朱自平，汪振炯，朱華

（1.廊坊市農(nóng)林科學(xué)院，河北 廊坊 065000；2.南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023；3．江蘇第二師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)化工學(xué)院江蘇省生物功能分子重點建設(shè)實驗室，江蘇 南京 211200）

益生菌是能夠通過調(diào)節(jié)腸道菌群的平衡來維持宿主消化系統(tǒng)和腸道健康的一類活的微生物的總稱[1-2]。益生菌不僅可以維持宿主腸道微生物穩(wěn)態(tài)和屏障功能，還能調(diào)節(jié)腸黏膜的免疫功能，可有效地提高腸道干擾素水平以及吞噬細胞和自然殺傷細胞的活性，已被證實是一種良好的免疫激活劑。益生元是指一些不被宿主消化吸收卻能被宿主體內(nèi)的菌群選擇性利用并轉(zhuǎn)化為有益于宿主健康的物質(zhì)[3]。常用的益生元為低聚糖類，包括低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚異麥芽糖、大豆低聚糖、菊粉等。合生元又稱合生素或共生元，是益生菌和益生元的混合制劑[4]。其中，益生元作為益生菌的營養(yǎng)和能量來源，可協(xié)同促進益生菌在腸道的定植和功效發(fā)揮?；诤仙亩鄻有怨δ?，研究已經(jīng)證實了其免疫保護增強的作用[5]，合生元增強吞噬細胞等的功效，已廣泛應(yīng)用于人類和動物保健與疾病預(yù)防治療過程[6-9]。其中，有報道表明熱滅活乳雙歧桿菌BL-99能夠增強免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA）的分泌，促使小腸黏膜上的淋巴細胞的分化及增殖[10]，并激活自然殺傷細胞（natural killer cell，NK）和巨噬細胞（macrophage），生成白介素1（interleukin1，IL-1）、白介素 6（interleukin 6，IL-6）、白介素 12（interleukin 12，IL-12）、ɑ 腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor ɑ，TNF-ɑ）及干擾素（interferon，IFN）等細胞因子，激活腸黏膜免疫系統(tǒng)，調(diào)節(jié)機體的免疫應(yīng)答，進而增強機體免疫力[11]。Finamore等[12]研究發(fā)現(xiàn)，乳桿菌與長雙歧桿菌的復(fù)合益生菌能夠通過影響初始T細胞、記憶T細胞，B細胞、調(diào)劑性T細胞和NK細胞，提高人體的免疫力，其中，兩株益生菌的混合物并沒有改變NK細胞的總數(shù)，但增加了NK細胞的活性，從而改善了先天性免疫。翟云等[13]研究發(fā)現(xiàn)，乳雙歧桿菌M8可以提高免疫抑制模型大鼠的淋巴細胞百分比、T淋巴細胞轉(zhuǎn)化增殖能力和提高血清IgA、免疫球蛋白G（immunoglobulins G，Ig G）、白介素 2（interleukin 2，IL-2）、IL-6、Ⅱ型干擾素（IFN-γ）及 TNF-ɑ 水平，從而改善細胞免疫、體液免疫及固有免疫應(yīng)答調(diào)控，增強模型大鼠的免疫功能。乳桿菌能在進入機體后激活腸黏膜免疫系統(tǒng)，起到保護機體免受感染源的侵襲、抗突變和防癌、預(yù)防糖尿病和心血管疾病的作用[14-16]。

本文使用嗜酸乳桿菌LA85和低聚果糖復(fù)配組成合生元菌劑（復(fù)合益生菌片），并飼喂健康小鼠，通過監(jiān)控小鼠的體重、免疫器官指數(shù)（脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)）、細胞免疫（淋巴細胞增殖）、體液免疫[半數(shù)溶血值（half value of hemolysin，HC50）]、巨噬細胞吞噬能力和 NK 細胞活性等指標[17-19]，以確定嗜酸乳桿菌復(fù)合益生菌片對小鼠免疫能力的影響，為進一步開發(fā)、應(yīng)用嗜酸乳桿菌合生元提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

