷^單純損傷組明顯升高。同細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果相似，脊髓組織的乙酰化水平也呈現(xiàn)兩個(gè)時(shí)相的高峰，第一個(gè)處于給藥后的2 h，第二個(gè)處于給藥后2 d(48 h)，其升高水平為對(duì)照組的1.5～2倍(P< 0.05)。(圖4)
注：BoNT/A HC為A型肉毒素重鏈；與對(duì)照組相比，*P< 0.05，**P< 0.01。圖4 脊髓損傷基礎(chǔ)上給予BoNT/A重鏈后不同時(shí)間脊髓組織H3乙酰化變化Note. BoNT/A HC: Botulinum neurotoxin serotype A heavy chain. Compared with the control group，*P< 0.05，**P< 0.01.Fig.4 Alterations in the acetylation of histone 3 after treated with BoNT/A heavy chain based on the spinal cord injury model
3 討論
組蛋白是真核生物染色體的基本結(jié)構(gòu)蛋白，是一類小分子堿性蛋白質(zhì)，有6種類型：H1、H2A、H2B、H3、H4及古細(xì)菌組蛋白，由于其結(jié)構(gòu)中多為堿性氨基酸，因此可以同DNA中帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)相互作用。H3、H4的乙?；纱蜷_一個(gè)開放的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，增加基因的表達(dá)。更重要的是組蛋白的乙?；?去乙?；尚纬梢环N特殊的密碼，被其他蛋白質(zhì)識(shí)別，故可影響多種蛋白因子的功能活動(dòng)[5]。研究表明[7-8]，組蛋白通過乙?；?去乙?；嗷プ饔脜⑴c神經(jīng)系統(tǒng)蛋白功能的調(diào)節(jié)，組蛋白乙?；脑鰪?qiáng)可促進(jìn)某些胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成。還有研究者認(rèn)為，細(xì)胞內(nèi)組蛋白乙?；?，尤其是H3的乙?；^程增強(qiáng)有助于神經(jīng)再生[9]。
神經(jīng)突起生長或損傷后的軸突再生是以胞漿內(nèi)生長相關(guān)蛋白合成增加為基礎(chǔ)的。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明：BoNT/A促神經(jīng)軸突增長的同時(shí)，神經(jīng)細(xì)胞及其組織內(nèi)組蛋白3乙?；酵瑫r(shí)增高，因此可以推測，組蛋白的乙?；鰪?qiáng)可能是BoNT/A重鏈促進(jìn)神經(jīng)突起再生的核內(nèi)機(jī)制之一，通過組蛋白3的乙?；鰪?qiáng)機(jī)制或間接干預(yù)胞漿內(nèi)多種蛋白質(zhì)的合成，從而促使神經(jīng)突起延長再生。然而，由于組蛋白本身在核酸序列的分布及種類不同，發(fā)生乙?；笏婕暗谋碛^遺傳改變復(fù)雜多樣，H3乙?；c去乙?；芮邢嚓P(guān)，因此，BoNT/A 重鏈干預(yù)組蛋白乙酰化的途徑還需通過探討其他組蛋白的亞類(H4, H9等)進(jìn)一步證實(shí)。不同組蛋白乙?；c神經(jīng)突起再生之間的確切內(nèi)在聯(lián)系還需進(jìn)一步澄清。
根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，可以推論：BoNT/A 重鏈可促進(jìn)組蛋白3的乙酰化；在同一時(shí)間點(diǎn)，組蛋白3的乙?；脚c神經(jīng)突起增長的長度相一致；組蛋白3乙?；赡苁荁oNT/A重鏈促神經(jīng)突起生長的相關(guān)機(jī)制之一。
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A型肉毒素(botulinum neurotoxin serotype A，BoNT/A)是目前研究較為廣泛、也是臨床作為藥物應(yīng)用的主要生物毒素制劑之一，例如：利用BoNT/A阻止神經(jīng)突觸前膜神經(jīng)遞質(zhì)釋放的毒性機(jī)制將其用于緩解或治療某些與肌肉收縮過度有關(guān)的臨床疾患(斜頸、面肌痙攣、尿失禁、偏頭痛、簇集性頭痛、多汗癥、皮膚除皺等)。BoNT/A分子由一條重鏈(heavy chain-HC, 分子量為100×103)和一條輕鏈(light chain-LC，分子量為50×103)構(gòu)成，由二硫鍵相互連接。重鏈的羧基端含有與突觸前膜蛋白受體結(jié)合的位點(diǎn)，可與膜受體結(jié)合形成毒素-受體復(fù)合物，輕鏈隨重鏈內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮毒性作用[1]。本研究團(tuán)隊(duì)的前期研究結(jié)果顯示人工重組的BoNT/A重鏈可促進(jìn)體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞突起生長；在體實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)BoNT/A重鏈可干預(yù)脊髓損傷后局部多種分子量水平的蛋白表達(dá)[2-3]。然而，就目前而言，BoNT/A的很多功能并不能單獨(dú)用毒素的致毒機(jī)理解釋。毒素分子中的重鏈與宿主細(xì)胞膜受體結(jié)合所引起的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)系統(tǒng)的改變及其影響已受到重視。
