謝　瑜，黎承平，武　坤，譚　琳

(1.昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，昆明　650032； 2.昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，昆明　650032)

淋巴瘤是一種發(fā)生在造血系統(tǒng)的血液腫瘤，在全部的惡性腫瘤中約占1.13%，腫瘤的發(fā)生除了與腫瘤細胞的生長有關以外，還與微環(huán)境有關，微環(huán)境包括基質細胞、白細胞等，其中巨噬細胞是白細胞的重要組成部分[1-2]。巨噬細胞有M1和M2型，其中M2型巨噬細胞是目前公認的能夠誘導淋巴瘤細胞增殖、侵襲、遷移的巨噬細胞[3-4]。轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)是具有多種功能的生長因子，人體內(nèi)的幾乎所有細胞都可以合成TGF-β1，其可以對細胞免疫功能、增殖等進行調控，并且與腫瘤的發(fā)生有關[5-6]。目前的研究顯示，TGF-β1對不同的腫瘤細胞的生長作用不同，并且TGF-β1在癌癥早期可以發(fā)揮抗腫瘤作用，而在癌癥的中、后期發(fā)揮促進腫瘤發(fā)展的作用[7]。研究表明，TGF-β1能夠抑制淋巴瘤細胞增殖[8]。本實驗擬通過探討TGF-β1對巨噬細胞誘導淋巴瘤細胞增殖、侵襲、遷移的影響，為以后研究腫瘤的發(fā)病機制和尋找有效的治療方法提供基礎。

1　材料和方法

1.1　材料

人單核細胞THP-1和淋巴瘤細胞Jiyoye均購自于中科院細胞庫。

1.2　主要試劑及儀器

二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度檢測試劑盒購自碧云天研究所；RPMI1640購自美國Sigma；蛋白提取試劑盒購自德國Qiagen；基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloprotease 9, MMP-9)抗體、增殖細胞核抗原(PCNA)抗體、基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloprotease 2, MMP-2)抗體、細胞核增殖抗原(Ki- 67)抗體購自于美國CTS；辣根過氧化物標記的IgG購自于碧云天；胎牛血清購自于杭州四季青；β肌動蛋白(β-actin)抗體購自于美國Abcam；TGF-β1購自美國Biovision；3K18低溫高速離心機購自美國Sigma；MK3酶標儀、371型CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo。

1.3　實驗方法

1.3.1MTT測定TGF-β1對淋巴瘤增殖影響

淋巴瘤細胞Jiyoye培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI 1640中，將細胞種植于96孔板中(種植密度為每孔4000個細胞)，并且在細胞中添加TGF-β1，使其最終濃度為0、0.2、0.4、0.8、1.6 ng/mL。將細胞放在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結束后，在每孔中依次添加10 μL的MTT，再繼續(xù)孵育4 h。把孔中的上清液吸除掉，再添加150 μL的DMSO。10 min以后，酶標儀測定540 nm各組的OD值。分組情況如表1。

表1　各組分組處理情況

1.3.2巨噬細胞誘導分化及分組處理

THP-1細胞培養(yǎng)于10%胎牛血清的RPMI 1640中，在實驗前用M-CSF將巨噬細胞誘導分化為M2型巨噬細胞。實驗分為Control、TGF-β1、M2、M2+TGF-β1共4組細胞。Control為常規(guī)培養(yǎng)的Jiyoye細胞；TGF-β1為用0.4 ng/mL的TGF-β1培養(yǎng)的Jiyoye細胞；M2為用M2型巨噬細胞培養(yǎng)液上清培養(yǎng)的Jiyoye細胞；M2+TGF-β1為用M2型巨噬細胞培養(yǎng)液上清培養(yǎng)的Jiyoye細胞，同時在培養(yǎng)液中添加0.4 ng/mL的TGF-β1。Control、TGF-β1、M2、M2+TGF-β1細胞按照上述方法分組處理以后，MTT法測定48 h的增殖情況。誘導分化步驟如下[9]：取約7×106個細胞接種到T25細胞瓶內(nèi)，0 d時在細胞培養(yǎng)液中添加20 ng/mL的M-CSF，在第5天時用含有20 ng/mL M-CSF、20 ng/mL IL-4、20 ng/mL IL-13、20 ng/mL IL-6的培養(yǎng)液誘導分化。誘導分化共9 d。

