于 紅，馬曉琳，劉永峰，張 瑞,

（1.新疆特殊環(huán)境物種保護與調控生物學自治區(qū)重點實驗室，新疆特殊環(huán)境物種多樣性應用與調控重點實驗室，干旱區(qū)植物逆境生物學實驗室，中亞區(qū)域跨境有害生物聯(lián)合控制國際研究中心，新疆烏魯木齊830054；2.陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西西安710062）

動物宰后的成熟過程又稱排酸處理，在此過程會發(fā)生一系列生理生化反應。該反應夠促使肉質變得柔軟、多汁，美味[1]，同時也能對肉類風味的前體物質產生影響[2-3]，降低了山羊肉的膻味，改善羊肉口感和營養(yǎng)價值。宰后成熟過程對改善肉品質有很大幫助，宰后成熟會影響肌肉的剪切力、色澤、pH、蒸煮損失率、蛋白質含量和肌漿（原）蛋白溶解度的變化，繼而影響肉質的嫩度、持水性、風味等理化指標[4]。肌肉在向優(yōu)質肉轉化中發(fā)生巨大的生化變化，這從根本上決定了生肉的大部分重要品質（顏色、保水能力和嫩度）[5-6]。前期項目組針對陜北橫山羊對宰后48 h內不同部位的肉品質進行探索，得到背部最長肌的嫩度和蛋白質穩(wěn)定性優(yōu)于腹部肌肉[7]。

當動物被屠宰后，肌肉組織不會立即停止代謝，許多代謝能量系統(tǒng)（糖原分解、糖酵解和氧化磷酸化）試圖在死后早期維持肌肉內ATP穩(wěn)態(tài)[5]。由于糖酵解作用產生乳酸，促使H+的積累，導致肌肉的pH顯著下降，通過調控宰后的能量代謝以及肌肉收縮反應來影響肉的品質[5]。適宜的成熟時間能夠提高羊肉的嫩度和風味，同時參與宰后成熟過程的物質受到復雜的調控，對肉類品質的發(fā)展也起著重要的作用。

新疆山羊是一種絨肉奶兼用的山羊品種，常以瘦肉含量多、有嚼勁為優(yōu)點，且肌纖維細嫩，營養(yǎng)價值較高，受到廣大消費者的喜愛。鑒于不同成熟時間羊肉在嫩度、保水性、蛋白質結構都有明顯差異，且目前對具有地方特色的新疆山羊研究以品種改良上居多，在肉品質方面變化機制方面的研究較少，本研究以1.5周歲的新疆公山羊為研究對象，通過研究宰后不同成熟時間下的肉質理化性質變化，探討宰后成熟對山羊肉品質的影響作用，為優(yōu)化羊肉儲存方式以及合理改善羊肉品質提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羊肉樣品 取自新疆烏魯木齊市華凌畜牧屠宰基地。取三只1.5周歲左右健康的新疆山羊（公）的背部最長肌為研究對象；氯化鉀、硼酸（99.8%）、海砂、氫氧化鈉、95%乙醇、硫酸銅、硫酸鉀、石油醚、硫酸、甲醇、鹽酸 分析純，烏魯木齊科華偉業(yè)生物科技有限公司。

便攜式pH計 濟南歐萊博技術有限公司；H721型可見分光光度計 上海儀電科學儀器股份有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州市億能實驗儀器廠；CR-400性便攜式色差儀 日本Konica minolta公司；TA-XT2型質構儀 北京微訊超技儀器技術有限公司；JA2003N電子天平 北京海天友誠科技有限公司；KDN-04A凱式定氮儀 上海坤誠科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 在同一羊場選擇1.5周歲左右的3只健康且未去勢新疆山羊（屠宰率最高）為三組重復試驗依據(jù)并帶回實驗室進行宰殺，盡量減少在屠宰過程的應激反應[8]。宰后取3只羊背部最長肌上少許肉樣，作為宰后0 h樣品。其余樣品放置4 ℃冰箱進行宰后成熟過程，并分別在宰后前期（宰后12 h）、中期（宰后 24 h）、后期（宰后 48 h）不同時間點的羊肉進行取樣。

