蔣 雨， 兌靖冬， 范志平

（ 宜賓市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心， 四川 宜賓 644000）

孔雀石綠是一種合成的三苯基甲烷類工業(yè)染料，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中用作殺蟲劑和預(yù)防水霉劑[1-2]。 由于孔雀石綠殘留時(shí)間長(zhǎng)， 并有致突變、 致畸和致癌的危險(xiǎn)性[3-5]， 因此中國(guó)、 美國(guó)、 加拿大等許多國(guó)家均禁止將其作為人類食用魚的獸藥使用[6]。 2002 年9 月實(shí)施的農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY 5071—2002 中明確規(guī)定孔雀石綠為禁用漁藥[7]。 《 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250 號(hào)》明確規(guī)定， 孔雀石綠屬于食品動(dòng)物中禁止使用的藥品及其他化合物[8]。 在近年來區(qū)縣市場(chǎng)監(jiān)管部門的委托送檢中， 陸續(xù)在苦丁茶中檢出了孔雀石綠及其代謝物成分。 但是， 國(guó)家現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)中涉及孔雀石綠項(xiàng)目檢測(cè)的品種主要有養(yǎng)殖水體、 飼料和水產(chǎn)品； 在已發(fā)表的論文中也僅有水體、 水產(chǎn)品及淀粉制品中孔雀石綠殘留量的檢測(cè)， 沒有苦丁茶中孔雀石綠及其代謝物的測(cè)定方法。 因此， 建立苦丁茶中孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物的檢驗(yàn)方法很有必要。

1 材料與方法

1.1 耗材與試劑

中性氧化鋁柱（1 g/3 mL） ， 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司提供； 乙腈（色譜純）， 山東禹王實(shí)業(yè)有限公司提供； 乙酸銨（ 分析純） ； 孔雀石綠-D5 對(duì)照品 （ 232342， 100%） ； 隱 色 孔 雀 石 綠 對(duì) 照 品（ 00209， 97.0%） ； 隱 色 孔 雀 石 綠-D6 對(duì) 照 品（212023， 100%）； 苦丁茶樣品為抽檢樣品。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1200 HPLC-6410 Triple Quad LC/MS，Agilent 公司產(chǎn)品； CP225D 型萬分之一電子天平，Sartorius 公司產(chǎn)品； ULUP-Ⅱ-10T 型超純水機(jī)， 成都超純科技有限公司產(chǎn)品； KQ-700DE 型數(shù)控超聲儀。

1.2.1 色譜條件

Agilent ZORBAX SB-C18（ 2.1 mm×30 mm，3.5 μm） 色譜 柱， 流動(dòng)相為乙腈（ 0.1%甲酸）-5 mmol/L 乙酸銨溶液（ pH 值4.5） （ 70∶30） ， 流速為1.0 mL/min， 進(jìn)樣量為10 μL， 柱溫為35 ℃，采集時(shí)間5 min 。

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子源， 采用正離子模式監(jiān)測(cè)，霧 化 氣 體， N2； 霧 化 器 壓 力 為30 Psi， 干 燥 氣 體：N2， 溫度為350 ℃， 流速為9 L/min； 毛細(xì)管電壓為4 000 V， 采用多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）。

1.3 方法

樣品處理方法： 苦丁茶樣品粉碎， 混勻， 稱取約1 g 粉碎樣品于25 mL 容量瓶中， 精密加入400 L 混合內(nèi)標(biāo)工作溶液， 加入適量乙腈， 超聲提取20 min后， 用乙腈定容至25 mL， 搖勻， 轉(zhuǎn)移至50 mL 離心管， 以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心5 min， 備用。 移取5.00 mL 上清液至已活化的中性氧化鋁上， 用試管接收流出液， 4 mL 乙腈洗滌中性氧化鋁柱， 收集全部流出液， 45 ℃下氮吹至約1 mL， 殘液用乙腈定容至1.0 mL， 超聲處理5 min， 加入1.0 mL 5 mmol/L 乙酸銨溶液（pH 值4.5） ， 超聲溶解1 min， 樣液經(jīng)0.22 μm濾膜后， 立即用HPLC-MS 測(cè)定。