1.3.3Transwell小室測定侵襲和遷移

Jiyoye細胞用不含血清的培養(yǎng)液懸浮，接種于Transwell小室中，按照Control、TGF-β1、M2、M2+TGF-β1分組處理，另外在小室的下室中添加含血清的培養(yǎng)液。分別用基質膠濕化(侵襲)和無基質膠濕化(遷移)的孔徑為8 μm的Transwell小室按照上述方法處理，培養(yǎng)48 h以后，把上室取出，取棉簽把上室中沒有穿膜的細胞擦掉，然后置于甲醇溶液中固定10 min，再用0.1%結晶紫染色以后，放在倒置顯微鏡下對穿膜的細胞進行統(tǒng)計，每組樣品隨機選5個視野。

1.3.4Western blot分析MMP-2、MMP-9、PCNA、Ki- 67蛋白表達

Control、TGF-β1、M2、M2+TGF-β1細胞按照上述方法分組處理培養(yǎng)48 h以后，提取細胞總蛋白，用BCA法對蛋白定量。分別配制10%分離膠、5%濃縮膠進行電泳。按照每孔添加50 μg樣品進行變性處理。80 V的電壓條件下電泳30 min；120 V的電壓條件下電泳直到染料進入到凝膠底部。在200 mA恒流條件下把蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，轉膜時間約為60 min。取膜，用5%脫脂奶粉于室溫環(huán)境封閉1.5 h，在1∶600、1∶600、1∶800、1∶800稀釋的MMP-2、MMP-9、PCNA、Ki- 67一抗中4℃孵育12 h，再把膜放在1∶3000稀釋的二抗中室溫孵育2 h。用ECL發(fā)光以后，Image J測定條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參。

1.4　統(tǒng)計學方法

2　結果

2.1　TGF-β1對淋巴瘤細胞增殖的影響

結果見圖1中所示，用0、0.2、0.4、0.8、1.6 ng/mL濃度的TGF-β1處理后的細胞OD值分別為：0.85±0.06、0.64±0.05、0.47±0.03、0.35±0.05、0.26±0.04。0、0.2、0.4、0.8、1.6 ng/mL濃度的TGF-β1處理后的細胞OD值比較，經(jīng)單因素方差分析，差異具有顯著性(P< 0.001)，0.2、0.4、0.8、1.6 ng/mL濃度的TGF-β1作用后的淋巴瘤細胞OD值明顯低于0 ng/mL(P< 0.05)。0.4、0.8、1.6 ng/mL濃度的TGF-β1作用后的淋巴瘤細胞OD值明顯低于0.2 ng/mL(P< 0.05)。0.8、1.6 ng/mL濃度的TGF-β1作用后的淋巴瘤細胞OD值明顯低于0.4 ng/mL(P< 0.05)。1.6 ng/mL濃度的TGF-β1作用后的淋巴瘤細胞OD值明顯低于0.8 ng/mL(P< 0.05)。TGF-β1可以抑制淋巴瘤細胞的增殖。TGF-β1對淋巴瘤細胞半數(shù)抑制濃度約為0.4 ng/mL，所以采用0.4 ng/mL的TGF-β1作后續(xù)實驗。

注：與0 ng/mL相比，aP< 0.05；與0.2 ng/mL相比，bP< 0.05；與0.4 ng/mL相比，cP< 0.05；與0.8 ng/mL相比，dP< 0.05。圖1　TGF-β1對淋巴瘤細胞增殖的影響Note.Compared with 0 ng/mL treatment，aP< 0.05. Compared with 0.2 ng/mL treatment，bP< 0.05. Compared with 0.4 ng/mL treatment，cP< 0.05. Compared with 0.8 ng/mL treatment，dP< 0.05.Fig.1　Effect of TGF-β1 on the proliferation of lymphoma cells

2.2　TGF-β1對巨噬細胞誘導淋巴瘤細胞增殖影響

結果見圖2中所示，Control、TGF-β1、M2、M2+TGF-β1細胞OD值分別為：0.78±0.09、0.42±0.05、1.16±0.13、0.86±0.08。4組細胞OD值比較差異有顯著性(P< 0.001)，TGF-β1細胞OD值明顯低于Control(P< 0.05)。M2細胞明顯高于Control(P< 0.05)。M2+TGF-β1細胞OD值明顯高于TGF-β1，并且低于M2(P< 0.05)。M2型巨噬細胞誘導淋巴瘤細胞增殖，TGF-β1可以減弱M2型巨噬細胞對淋巴瘤細胞增殖的誘導作用。