1.2.2 pH測定 按照國標GB/T 5009.237-2016進行調整，稱取去筋膜的碎肉樣約4 g于燒杯中，加0.1 mol/L KCl溶液 40 mL，溫下放置30 min，用pH計測定，每組測量3次，結果取平均值。

1.2.3 質構特性（TPA）的測定 參照劉永峰等[9]的方法，取厚度約為1.5 cm×1.5 cm×0.5 cm長方體肉樣，采用質構儀進行檢測。參數(shù)設置：P36R探頭；側前、中、后的速度均為1.0 mm.s-1；檢測觸發(fā)力5 g；檢測時間間隔5 s，測定內聚性、咀嚼性、回復性等5個質構特性指標。

1.2.4 保水性的測定 參照夏安琪等[10]方法測定滴水流失率，取宰后時間為0、12、24和48 h的肉樣，稱重并分別記下質量為W1，鉤住肉樣置于一個吹氣膨脹的保鮮袋中，不與袋子接觸并扎緊袋口，放在4 ℃恒溫箱放置24 h，取出肉樣稱重質量為W2，羊肉滴水流失率計算公式：滴水流失率(%)=[(W1-W2)/W1]×100。

蒸煮損失測定方法參照Honikel等[11]的方法，分別取宰后時間為0、12、24和48 h的肉樣稱重并記下質量為G1，將肉樣放入蒸煮袋中封口并80 ℃水浴45 min，隨后冷卻并在4 ℃過夜。吸干肉樣表面汁液并再次稱重，質量為G2。蒸煮損失率計算公式：蒸煮損失 (%)＝[(G1-G2)/G1]×100。

1.2.5 蛋白溶解度 參考相關文獻[12]進行測定。在1.0 g碎肉樣中加入0.025 mol/L預冷的磷酸鉀緩沖液10 mL，在冰浴下勻漿3次。4 ℃搖動抽提12 h，然后離心 20 min，上清液用 BCA(Bicinchoninic acid)法測定的蛋白濃度即為肌漿蛋白溶解度。隨后稱取1.0 g碎肉樣，加20 mL含1.1 mol/L碘化鉀0.1 mol/L預冷的磷酸鉀緩沖液，步驟同上，即為總可溶性蛋白溶解度。肌原纖維蛋白溶解度按式（1）計算。

式中：c-肌原蛋白溶解度，μg /μL；c1-全蛋白溶解度，μg/μL；c2-肌漿蛋白溶解度，μg/μL。

1.2.6 糖原測定 按照國標GB/T 9695.31-2008進行調整，取成熟后不同時間點肉樣，用生理鹽水漂洗并剪成碎末。然后精確稱1000 mg肉樣于試管中，加入3 mL 30% KOH并沸水煮2 h冷卻至室溫，后加入6 mL無水乙醇搖均勻靜置1 min，在3000 r/min、4 ℃下離心15 min。沉淀加入6 mL 1 mol/L硫酸溶解。取1 mL樣品加入5 mL蒽酮試劑，橡膠塞封閉試管，沸水浴加熱15 min，冷卻至室溫，最后在分光光度計620 nm處測定OD值。

1.2.7 蛋白質提取與酶解 稱取宰后不同成熟時間的樣品，采用 SDT（4%(w/v)SDS，100mmol/L Tris/HCl pH7.6，0.1 mol/L DTT）裂解法提取蛋白質，然后采用BCA法進行蛋白質定量。每個樣品取適量蛋白質采用 FASP（Filter aided proteome preparation）方法進行胰蛋白酶酶解[13]。