對(duì)照品溶液的制備方法： 精密稱取孔雀石綠、孔雀石綠-D5、 隱色孔雀石綠、 隱色孔雀石綠-D6各約10 mg， 分別置100 mL 容量瓶中， 用乙腈溶解并定容至100 mL， 配制成質(zhì)量濃度分別為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液（-18 ℃下避光保存） 。 混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液： 精密吸取孔雀石綠、 隱色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)貯備液各0.1 mL 于同一100 mL 容量瓶中， 用乙腈定容至刻度， 配制成質(zhì)量濃度約為0.1 g/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。 混合內(nèi)標(biāo)工作溶液： 精密吸取2 種氘代內(nèi)標(biāo)貯備液各0.1 mL 置于同一100 mL 容量瓶中，用乙腈定容至刻度， 配制成濃度約為0.1 g/mL 的混合內(nèi)標(biāo)工作溶液。 取混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液與混合內(nèi)標(biāo)工作溶液適量， 用乙腈+5 mmol/L 乙酸銨溶液（1+1）稀釋成質(zhì)量濃度分別為1， 2， 5， 10， 20， 50 μg/L，內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為4 μg/L 的對(duì)照品溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性范圍

取質(zhì)量濃度為1， 2， 5， 10， 20， 50 μg/L， 內(nèi)標(biāo)濃度為4 μg/L 的對(duì)照品溶液10 μL， 在“ 1.2.1”項(xiàng)下的色譜質(zhì)譜條件下進(jìn)樣， 記錄定量子離子峰面積。 以待測(cè)組分定量子離子峰面積與內(nèi)標(biāo)定量子離子峰面積的比值（Y） 對(duì)待測(cè)組分對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度（X） 進(jìn)行線性回歸， 得到回歸方程、 相關(guān)系數(shù)和線性范圍。

孔雀石綠Y=0.305 8X+0.097 1（R=0.999 8）

隱色孔雀石綠Y=0.971 7X-0.907 2（R=0.999 5）

結(jié)果表明， 孔雀石綠1.088～54.400 μg/L， 隱色孔雀石綠1.056～52.800 μg/L 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)， 組分定量子離子峰面積與內(nèi)標(biāo)定量子離子峰面積比值的線性關(guān)系良好。

2.2 回收率的測(cè)定

取均質(zhì)空白茶葉試樣1 g， 置于25 mL 量瓶中，分別添加混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液500 μL（ 即添加量約為50 μg/kg）， 按“ 1.3” 項(xiàng)下的方法制備并測(cè)定含量， 計(jì)算回收率， 結(jié)果2 組分的平均回收率分別為89.16%，94.44%； RSD 分別為9.41%， 3.39%。

2.3 檢出限、 定量限的測(cè)定

在空白茶葉樣品中添加孔雀石綠和隱色孔雀石綠混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液， 以信噪比（ S/N） 等于3 為檢出限標(biāo)準(zhǔn)； 以信噪比（S/N） 等于10 為定量限標(biāo)準(zhǔn)， 測(cè)定2 個(gè)待測(cè)組分的方法檢出限和定量限。 孔雀石綠和隱色孔雀石綠的檢出限分別為0.40 μg/kg與2.5 μg/kg； 孔雀石綠和隱色孔雀石綠的定量限分別為1.3 μg/kg 與8.3 μg/kg。

孔雀石綠、 隱色孔雀石綠的總離子流圖見圖1，孔雀石綠、 隱色孔雀石綠、 孔雀石綠-D5、 隱色孔雀石綠-D6 的提取離子流圖見圖2。

圖1 孔雀石綠、 隱色孔雀石綠的總離子流圖

圖2 孔雀石綠、 隱色孔雀石綠、 孔雀石綠-D5、 隱色孔雀石綠-D6 的提取離子流圖

2.4 樣品測(cè)定

對(duì)抽檢的5 份樣品進(jìn)行了檢測(cè)， 總含量最高為5.87×103μg/kg， 最低為20.9 μg/kg。

樣品中孔雀石綠和隱色孔雀石綠檢測(cè)結(jié)果見表1。

表1 樣品中孔雀石綠和隱色孔雀石綠檢測(cè)結(jié)果/μg·kg-1

3 結(jié)論

孔雀石綠在1.088～54.400 μg/L， 隱色孔雀石綠1.056～52.800 μg/L 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)， 線性關(guān)系良好（R＞0.999） 。 孔雀石綠和隱色孔雀石綠的檢出限分別為0.40 μg/kg 與2.50 μg/kg， 平均回收率為91.82%～106.70%， RSD≤12.6%。 用該方法檢測(cè)抽檢樣品，5 份陽性樣品總含量最高達(dá)5.87×103μg/kg。 從檢測(cè)結(jié)果來看， 市場(chǎng)上確有苦丁茶中非法添加孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物的情況， 加強(qiáng)苦丁茶中孔雀石綠檢測(cè)方法建立， 對(duì)其進(jìn)行有效檢測(cè)， 對(duì)于保證食品安全、促進(jìn)國(guó)民健康及社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重大意義。