注：與Control相比，aP< 0.05；與TGF-β1相比，bP< 0.05；與M2相比，cP< 0.05。圖2　TGF-β1對巨噬細胞誘導的淋巴瘤細胞增殖影響Note.Compared with the control group,aP< 0.05. Compared with the TGF-β1-treated group,bP< 0.05. Compared with the M2-treated group，cP< 0.05.Fig.2　Effect of TGF-β1 on the proliferation of lymphoma cells induced by macrophages

2.3　TGF-β1對巨噬細胞誘導的淋巴瘤細胞侵襲影響

注：(A)Transwell小室測定細胞侵襲結果；(B)各組細胞侵襲數(shù)目；與Control相比，aP< 0.05；與TGF-β1相比，bP< 0.05；與M2相比，cP< 0.05。圖3　TGF-β1對巨噬細胞誘導淋巴瘤細胞侵襲影響Note.(A)Transwell chamber for measuring cell migration.(B)Number of migrated cells in each group. Compared with the control group,aP< 0.05. Compared with the TGF-β1-treatment group,bP< 0.05. Compared with the M2-treated group,cP< 0.05.Fig.3　Effect of TGF-β1 on the invasion of macrophage-induced lymphoma cells

圖3所示，Control、TGF-β1、M2、M2+TGF-β1細胞侵襲細胞數(shù)目分別為：147.28±13.92、110.35±10.64、213.92±16.79、158.67±13.26。4組細胞侵襲細胞數(shù)目整體比較差異有顯著性(P< 0.001)，TGF-β1侵襲細胞數(shù)目明顯低于Control(P< 0.05)。M2侵襲細胞數(shù)目明顯高于Control(P< 0.05)。M2+TGF-β1侵襲細胞數(shù)目明顯高于TGF-β1，并且低于M2(P< 0.05)。M2型巨噬細胞誘導淋巴瘤細胞侵襲，TGF-β1可以減弱M2型巨噬細胞對淋巴瘤細胞侵襲的誘導作用。

2.4　TGF-β1對巨噬細胞誘導的淋巴瘤細胞遷移影響

圖4所示，Control、TGF-β1、M2、M2+TGF-β1遷移細胞數(shù)目分別為：264.31±25.87、195.82±17.59、338.57±28.64、278.65±25.83。4組遷移細胞數(shù)目整體比較差異有顯著性(F=16.723，P< 0.001)，TGF-β1遷移細胞數(shù)目明顯低于Control(P< 0.05)。M2遷移細胞數(shù)目明顯高于Control(P< 0.05)。M2+TGF-β1遷移細胞數(shù)目明顯高于TGF-β1，并且低于M2(P< 0.05)。M2型巨噬細胞誘導淋巴瘤細胞遷移，TGF-β1可以減弱M2型巨噬細胞對淋巴瘤細胞遷移的誘導作用。

注：(A)Transwell小室測定細胞遷移；(B)各組細胞遷移數(shù)目；與Control相比，aP< 0.05；與TGF-β1相比，bP< 0.05；與M2相比，cP< 0.05。圖4　TGF-β1對巨噬細胞誘導的淋巴瘤細胞遷移影響Note.(A)Transwell chamber for measuring cell migration.(B)Number of migrated cells in each group. Compared with the control group,aP< 0.05. Compared with the TGF-β1-treated group,bP< 0.05. Compared with the M2-treated group,cP< 0.05.Fig.4　Effect of TGF-β1 on the migration of macrophage-induced lymphoma cells

圖5　Western blot法測定TGF-β1對巨噬細胞培養(yǎng)液上清作用后的淋巴瘤細胞中MMP-2、MMP-9、PCNA、Ki- 67蛋白水平影響Fig.5　Effect of TGF-β1 on the levels of MMP-2, MMP-9, PCNA and Ki- 67 proteins in the lymphoma cells treated with supernatant of macrophage culture fluid. Results of Western blot assay

2.5　TGF-β1對巨噬細胞培養(yǎng)液上清作用后的淋巴瘤細胞中MMP-2、MMP-9、PCNA、Ki-67蛋白水平影響

圖5和表1所示，TGF-β1細胞中MMP-2、MMP-9、PCNA、Ki-67蛋白水平明顯低于Control(P< 0.05)。M2細胞中MMP-2、MMP-9、PCNA、Ki- 67蛋白水平明顯高于Control(P< 0.05)。M2+TGF-β1細胞中MMP-2、MMP-9、PCNA、Ki- 67蛋白水平明顯高于TGF-β1，并且低于M2(P< 0.05)。M2型巨噬細胞誘導淋巴瘤細胞表達MMP-2、MMP-9、PCNA、Ki- 67，TGF-β1可以減弱M2型巨噬細胞誘導的淋巴瘤細胞表達MMP-2、MMP-9、PCNA、Ki- 67作用。