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神經(jīng)損傷后的再生修復(fù)依賴于蛋白合成、尤其是生長相關(guān)蛋白的合成。有文獻(xiàn)報(bào)道[6]，BoNT/A重鏈可以促進(jìn)體外培養(yǎng)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞突起增長，本研究團(tuán)隊(duì)的前期實(shí)驗(yàn)也觀察到在體應(yīng)用BoNT/A重鏈可以使脊髓損傷局部蛋白表達(dá)出現(xiàn)多種變化。這些研究結(jié)提示：BoNT/A重鏈可干預(yù)蛋白合成相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)各種信號(hào)途徑?；诮M蛋白乙?；瘜?duì)蛋白合成及表達(dá)的重要作用，本研究擬通過離體和在體兩種方法觀察BoNT/A對(duì)組蛋白亞型3的乙?；降挠绊?，旨在對(duì)BoNT/A重鏈的生物學(xué)作用有更進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。
1 材料和方法
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
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1.3 實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)
將Neuro-2a細(xì)胞懸浮含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM-HG培養(yǎng)液后、接種于用0.01%多聚賴氨酸鋪被的培養(yǎng)板內(nèi), 置于37℃ 5% CO2的孵箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。用于蛋白表達(dá)測定的細(xì)胞接種密度為1×106/mL，置于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，每6孔為一組，分為4組：(1)正常對(duì)照組；(2)BoNT/A重鏈處理24 h組；(3)BoNT/A重鏈處理48 h組；(4)BoNT/A重鏈處理72 h組。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，BoNT/A給予劑量為: 1 ng/L (終濃度)。待細(xì)胞完全貼壁生長后(4 h左右)加入BoNT/A重鏈，用于神經(jīng)突起測定的細(xì)胞接種密度為每孔1×105，置于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，分組和BoNT/A重鏈劑量同上。
1.3.2神經(jīng)突起測定
BoNT/A重鏈作用后Neuro-2a 細(xì)胞突起測定：細(xì)胞接種后隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組(0.1 nmol/L 組和1 nmol/L 組)每組8個(gè)孔，于細(xì)胞貼壁生長后4 h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的BoNT/A重鏈，陰性對(duì)照組加入等劑量的DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)液，分別于給藥后24 h、48 h 和72 h將細(xì)胞置于相差倒置顯微鏡攝影，每孔隨機(jī)視野拍攝2～3張圖片，每組共20張圖片，用于細(xì)胞突起的測定，包括：(1)具有突起的細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的比例(%)，細(xì)胞計(jì)數(shù)采用Photoshop CS軟件；(2)測量神經(jīng)突起長度，采用ImageJ軟件進(jìn)行。
1.3.3脊髓損傷及BoNT/A重鏈給藥