1.2.8 LC-MS/MS數(shù)據(jù)采集 每份樣品采用HPLC液相系統(tǒng)Easy nLC進行分離。色譜柱以95%的0.1%甲酸水溶液平衡，樣品經(jīng)過分析柱分離，流速為300 nL/min。后用Q-Exactive質譜儀進行分析。檢測方式為正離子，母離子掃描范圍300～1800 m/z，一級質譜分辨率70000在質荷比200 m/z處，AGC（Automatic gain control） target為1e6，Maximum IT 為50 ms，動態(tài)排除時間（Dynamic exclusion）為 60.0 s。多肽和多肽碎片的質量電荷比按照下列方法采集：每次全掃描（full scan）后采集 20個碎片圖譜（MS2 scan），MS2 Activation Type為 HCD，Isolation window為 2 m/z，二級質譜分辨率 17500在 200 m/z處，Normalized Collision Energy為 30 eV，Underfill為 0.1%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均設置3次重復，且所得數(shù)值采用平均值±標準差表示，采用 Mascot2.2和 Proteome Discoverer1.4進行查庫鑒定及定量分析，并采用Excel及SPSS19.0分析軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 不同成熟時間的山羊肉pH的變化

宰后山羊肉成熟過程中的肌肉pH變化的大小和速度除了影響肌肉色澤、嫩度和多汁性外[14]，同時也影響了宰后山羊肌糖元的酵解速度和強度。屠宰后，動物體內有氧呼吸停止，體內肌肉代謝變成糖酵解為主的無氧代謝，所以產生乳酸的速率加快，pH也隨之發(fā)生改變[15]。選取放宰后不同成熟時間下的山羊肉的背部最長肌進行品質測定，結果顯示不同宰后成熟時間下0、12、24和48 h的山羊肉差異顯著（圖1，P＜0.05）。山羊宰后48 h內的pH變化呈均勻下降，其成熟過程中的pH在6.5～5.57之間，且仍有下降的趨勢。這說明成熟過程中的山羊肉宰后早期pH較高；隨著成熟時間延長，pH逐漸降低，且差異顯著（P＜0.05）。山羊在宰后0 h的pH較高可能是因山羊成長過程中的運動導致肌肉中的乳酸沉積和神經(jīng)興奮所致[16]。而宰后48 h內山羊肉的pH偏低則可能與宰后糖酵解有關[17]。

圖1 不同宰后成熟時間對羊肉的pH變化Fig.1 Changes of mutton pH at post-mortem in different maturation time

2.2 不同成熟時間的山羊肉質構特性（TPA）的變化

質構特性指標能夠客觀的反映食物品質，與感官性狀間更有不可分割的關系，比感官評價更加客觀、準確[18]。宰后成熟過程中山羊肉TPA變化結果如表1所示，硬度、回復力、咀嚼性在宰后48 h內的成熟過程中變化不明顯（P＞0.05）。宰后成熟12 h期間，內聚力顯著下降（P＜0.05），并且在 24～48 h 的成熟階段又顯著上升0.53左右（P＜0.05），與宰后初期（0 h）相似。山羊肉背部最長肌的彈性，隨著宰后時間的延長呈現(xiàn)降低的趨勢，且在宰后0～48 h緩慢下降（P＜0.05），從宰后初期的0.78下降到0.49左右。綜上結果顯示，在宰后24～48 h，山羊肉的TPA有較明顯的變化，在孫天利[19]對牛肉的研究中，該現(xiàn)象出現(xiàn)在儲存的第4 d，這一現(xiàn)象可能是因為肉類的品種不同。在48 h的成熟過程中，內聚性與彈性的變化明顯，可能是與宰后成熟過程中的部分蛋白質水解，以及微生物的生長繁殖造成的肉質改變[20]。

表1 宰后不同成熟時間山羊肉（TPA）的變化Table 1 Changes of TPA of goat meat at different maturation time after slaughter

2.3 不同成熟時間的山羊肉保水性變化

由圖2可知，蒸煮損失率在山羊死后初期0～12 h緩慢上升到34.9%左右（P＜0.05），但在宰后12 h后，均呈顯著下降趨勢（P＜0.05），且約下降了20%。隨著成熟時間的延長，山羊肉的滴水損失在宰后0～24 h顯著增加（P＜0.05），則在24～48 h的成熟階段無顯著差異，比宰后初期約上升了1倍（圖3）。

圖2 不同成熟時間的羊肉蒸煮損失率變化Fig.2 Variation of cooking loss of mutton with different maturation time

圖3 不同宰后成熟時間對羊肉的滴水流失率變化Fig.3 Changes in drip loss of mutton at different maturation time after slaughter