3　討論

腫瘤細胞的惡性增殖與腫瘤的發(fā)生有關，除此以為，腫瘤組織中還含有非腫瘤細胞，這些非腫瘤細胞主要由基質細胞、白細胞等組成，并且白細胞以巨噬細胞為主[10]。巨噬細胞具有多向分化潛能，在不同的微環(huán)境下，巨噬細胞的功能、活化程度等都不相同，巨噬細胞分為M1型、M2型，其中M2型與腫瘤微環(huán)境密切相關[11-14]。研究表明，M2型巨噬細胞與乳腺癌、淋巴瘤、胰腺癌等患者的預后有關，M2型巨噬細胞過多常常預示預后不良[15-17]。M2型巨噬細胞能夠誘導惡性腫瘤細胞的增殖，誘導腫瘤的轉移[18-19]。本實驗結果表明，M2型巨噬細胞培養(yǎng)液上清處理后的淋巴瘤細胞增殖能力增加，細胞侵襲和遷移數(shù)目也增多，這與上述研究報道一致。

表1　TGF-β1對巨噬細胞培養(yǎng)液上清作用后的淋巴瘤細胞中MMP-2、MMP-9、PCNA、Ki- 67蛋白水平影響

注：與Control相比，aP< 0.05；與TGF-β1相比，bP< 0.05；與M2相比，cP< 0.05。

Note. Compared with the control group,aP< 0.05. Compared with the TGF-β1-treated group,bP< 0.05. Compared with the M2-treated group,cP< 0.05.

TGF-β1具有多種調控作用，在不同的細胞中的作用不同，對細胞的增殖、分化等具有相互矛盾的雙重作用，TGF-β1對上皮細胞、造血細胞、淋巴樣細胞等具有生長抑制作用，而對乳腺癌細胞具有增殖促進作用[20-23]。TGF-β1在腫瘤中表達，并且對于腫瘤的調控作用具有異質性，在同種腫瘤或者不同腫瘤的不同時期，其對細胞生長的作用不同[24]。陳雨龍等[25]的研究顯示，TGF-β1刺激卵巢癌A2780細胞以后，細胞在570 nm的OD值升高，細胞穿過Transwell小室膜的細胞數(shù)目增多，TGF-β1誘導A2780細胞增殖、侵襲和遷移。李柱虎等[8]用TGF-β1處理淋巴瘤細胞以后，淋巴瘤細胞的存活率降低，TGF-β1抑制淋巴瘤細胞增殖。陳元仲等[26]發(fā)現(xiàn)，外源性的TGF-β1可以降低白血病HL-60細胞的增殖能力。本實驗結果顯示，TGF-β1處理后的淋巴瘤細胞增殖能力下降，細胞遷移和侵襲能力也下降，說明TGF-β1在淋巴瘤細胞中發(fā)揮抑制作用。本實驗還進一步用TGF-β1處理M2型巨噬細胞誘導的淋巴瘤細胞增殖侵襲和遷移，發(fā)現(xiàn)TGF-β1可以抑制M2型巨噬細胞對淋巴瘤細胞的增殖、侵襲和遷移的誘導作用。

細胞外基質的主要成分為Ⅳ型膠原酶，而MMP-2、MMP-9分別是可以降解Ⅳ型膠原酶的非糖化和糖化形式，與腫瘤的轉移密切相關[27]。PCNA、Ki- 67是細胞增殖的標志蛋白，其表達水平升高后標志著細胞增殖活性增加[28-29]。本實驗表明，TGF-β1降低淋巴瘤細胞中MMP-2、MMP-9、PCNA、Ki- 67蛋白表達，并且TGF-β1還可以抑制M2型巨噬細胞誘導的淋巴瘤細胞中MMP-2、MMP-9、PCNA、Ki- 67蛋白表達，這與檢測的細胞增殖、侵襲和遷移結果一致。

M2型巨噬細胞誘導淋巴瘤細胞增殖、遷移和侵襲，而TGF-β1可以抑制M2型巨噬細胞對淋巴瘤細胞增殖、遷移和侵襲的作用，這對于以后研究腫瘤微環(huán)境在腫瘤的發(fā)生中的作用具有重要意義，本研究為以后探討TGF-β1在淋巴瘤發(fā)病機制中的作用奠定了基礎。本實驗只在一株淋巴瘤細胞中進行了初步研究，在以后的實驗中會在多株細胞中進行驗證。