嗜酸乳桿菌LA85：微康益生菌（蘇州）股份有限公司；低聚果糖：量子高科（中國）生物股份有限公司；生理鹽水、漢克氏液（pH7.2）、RPMI1640培養(yǎng)液、小牛血清、青鏈霉素、刀豆蛋白 A（concanavalin A，ConA）、瓊脂糖、噻唑藍（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）、磷酸鹽緩沖液、補體（豚鼠血清）、文齊氏試劑、1%NP-40裂解液、吉姆薩染液：北京索萊寶科技有限公司；SA緩沖液、乳酸鋰、碘硝基氯化四氮唑、吩嗪二甲基酯硫酸鹽、氧化型輔酶I：上海源葉生物科技有限公司；Tris-HCl、Na2CO3、冰醋酸、鹽酸、異丙醇（均為分析純）：國藥化學(xué)上海有限公司；綿羊紅細胞（sheep red blood cell，SRBC）、雞紅細胞：南京森貝伽生物技術(shù)有限公司；小鼠淋巴瘤細胞YAC-1：上海一研生物科技有限公司。

1.2 實驗動物

健康SPF級ICR小鼠[雌性，共240只，動物許可證號SCXK（京）2016-0011]：北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器

電子天平（BSA 124S型）：德國賽多利斯公司；超凈工作臺（SW-CJ-2D）：蘇州凈化設(shè)備公司；細胞培養(yǎng)箱[BPN-150CRH（UV）]：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；全波段酶標儀（Epoch型）：美國BioTek公司；臺式高速低溫冷凍離心機（TGL16M）：上海赫田科學(xué)儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 復(fù)合益生菌片制備

向經(jīng)過冷凍干燥的嗜酸乳桿菌LA85菌粉中，添加一定量低聚果糖及其他食品級輔料（玉米淀粉、麥芽糊精等），混合，利用淀粉糖漿為黏合劑，濕法制粒壓片法得到該復(fù)合益生菌片，1 g/片，每片含嗜酸乳桿菌LA85 1.0×106CFU和低聚果糖0.25 g，4℃保存。

1.4.2 實驗動物處理和分組

將240只小鼠隨機分為4組，每組60只，分別開展遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（delayed type hypersensitivity，DTH）、臟器/體重比值、半數(shù)溶血值測定和抗體生成細胞檢測實驗（實驗Ⅰ組）、巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力實驗（實驗Ⅱ組）和ConA誘導(dǎo)小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化和NK細胞活性測定實驗（實驗Ⅲ組）。各實驗組低、中、高劑量設(shè)為人體推薦食用量的5倍、10倍、30倍，每組中的60只小鼠隨機分為4小組，每小組15只，以0.167 g/kg bw（低劑量組）、0.333 g/kg bw（中劑量組）、1.000 g/kg bw（高劑量組）的劑量分別灌胃小鼠，同時設(shè)生理鹽水為陰性對照組。各劑量組及陰性對照組均按20 mL/kg bw給予灌胃（以生理鹽水稀釋后灌胃），每周根據(jù)小鼠體重增長情況調(diào)整灌胃量，30 d后，分別測定相關(guān)免疫功能指標。

1.4.3 臟器/體重比值測定

小鼠稱重，采血處死，取脾臟、胸腺等器官，稱重，計算脾臟/體重比值和胸腺/體重比值。

1.4.4 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)

采用足趾增厚法評估遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH）的程度。具體方法：小鼠給予復(fù)合益生菌片30 d，第25天，每只小鼠腹腔注射0.2 mL 2%（用生理鹽水配制，體積分數(shù)）壓積SRBC懸液，致敏后4 d，測量小鼠左后足趾厚度。隨后每只小鼠在測量部位皮下注射20 μL 20%SRBC，注射后24 h測量左后足趾厚度，同一部位測量3次取平均值，以注射前后足趾厚度的差值（足趾腫脹度）來表示DTH程度。

1.4.5 ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗（MTT法）

飼喂復(fù)合益生菌片30 d后處死小鼠，無菌取脾制備單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度到2×107個/mL，按MTT法，在570 nm處測定OD值，利用加ConA實驗孔的OD值和不加ConA實驗孔的OD值之差評估小鼠的淋巴細胞增殖能力。

1.4.6 抗體生成細胞檢測實驗（改良玻片法）

小鼠給予復(fù)合益生菌片30 d，第25天每只小鼠腹腔注射0.2 mL 2%（用生理鹽水配制，體積分數(shù)）壓積SRBC進行免疫，4 d后無菌取全脾制成單細胞懸液，以每管0.5 mL分裝小試管，向管內(nèi)再加50 μL 10%SRBC（用SA緩沖液配制，體積分數(shù)）和脾細胞懸液20 μL，迅速混勻，傾倒至已刷瓊脂糖薄層的玻片上，制平行片，待瓊脂凝固后，將玻片水平扣放在片架上，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1.5 h，然后將用SA緩沖液稀釋的補體（1∶8，體積比）放入玻片架凹槽內(nèi)，繼續(xù)孵育2.0 h，計數(shù)溶血空斑數(shù)。