采用鞘內(nèi)注射給藥：6 μg/20 μL，BoNT/A重鏈+生理鹽水，收取不同時(shí)間點(diǎn)脊髓組織。經(jīng)皮腰骶部鞘內(nèi)給藥的方法參照文獻(xiàn)[3]略作改動(dòng)，具體方法如下：1%的戊巴比妥鈉腹注射麻醉，0.4 mL/100 g。將全身麻醉后的脊髓損傷模型大鼠后背位固定于鼠臺(tái)，大鼠腰骶部下方放置直徑約為3～5 cm圓柱狀筒物體，使L6～S1間隙充分張開便于實(shí)驗(yàn)操作。剪毛，碘伏消毒穿刺中心皮膚，拇指和中指觸摸大鼠雙側(cè)髂嵴并向兩側(cè)繃緊皮膚，食指于兩側(cè)髂嵴連線同一水平觸摸大鼠脊椎，觸及最高點(diǎn)即為L6 棘突，在 L6～S1 間隙采用 20 G穿刺針垂直刺入皮膚、皮下肌層，當(dāng)出現(xiàn)落空感、同時(shí)看到大鼠甩尾，證明針尖已經(jīng)進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔，此時(shí)將針頭旋轉(zhuǎn)180°，同時(shí)刺針向尾側(cè)傾斜約30°，繼續(xù)向前推進(jìn)1 mm 左右。隨后將充滿生理鹽水的經(jīng)改造的PE-10 聚乙烯導(dǎo)管從穿刺針內(nèi)部緩慢插入約1 cm，導(dǎo)管插入過程中可出現(xiàn)腦脊液流出、動(dòng)物甩尾等顯著特征以充分證明導(dǎo)管置入成功。此時(shí)用微量注射器將6 μg/20 μL，BoNT/A重鏈+生理鹽水沿PE-10管緩慢注射到鞘內(nèi)，注射完成后停留片刻再將20 μL的生理鹽水沿PE-10管注入鞘內(nèi)，以保證BoNT/A重鏈制劑全部進(jìn)入鞘內(nèi)。單獨(dú)脊髓損傷動(dòng)物注射相同劑量生理鹽水。在注射后保持頭低足高位約5 min。給藥后每只單獨(dú)飼養(yǎng)，分別于給藥后2 h、12 h、24 h、48 h、4 d、8 d收取大鼠脊髓標(biāo)本，每組6只。
模型動(dòng)物術(shù)后的大體解剖及組織學(xué)觀察皆顯示明顯的脊髓單側(cè)損傷(圖1)。
注：箭頭：損傷部位。圖1 脊髓損傷的大體及組織學(xué)觀察(Bar=100 μm)Note.The arrow heads indicate the injury sites.Fig.1 Gross and histological changes of spinal cord injury in a rat
1.3.4Western blot
組織和細(xì)胞樣本經(jīng)Bradford protein assay確定蛋白含量后，每個(gè)樣本上量樣為30 μg。進(jìn)行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)至PDVF膜，將膜浸于5%脫脂奶粉溶液內(nèi)封閉1 h，加入兔抗乙?；?H3抗體(1∶1000，monoclone，CST，USA)，4℃搖床過夜，次日用TBST液充分洗滌(5次× 5 min)，HRP標(biāo)記的goat anti rabbit二抗(1∶500)孵育1 h，TBST洗膜(5次× 5 min)，發(fā)光液作用3 min，暗室曝光，Bio-Rad圖像處理。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
2 結(jié)果
2.1 BoNT/A重鏈的促神經(jīng)突起生長與細(xì)胞內(nèi)H3乙酰化水平相匹配
將不同濃度的BoNT/A 重鏈加入Neuro-2a細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間可見細(xì)胞突起生長明顯增長，尤以濃度為1 nmol/L時(shí)作用最為顯著。24，48，72 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的突起測定結(jié)果顯示，1 nmol/L濃度時(shí)神經(jīng)突起增長的長度約是對(duì)照組細(xì)胞突起長度的2倍以上(P< 0.001)。但是，1 nmol/L濃度各時(shí)間點(diǎn)所測得的神經(jīng)突起長度之間的差異無顯著性。除此外，在重鏈作用下，具有突起的細(xì)胞占所計(jì)數(shù)細(xì)胞的百分比較對(duì)照組明顯增加，以濃度為1 nmol/L、作用24 h最為明顯，其百分比約為對(duì)照組的2.5倍(P< 0.001)。(圖2)
注：與同一時(shí)間段對(duì)照組相比，***P< 0.001。圖2 不同濃度BoNT/A 重鏈對(duì)Neuro-2a 細(xì)胞生長的影響及β-tublin免疫熒光染色(Bar=50 μm)Note. Compared with the control group at the same time point,***P< 0.001.Fig.2 The effect of BoNT/A heavy chain on the growth of Neuro-2a cells and the immunofluorescence staining of β-tubulin
注：BoNT/A HC為A型肉毒素重鏈；AcH3為乙?；慕M蛋白3； 與對(duì)照組相比，***P< 0.001。圖3 BoNT/A 重鏈對(duì)Neuro-2細(xì)胞組蛋白H3乙酰化水平的影響(Bar=50 μm)Note. BoNT/A HC: Botulinum neurotoxin serotype A heavy chain. AcH3: Acetylated histone 3. Compared with the control group，***P< 0.001.Fig.3 The effect of BoNT/A heavy chain on the acetylation of H3 in the Neuro-2a cell cultures
