韓　龍，吳水培

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)解放軍九八臨床學(xué)院，浙江 湖州　313000； 2.解放軍九八醫(yī)院，浙江 湖州　313000)

絕經(jīng)后婦女因卵巢功能衰退，雌激素嚴(yán)重缺乏，骨吸收大于骨形成，易出現(xiàn)骨質(zhì)疏松，表現(xiàn)為骨強(qiáng)度受損、骨組織顯微結(jié)構(gòu)退后和骨折危險(xiǎn)性增加，骨質(zhì)疏松可導(dǎo)致患者活動(dòng)能力下降、軀體疼痛，嚴(yán)重者可導(dǎo)致骨折，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生命安全[1]。目前西醫(yī)治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松主要方法為抑制骨吸收和促進(jìn)骨形成，激素替代療法是常用的治療方式，但激素替代可增加患者子宮內(nèi)膜癌和血栓發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，降低了患者治療的依從性[2]。注射用骨肽是含有多種骨代謝的活性肽類，具有調(diào)節(jié)骨代謝、刺激成骨細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)鈣磷代謝，促進(jìn)新骨形成，防治骨質(zhì)疏松和促進(jìn)骨折愈合等效果，是治療骨質(zhì)疏松的常用藥物[3]。研究顯示，鈣吸收障礙和營養(yǎng)物質(zhì)生物利用度降低也是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的重要因素，腸道鈣吸收以主動(dòng)吸收為主，需要鈣調(diào)節(jié)蛋白(CaBp-D9K)協(xié)助，CaBp-D9K活性降低可導(dǎo)致鈣吸收障礙，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松發(fā)生，提高腸鈣吸收率是防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的重要途徑[4]。目前較少見注射用骨肽對(duì)CaBp-D9K影響的報(bào)道，本研究通過對(duì)注射用骨肽干預(yù)下觀察去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠CaBp-D9KmRNA表達(dá)、骨密度、骨生物力學(xué)性能的變化，進(jìn)一步探討注射用骨肽治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1　材料和方法

1.1　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重180～230 g，3月齡，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供 [SCXK(皖)2017-0018]，在安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[SYXK(皖)2017-0124]，自由進(jìn)食飲水，保持12 h晝夜節(jié)律，室溫22℃～25℃，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷，安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批號(hào)：2017-0024。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行建模，采用隨機(jī)數(shù)字表法，選取24只SD大鼠作為空白組，不接受干預(yù)治療；選取24只SD大鼠作為假手術(shù)組；在建模成功后隨機(jī)選取48只SD大鼠分為2組，模型組和觀察組，每組24只。空白組、假手術(shù)組、模型組給予生理鹽水灌胃，觀察組給予注射用骨肽灌胃。

1.2　主要試劑及儀器

注射用骨肽購自黑龍江珍寶島藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：10 mg多肽；1,25(OH)2D3酶聯(lián)免疫試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司；Trizol總RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；CaBP-D9k、β-actin引物序列由大連寶公司合成。

Discovery-A骨密度儀購自美國好樂杰公司；高速離心機(jī)購自長沙湘銳離心機(jī)有限公司；Genios多功能酶標(biāo)儀購自奧地利Tecan公司；RG-3000 Real-Time PCR儀購自北京照生行儀器設(shè)備有限公司； AG-IC20KN萬能材料實(shí)驗(yàn)機(jī)購自島津儀器蘇州有限公司。

1.3　實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1模型的建立

空白組不予以處理，模型組和觀察組參照文獻(xiàn)[5]，在SD大鼠適應(yīng)性飼喂1周后，對(duì)大鼠進(jìn)行建模，采用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，背部正中切口，進(jìn)入腹腔背側(cè)，完整切除雙側(cè)卵巢，假手術(shù)組同樣采用3%戊巴比妥鈉麻醉，背部正中切口，進(jìn)入腹腔背側(cè)，切除小段腸系膜。術(shù)后均給予抗生素3 d預(yù)防感染。術(shù)后大鼠飼養(yǎng)條件同術(shù)前。