屠宰后的保水性是指宰后肌肉在外力作用下仍能保持原有的水分與滲透水分的能力[21]，又稱為肉質的持水性，能夠決定羊肉口感和肉食品質的優(yōu)劣。研究表明，蒸煮損失率和滴水損失率兩個指標共同決定了宰后肉質的保水性[22]。滴水損失越高說明肉的持水能力越差，對肉品質的影響較大。滴水損失升高可能是因為宰后肌原纖維蛋白和細胞膜鏈接在一起的蛋白發(fā)生降解，為肌肉汁液的流失提供了通道[23]。此外，也可能是由于成熟中乳酸的積累，pH下降到與主要蛋白質的等電點相時，此時蛋白質的正負電荷相互吸引，則肌原纖維之間的間隔減小，對水分的吸引力減小[14]。

2.4 不同成熟時間對山羊肉蛋白質溶解度的影響

蛋白的溶解度是反映蛋白降解程度的重要指標之一，如表2可知山羊肉肌原纖維蛋白溶解度在宰后 12 h 內均顯著下降（P＜0.05），12 h 后逐漸增加，且在48 h 時山羊肉樣的肌原纖維蛋白溶解度顯著小于最初的溶解度（P＜0.05）。說明山羊肉的肌原纖維蛋白在宰后前12 h 無降解或降解程度較小，12 h 之后降解程度增加，肉質嫩度增加，所以宰后12 h是肉質變化的關鍵點。山羊肉宰后48 h內的肌漿蛋白溶解度逐漸增大（P＜0.05）。結果說明隨著宰后成熟時間的變化，山羊肉的肌漿蛋白降解程度較大。有研究表明，動物宰后的成熟快慢，能夠通過影響肌肉的收縮、蛋白質降解度，進而改變肉品質[24]，宰后肉樣的肌漿蛋白溶解度受溫度和pH影響。

表2 宰后不同成熟時間山羊肉蛋白質溶解度的變化Table 2 Changes of proteins solubility of goat meat at different maturation time after slaughter

肌漿與肌原蛋白之間存在著聯(lián)系，肌漿鈣離子激活因子中含硫氫基團的半胱氨酸殘基易氧化，導致部分酶活性喪失，減弱肌原纖維蛋白的水解能力[25]。此外，山羊肉成熟過程中，肌原纖維蛋白降解與肉質的嫩度、持水性等也存在密切關系[26]。研究結果顯示，山羊肉的肌原纖維蛋白溶解度在宰后12 h是一個轉折點，導致該結果原因可能是在僵直期，μ-鈣蛋白酶（μ-calpain）活性較低，抑制肌原纖維蛋白聚合和降解。解僵后，肌漿網(wǎng)中釋放Ca2+活化μ-鈣蛋白酶，進而促進肌原纖維蛋白聚合和降解[27]。也可能是肌原纖維蛋白中的肌動球蛋白被解離成小分子蛋白，通過增強與水分子相互作用，影響肌原纖維蛋白的溶解度[28]。

2.5 不同成熟時間的山羊肉糖原含量變化

宰后成熟過程中山羊肉背部最長肌糖原含量的變化見圖4。從圖4中可以看出，山羊肉在宰后0、12和24 h羊肉的糖原含量顯著下降（P＜0.05），48 h下降趨勢緩慢。這可能由于宰后成熟過多消耗山羊體內的糖原，這可能由于成熟過程中的糖酵解作用，用來的維持pH和生理生化等方面的變化。

圖4 不同宰后成熟時間羊肉糖原含量的變化Fig.4 Changes of glycogen in mutton at different maturation time after slaughter

動物品種、肌纖維類型、動物營養(yǎng)狀況和宰前進食情況都影響著糖原的含量[29]，同時糖原作為糖酵解的底物，也受宰后成熟過程的影響。死后的動物肌肉中氧氣供應中斷，機體因無法適應外界條件而死亡，但此時的肌肉及各種細胞仍然進行著各種生化反應，為了保證這些生化反應的繼續(xù)進行，糖原提供生化反應所需的能量。然而隨著宰后成熟時間的延長，肌肉中的糖原含量經(jīng)過糖酵解途徑后就會變的越來越少。宰后肌肉成熟過程中，細胞以糖酵解的方式供能，糖酵解產生的乳酸和ATP降解產生的無機磷酸，會導致宰后肌肉中的H+積累、pH下降[24]。糖酵解酶主要由糖原磷酸化酶和糖原脫支酶組成[30]，肌肉中H+的含量在一定程度上影響著這兩種酶的活性，進而影響糖原的分解速率。