SDS-PAGE 和Western blot 結(jié)果顯示：給予BoNT/A 重鏈后，在不同時(shí)間段(短時(shí)程 1～8 h；長時(shí)程48～72 h)，H3的乙?；尸F(xiàn)雙時(shí)相增多現(xiàn)象(圖3)。第一個(gè)H3乙?；皆龈叩臅r(shí)間出現(xiàn)于重鏈作用后的1 h和2 h，此時(shí)H3乙?；绞菍?duì)照組的2倍(P< 0.001)；第二個(gè)H3乙?；叻鍟r(shí)間點(diǎn)為BoNT/A重鏈作用后48 h，Neuro-2細(xì)胞的組蛋白H3乙?；揭策_(dá)到對(duì)照組的2倍(P< 0.001)。
從神經(jīng)突起的增長及H3乙?；降淖兓厔菁俺潭瓤梢酝茰y，BoNT/A重鏈引起的Neuro-2a細(xì)胞乙酰化水平增高似乎與細(xì)胞突起生長之間有一定的內(nèi)在聯(lián)系。
2.2 在體應(yīng)用BoNT/A 重鏈促進(jìn)脊髓損傷局部H3乙酰化
結(jié)果顯示：脊髓損傷同時(shí)給予BoNT/A重鏈的動(dòng)物其損傷局部H3乙?；捷^單純損傷組明顯升高。同細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果相似，脊髓組織的乙酰化水平也呈現(xiàn)兩個(gè)時(shí)相的高峰，第一個(gè)處于給藥后的2 h，第二個(gè)處于給藥后2 d(48 h)，其升高水平為對(duì)照組的1.5～2倍(P< 0.05)。(圖4)
注：BoNT/A HC為A型肉毒素重鏈；與對(duì)照組相比，*P< 0.05，**P< 0.01。圖4 脊髓損傷基礎(chǔ)上給予BoNT/A重鏈后不同時(shí)間脊髓組織H3乙酰化變化Note. BoNT/A HC: Botulinum neurotoxin serotype A heavy chain. Compared with the control group，*P< 0.05，**P< 0.01.Fig.4 Alterations in the acetylation of histone 3 after treated with BoNT/A heavy chain based on the spinal cord injury model
3 討論
組蛋白是真核生物染色體的基本結(jié)構(gòu)蛋白，是一類小分子堿性蛋白質(zhì)，有6種類型：H1、H2A、H2B、H3、H4及古細(xì)菌組蛋白，由于其結(jié)構(gòu)中多為堿性氨基酸，因此可以同DNA中帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)相互作用。H3、H4的乙?；纱蜷_一個(gè)開放的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，增加基因的表達(dá)。更重要的是組蛋白的乙?；?去乙?；尚纬梢环N特殊的密碼，被其他蛋白質(zhì)識(shí)別，故可影響多種蛋白因子的功能活動(dòng)[5]。研究表明[7-8]，組蛋白通過乙?；?去乙?；嗷プ饔脜⑴c神經(jīng)系統(tǒng)蛋白功能的調(diào)節(jié)，組蛋白乙?；脑鰪?qiáng)可促進(jìn)某些胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成。還有研究者認(rèn)為，細(xì)胞內(nèi)組蛋白乙?；?，尤其是H3的乙?；^程增強(qiáng)有助于神經(jīng)再生[9]。
神經(jīng)突起生長或損傷后的軸突再生是以胞漿內(nèi)生長相關(guān)蛋白合成增加為基礎(chǔ)的。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明：BoNT/A促神經(jīng)軸突增長的同時(shí)，神經(jīng)細(xì)胞及其組織內(nèi)組蛋白3乙?；酵瑫r(shí)增高，因此可以推測，組蛋白的乙?；鰪?qiáng)可能是BoNT/A重鏈促進(jìn)神經(jīng)突起再生的核內(nèi)機(jī)制之一，通過組蛋白3的乙?；鰪?qiáng)機(jī)制或間接干預(yù)胞漿內(nèi)多種蛋白質(zhì)的合成，從而促使神經(jīng)突起延長再生。然而，由于組蛋白本身在核酸序列的分布及種類不同，發(fā)生乙?；笏婕暗谋碛^遺傳改變復(fù)雜多樣，H3乙?；c去乙?；芮邢嚓P(guān)，因此，BoNT/A 重鏈干預(yù)組蛋白乙酰化的途徑還需通過探討其他組蛋白的亞類(H4, H9等)進(jìn)一步證實(shí)。不同組蛋白乙?；c神經(jīng)突起再生之間的確切內(nèi)在聯(lián)系還需進(jìn)一步澄清。
根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，可以推論：BoNT/A 重鏈可促進(jìn)組蛋白3的乙酰化；在同一時(shí)間點(diǎn)，組蛋白3的乙?；脚c神經(jīng)突起增長的長度相一致；組蛋白3乙?；赡苁荁oNT/A重鏈促神經(jīng)突起生長的相關(guān)機(jī)制之一。
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