當(dāng)改變煤體內(nèi)孔隙壓力分布后，裂隙偏向孔隙壓力較高的方向擴(kuò)展，其擴(kuò)展方向與最大主應(yīng)力方向的夾角大小可以反映出控制孔導(dǎo)控作用的強(qiáng)弱。如圖8所示，控制水壓為10 MPa時(shí)，裂隙偏角最大并與控制孔貫通，之后地應(yīng)力占據(jù)主導(dǎo)作用，裂隙逐漸沿垂直最小主應(yīng)力方向延伸，如圖8d所示。

1.3.2藥物干預(yù)

建模3個(gè)月后對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行干預(yù)，觀察組：注射用多肽成人每日劑量10 mg，按60 kg計(jì)算，為0.17 mg/kg，大鼠等效劑量按成人每日用藥量的6.3倍計(jì)算為1.07 mg/kg，取1.1 mg/kg，溶于1 mL生理鹽水腹腔注射。模型組、假手術(shù)、空白組給予等量生理鹽水腹腔注射。連續(xù)干預(yù)2個(gè)月。

1.3.3骨顯微結(jié)構(gòu)和骨密度檢測(cè)

藥物干預(yù)結(jié)束后采用micro-CT掃描股骨頭至股骨中段，獲取骨體積(BV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁分離度(Tb.Sp)等參數(shù)；骨顯微結(jié)構(gòu)完成后采用Discovery-A骨密度儀檢測(cè)股骨骨密度。

1.3.4血清1,25(OH)2D3和骨生物力學(xué)

大鼠麻醉后行腹主動(dòng)脈取血，4℃靜置20 min，3000 r/min離心20 min，取上清液，保存于-80℃冰箱，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清1,25(OH)2D3水平；分離大鼠左側(cè)股骨采用三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)[6]記錄股骨最大載荷(指股骨斷裂前所能承受的最大力)和斷裂載荷值(股骨斷裂時(shí)所承受的力)。

1.3.5小腸鈣結(jié)合蛋白(CaBp-D9K)mRNA表達(dá)測(cè)定

取十二指腸以下10 cm小腸，無菌生理鹽水沖洗干凈，縱行剪開腸腔，刮下腸黏膜，采用Trizol法提取小腸組織總RNA，在反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV作用下，將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用RG-3000 real-time PCR儀擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95℃ 2 min，95℃ 10 s，60℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)，引物序列見表1。

1.4　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1　股骨顯微結(jié)構(gòu)參數(shù)的比較

空白組和假手術(shù)組BV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp水平相比較差異均無顯著性(P> 0.05)；模型組BV、Tb.Th、Tb.N水平低于空白組和假手術(shù)組，Tb.Sp高于空白組和假手術(shù)組，觀察組BV、Tb.Th、Tb.N水平低于模型組，Tb.Sp高于模型組，差異均有顯著性(P< 0.05)。(見表2和圖1)

2.2　骨密度和骨生物力學(xué)的比較

空白組和假手術(shù)組骨密度、最大載荷、斷裂載荷相比較差異均無顯著性(P> 0.05)；模型組骨密度、最大載荷、斷裂載荷均顯著低于空白組和假手術(shù)組(P< 0.05)；觀察組骨密度、最大載荷、斷裂載荷均顯著低于模型組(P< 0.05)。(見表3)

表1　CaBp-D9K和β-actin引物序列

表2　四組大鼠股骨顯微結(jié)構(gòu)參數(shù)相比較(n=24)

注：與空白組相比較，aP< 0.05；與假手術(shù)組相比較，bP< 0.05；與模型組相比較，cP< 0.05。

Note. Compared with the blank group,aP< 0.05. Compared with the sham operation group,bP< 0.05. Compared with the model group,cP< 0.05.

圖1　四組大鼠股骨顯微結(jié)構(gòu)的micro-CT圖像Fig.1　Micro-CT images of the microstructure of the femur of the four rat groups

組別Groups骨密度(g/cm2)Bone Density最大載荷(N)Maximum Load斷裂載荷(N)Breaking Load空白組Blank Group0.258±0.01733.738±2.38259.644±3.518假手術(shù)組Sham Operation Group0.253±0.02132.846±2.42358.859±4.136模型組Model Group0.218±0.026ab20.541±3.609ab45.261±2.634ab觀察組Observation Group0.238±0.019abc27.457±2.810abc53.868±3.714abc

注：與空白組相比較，aP< 0.05；與假手術(shù)組相比較，bP< 0.05；與模型組相比較，cP< 0.05。

Note. Compared with the blank group,aP< 0.05. Compared with the sham operation group,bP< 0.05. Compared with the model group,cP< 0.05.