1.4.7 血清溶血素溶血值的測定

小鼠給予復(fù)合益生菌片30 d，第25天每只小鼠腹腔注射0.2 mL 2%（用生理鹽水配制，體積分數(shù)）壓積SRBC進行免疫，4 d后摘除眼球取血，靜置1 h以充分析出血清，隨后離心收集血清。用SA緩沖液稀釋300倍，依次取血清稀釋液0.1 mL，10%（體積分數(shù)）SRBC 0.05 mL，補體0.1 mL，混勻后37℃保溫30 min后置于冰浴終止反應(yīng)，離心，取上清液0.05mL加文齊氏試劑0.15 mL，混勻放置10 min后用酶標儀在540 nm處測定OD樣品，空白樣品為取0.0125 mL 10%（用SA緩沖液配制，體積分數(shù)）壓積SRBC，加文齊氏試劑至0.2 mL充分混勻，放置10 min之后測定540 nm處ODSRBC，半數(shù)溶血值HC50按下式計算。

1.4.8 腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗

小鼠給予復(fù)合益生菌片30 d后，每只腹腔注射5%壓積雞紅細胞懸液1 mL。2.5 h后處死小鼠，腹腔注入2 mL生理鹽水洗滌，取腹腔液制滴片，移至37℃恒溫箱孵育30 min。孵育結(jié)束后用生理鹽水漂洗，固定細胞，染色，鏡檢計數(shù)100個巨噬細胞，吞噬率和吞噬指數(shù)按下式計算。

1.4.9 NK細胞活性測定（乳酸脫氫酶測定法）

實驗小鼠喂食復(fù)合益生菌片30 d后，處死小鼠，無菌取其脾臟，制成脾細胞懸液作為效應(yīng)細胞，裂解紅細胞并進一步調(diào)整細胞濃度為2×107個/mL。按效靶比為50∶1，將YAC-1細胞（靶細胞）和脾細胞（效應(yīng)細胞）各100 μL加入U型96孔培養(yǎng)板，靶細胞自然釋放孔加靶細胞和含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液各100 μL，靶細胞最大釋放孔加靶細胞和1%NP40各100 μL，上述均設(shè)3個平行孔，37℃，5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)4 h。隨后，離心5 min，各孔吸取100 μL上清液置于平底96孔板，隨后加入100 μL乳酸脫氫酶基質(zhì)液置于暗處反應(yīng)10 min后加入30 μL 1 mol//L的HCl溶液終止反應(yīng)，在492 nm處利用酶標儀讀取OD值，并進一步按以下公式計算NK細胞活性。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有實驗數(shù)據(jù)用平均值±標準差（X±SD）表示，采用DPS7.05軟件對各組實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，P＜0.05作為顯著性標準。

2 結(jié)果與討論

2.1 復(fù)合益生菌片對小鼠體重的影響

飼喂復(fù)合益生菌片期間，小鼠活動正常，生長發(fā)育良好，未觀察到異常體征或死亡。表1～表3為各實驗組小鼠體重變化。

表1 實驗Ⅰ組小鼠的體重變化Table 1 The weight changes of mice in experimental group I

表2 實驗Ⅱ組小鼠的體重變化Table 2 The weight changes of mice in experimental group Ⅱ

表3 實驗Ⅲ組小鼠的體重變化Table 3 The weight changes of mice in experimental group Ⅲ

由表1～表3可知，飼喂復(fù)合益生菌片30 d后，各實驗組小鼠體重增長正常，各劑量組與對照組之間無顯著性差異（P>0.05），可以初步得出長期口服該復(fù)合益生菌片對動物生長安全性良好。

2.2 復(fù)合益生菌片對小鼠臟器/體重比值的影響

小鼠的胸腺及脾臟的絕對臟器比值如表4所示。

表4 復(fù)合益生菌片對小鼠臟器/體重比值的影響Table 4 Effect of probiotic compound tablets on the ratio of organ and body weigh in the mice

飼喂復(fù)合益生菌片30 d后，其脾臟/體重比值和胸腺/體重比值與對照組間相比無明顯差異（P>0.05）。

2.3 復(fù)合益生菌片對小鼠細胞免疫功能的影響

復(fù)合益生菌片對各組小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH）的影響見圖1。

圖1 復(fù)合益生菌片對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH）的影響Fig.1 Effect of probiotic compound tablets on delayed-type hypersensitivity（DTH）in the mice