2.6 宰后不同成熟時間的差異蛋白質鑒定

為了展示不同成熟時間蛋白質的顯著性差異，將比較組中蛋白質以表達差異倍數(shù)（Fold change）和Pvalue（T-test）兩個因素為標準繪制火山圖，其中顯著下調的蛋白質以藍色標注（FC＜0.833且P＜0.05），顯著上調的蛋白質以紅色標注（FC＞1.2且P＜0.05），無差異的蛋白質為灰色，如圖5所示。本研究中鑒定到的差異表達蛋白在不同成熟時間段，其表達能力不同。其中在0～12 h組差異表達蛋白總共有13個，上調表達蛋白有6個，下調表達蛋白有7個。0與24 h對比，共有26個差異表達蛋白，其中11個蛋白上調表達，15個蛋白下調表達。在0與48 h相比較時，有69個差異表達蛋白，其中上調30個上調表達，39個蛋白下調表達。且隨著成熟時間的延長，參與糖酵解與三羧酸循環(huán)的差異蛋白均呈現(xiàn)上調表達，且表達量增加，這說明參與肌肉向肉轉化過程中的蛋白質主要參與能量代謝調節(jié)。在宰后48 h中，檢查出的差異表達蛋白中蛋氨酸-R-亞砜還原酶B2 （MSRB2）下調表達，該酶能催化蛋白質中甲硫氨酸亞砜的可逆氧化，還原為蛋氨酸。作為一種修復酶，它可以通過形成活性氧清除系統(tǒng)的一部分來保護蛋白質免受氧化應激，活性氧清除系統(tǒng)在細胞抗氧化防御中很重要[31]。該酶的過量表達可能為受損蛋白提供更多的修復過程，減輕活性氧(ROS)產生的氧化損傷，進而調節(jié)山羊肉的氣味[32-33]。在山羊宰后48 h內，隨著成熟時間的延長，許多參與調節(jié)肉品質的蛋白質活性有顯著變化，且蛋白質的表達量也越來越多，這些蛋白質分別影響著山羊肉的嫩度、色澤、氣味、口感等肉品質評價標準。也有研究表明，與山羊肉氣味相關的蛋白質主要參與抗氧化活性[34]、半胱氨酸和蛋氨酸代謝[35-36]和活性氧代謝[37]等過程。

圖5 不同宰后成熟時間的蛋白質動態(tài)變化Fig.5 Protein dynamics at different postmortem maturation time

3 結論

山羊在屠宰之后的48 h成熟過程中，其pH在6.5～5.57之間，宰后早期肌肉的pH較高，隨著成熟時間的延長，pH逐漸降低，結合糖原含量的降低說明了主要參與糖酵解的反應完成宰后成熟的排酸過程。結合彈性，硬度和回復力等質構特性的變化，說明宰后成熟對肉品質起到嫩度優(yōu)化的作用。滴水流失率下降的趨勢和蒸煮損失率顯著上升兩個指標，反映出宰后山羊的保水性逐漸減弱。關于蛋白質溶解性的結果表明肌漿纖維溶解度顯著升高，肌原纖維溶解度與宰后初期相差較小，說明蛋白質的穩(wěn)定性逐漸減弱。綜上所述，山羊在剛剛屠宰時的肉品質并不是最好的狀態(tài)，通過宰后成熟過程，山羊的嫩度、色澤、口感都發(fā)生在變化。成熟后期，抗氧化相關蛋白（MSRB2）顯著（P＜0.05）下調表達，進而降低山羊肉的口感。因此，在山羊宰后24～48 h期間是肉質嫩化程度較為優(yōu)越的階段，此時對山羊肉進行加工和儲存，有利于保持肉質的口感與品質。