表4　四組血清1,25(OH)2D3和小腸CaBp-D9K mRNA表達(dá)相比較(n=24)

注：與空白組相比較，aP< 0.05；與假手術(shù)組相比較，bP< 0.05；與模型組相比較，cP< 0.05。

Note. Compared with the blank group,aP< 0.05. Compared with the sham operation group,bP< 0.05. Compared with the model group,cP< 0.05.

2.3　血清1,25(OH)2D3和小腸CaBp-D9K mRNA表達(dá)的比較

空白組和假手術(shù)組血清1,25(OH)2D3和小腸CaBp-D9KmRNA表達(dá)相比較差異均無顯著性(P> 0.05)；模型組血清1,25(OH)2D3和小腸CaBp-D9K mRNA表達(dá)均低于空白組和假手術(shù)組，觀察組血清1,25(OH)2D3和小腸CaBp-D9K mRNA表達(dá)均低于模型組，差異均有顯著性(P< 0.05)。(見表4)

3　討論

腸道鈣的吸收包括被動(dòng)擴(kuò)散過程和主動(dòng)跨細(xì)胞過程，主動(dòng)跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)過程是腸道鈣的吸收主要方式，需要CaBp-D9K協(xié)助完成轉(zhuǎn)運(yùn)過程。CaBp-D9K分子量為9000，是受活性維生素D調(diào)節(jié)的鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其主要功能是提高維生素D依賴性細(xì)胞內(nèi)鈣轉(zhuǎn)運(yùn)，增加鈣離子通過細(xì)胞彌散的速度，使鈣離子快速從細(xì)胞頂端到達(dá)基底側(cè)，因此小腸CaBp-D9K含量與腸道鈣吸收能力成正比[7]。絕經(jīng)女性雌激素水平降低可導(dǎo)致繼發(fā)性甲狀旁腺和維生素D合成減少，導(dǎo)致腸道功能缺陷，隨著年齡增加，腸黏膜CaBp-D9K表達(dá)逐漸降低，70歲的人較其青年時(shí)期的CaBp-D9K降低超過50%，因此，CaBp-D9K表達(dá)降低是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松高發(fā)的重要因素[8]。1,25(OH)2D3是維生素D3的活性代謝產(chǎn)物，可與維生素D受體結(jié)合調(diào)控CaBp-D9K活性，外源性1,25(OH)2D3補(bǔ)充可增加CaBp-D9K基因轉(zhuǎn)錄[9]。

本研究采用去卵巢大鼠復(fù)制女性絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型。去卵巢后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)雌激素水平降低，骨吸收增強(qiáng)，骨生長減弱，骨量丟失，逐步形成骨質(zhì)疏松模型。本研究結(jié)果顯示，模型組骨密度、最大載荷、斷裂載荷、BV、Tb.Th、Tb.N水平低于空白組和假手術(shù)組；Tb.Sp高于空白組和假手術(shù)組；觀察組骨密度、最大載荷、斷裂載荷、BV、Tb.Th、Tb.N水平均高于對(duì)照組，Tb.Sp低于模型組。結(jié)果提示，注射用骨肽可促進(jìn)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨量增加，骨小梁連接更為緊密，對(duì)去卵巢所致骨質(zhì)疏松具有良好的治療作用，與有關(guān)研究[10]一致。本研究結(jié)果顯示，模型組血清1,25(OH)2D3水平和小腸CaBp-D9k mRNA表達(dá)均顯著低于空白組和假手術(shù)組，提示腸黏膜CaBp-D9k mRNA表達(dá)降低所致鈣吸收障礙可能是去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松發(fā)生的重要因素，與有關(guān)研究[8-9]一致。本研究結(jié)果同時(shí)顯示，觀察組血清1,25(OH)2D3水平和小腸CaBp-D9k mRNA表達(dá)均高于模型組，提示注射用骨肽可通過提高1,25(OH)2D3水平，增加小腸CaBp-D9k mRNA表達(dá)，促進(jìn)腸道鈣吸收。

綜上所述，注射用骨肽可降低去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松程度，增加小腸CaBp-D9k mRNA表達(dá)，促進(jìn)腸鈣吸收可能是其重要作用機(jī)制。