由圖1可知，與陰性對照組比較，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的復(fù)合益生菌片30 d，在低、中、高劑量組的小鼠足趾腫脹度均極顯著提高（P<0.01），表明該復(fù)合益生菌片可影響小鼠DTH。

復(fù)合益生菌片對各組小鼠淋巴細胞增殖的影響見表5。

表5 復(fù)合益生菌片對淋巴細胞增殖的影響Table 5 Effect of probiotic compound tablets on lymphocyte proliferation

由表5可知，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，與陰性對照組相比，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的復(fù)合益生菌片30 d后，其淋巴細胞增殖能力在中、高劑量組顯著增強（P<0.05），表明該復(fù)合益生菌片能在中高劑量水平上有效促進由ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細胞增殖。T淋巴細胞和B淋巴細胞的增殖是機體細胞免疫的直接反饋，可以判定細胞免疫功能陽性[20]。

2.4 復(fù)合益生菌片對體液免疫的影響

復(fù)合益生菌片對抗體生成細胞數(shù)和小鼠半數(shù)溶血值的影響見圖2。

圖2 復(fù)合益生菌片對抗體生成細胞數(shù)和小鼠半數(shù)溶血值的影響Fig.2 Effect of probiotic compound tablets on antibody-producing cells and half hemolysin value in mice

由圖2a可知，喂食30 d后，中、低劑量復(fù)合益生菌片均可極顯著提高小鼠抗體細胞生成數(shù)（P<0.01）。進一步由圖2b可知，喂食低劑量和中劑量復(fù)合益生菌片可極顯著提高小鼠半數(shù)溶血值（HC50）（P<0.01），而喂食高劑量復(fù)合益生菌片可顯著提高HC50值（P<0.05）。因此可以證明復(fù)合益生菌片可有效改善小鼠體液免疫功能。

2.5 復(fù)合益生菌片對小鼠單核-巨噬細胞吞噬功能的影響

飼喂復(fù)合益生菌片對實驗小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力的影響見表6。

表6 復(fù)合益生菌片對小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力的影響Table 6 Effect of probiotic compound tablets on mice peritoneal macrophages phagocytosis of chicken red blood cells

由表6可知，與陰性對照組相比，中、高劑量組復(fù)合益生菌片對吞噬雞紅細胞能力有顯著性差異，且高劑量組的吞噬率和吞噬指數(shù)較陰性對照組有極顯著提高（P<0.01），表明飼喂復(fù)合益生菌片有助于提高機體的非特異性免疫功能。

2.6 復(fù)合益生菌片對小鼠NK細胞活性的影響

飼喂復(fù)合益生菌片對小鼠NK細胞活性的影響見圖3。

圖3 復(fù)合益生菌片對小鼠NK細胞活性的影響Fig.3 Effect of probiotic compound tablets on the activity of NK in mice

由圖3可知，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的復(fù)合益生菌片30 d后發(fā)現(xiàn)，各處理劑量的復(fù)合益生菌片均可極顯著提高NK細胞的活性（P<0.01）。結(jié)合其對小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力的實驗結(jié)果可知飼喂復(fù)合益生菌片可有效提高單核-巨噬細胞吞噬功能和NK細胞活性，從而提高機體的非特異性免疫功能。

3 結(jié)論

飼喂以嗜酸乳桿菌LA85和低聚果糖等復(fù)配壓片所制得的復(fù)合益生菌片對小鼠體重增長無影響。喂食各劑量組復(fù)合益生菌均可顯著提高小鼠足趾腫脹度（DTH）（P<0.01）；在中、高劑量水平上有效促進小鼠淋巴細胞增殖（P<0.05），低、中劑量水平上可極顯著提高小鼠抗體生成細胞數(shù)（P<0.01）和 HC50值（P<0.01），高劑量水平則可提高HC50值（P<0.05），證明可有效改善小鼠細胞免疫能力和體液免疫能力。此外，飼喂復(fù)合益生菌片可有效提高單核-巨噬細胞吞噬功能和NK細胞活性，因此，該復(fù)合益生菌片對小鼠細胞免疫、體液免疫、非特異免疫功能均具有一定的增強作用，證明飼喂復(fù)合益生菌片有助于全面調(diào)動機體免疫系統(tǒng)，阻止外來物質(zhì)的侵入，從而增強機體免疫力。綜上所述，嗜酸乳桿菌LA85復(fù)合益生菌片具備較好地增強小鼠機體免疫的能力，且安全性良好，應(yīng)用前景廣闊。