李秀霞，劉孝芳，劉宏影，勵建榮*，謝 晶，沈 琳

（1 渤海大學食品科學與工程學院 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧錦州1 21013 2 上海海洋大學食品學院 上海201306 3 大連東霖食品股份有限公司 遼寧大連 116100）

海鱸魚（Lateolabrax japonicus），隸屬硬骨魚綱，鱸形目，鱸科，主要分布于我國渤海、黃海等沿海地區(qū)。海鱸魚肉嫩味鮮，不僅富含蛋白質(zhì)，還含有礦物質(zhì)、維生素、必需氨基酸等多種營養(yǎng)物質(zhì)，營養(yǎng)價值高[1-3]。據(jù)《2019 中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒》數(shù)據(jù)統(tǒng)計[4]，2018年海水養(yǎng)殖魚類中鱸魚產(chǎn)量為16.66萬t，位居海水魚產(chǎn)量第一位。由于營養(yǎng)豐富，含水量和酶活性高，因此魚類容易變質(zhì)。為了延長魚類的保質(zhì)期，有很多方法應用于食品的儲存和運輸，其中冷凍和凍藏保鮮在保持極易腐敗水產(chǎn)品的質(zhì)量上是最有效和應用最廣泛的方法[5]。如今國內(nèi)外對水產(chǎn)品凍藏保鮮的研究主要以感官品質(zhì)、汁液流失、質(zhì)構、菌落總數(shù)、TVB-N 值、TBA 值、pH 值等指標來探索凍藏期間下水產(chǎn)品品質(zhì)的改變[6]。冷凍食品的質(zhì)量在很大程度上受冰晶大小及其在肉中的位置影響[7]，表現(xiàn)在食品理化性質(zhì)、蛋白質(zhì)特性、微觀結構以及水分分布等的變化，冷凍速度對冰晶大小和均勻度也有很大影響。

目前，鼓風凍結技術是我國使用的主要食品速凍技術。其原理是以空氣作為冷凍介質(zhì)，高速低溫循環(huán)氣流，讓低溫氣流與食品之間進行快速強制對流交換熱量，將食品中熱量帶走，提升對流換熱系數(shù)，從而提高冷凍速度，縮短了凍結時間，最終使食品快速冷卻。鼓風凍結所使用的空氣資源豐富，沒有任何毒副作用，然而，空氣的導熱性能差，凍結時間比較長。程偉偉等[8]研究經(jīng)鼓風冷凍和浸漬冷凍處理的調(diào)理豬肉貯藏期間的品質(zhì)變化，發(fā)現(xiàn)采用浸漬于-18 ℃的冷凍液的凍結方式能夠更好、更長時間貯藏調(diào)理豬肉。超聲波輔助凍結技術是在食品凍結過程中利用超聲波加速冰晶形成的一種新型凍結技術，具有對細胞損傷小，凍結速度快的優(yōu)點。超聲波作用過程中產(chǎn)生熱效應、機械效應、空化效應，這3 個因素對縮短凍結時間有重要影響，其中空化效應為主要因素。Cheng 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，特定的超聲功率水平能明顯縮短冷凍時間，這可能是由于超聲輔助冷凍產(chǎn)生許多空化氣泡，一旦氣泡達到臨界原子核的尺寸，它們就可用作晶核。Hu 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，空化氣泡的運動會產(chǎn)生微流，這會增強熱量的傳遞并引起冰的成核作用。此外，Zhang 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，超聲波在液體介質(zhì)中移動并引起強烈的湍流，從而引起冰核化并提高傳熱效率[12]。采用超聲波輔助凍結不僅可以達到良好的凍結效果，而且超聲波技術本身對肉品的品質(zhì)具有多方面的改良作用[13]。

本試驗中以海鱸魚為原料，分析不同冷凍方式對海鱸魚凍結速率和凍結曲線的影響，并系統(tǒng)研究不同冷凍方式處理后凍藏期間魚肉溶解度、總巰基含量及DSC 的變化。觀察冰晶形態(tài)和肌原纖維蛋白結構，預測海鱸魚魚肉品質(zhì)變化，為超聲波技術在冷凍水產(chǎn)品工業(yè)的應用提供技術依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

海鱸魚，平均體長（35±5）cm，體重（1±0.1）kg，遼寧錦州水產(chǎn)批發(fā)市場。30 min 內(nèi)保持鮮活運至實驗室。尿素、十二烷基磺酸鈉（SDS）、鹽酸、Tris、氯化鈉、5，5'-二硫代雙 （2-硝基苯甲酸）（DTNB）、乙二胺四乙酸（EDTA）、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、無水硫酸銅、四水合酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、牛血清蛋白（BSA）等均為分析純級，國藥集團化學試劑有限公司。

低溫速凍試驗箱（ZT-CYH-80S 型），東莞市正臺測試儀器有限公司；超聲波輔助速凍冰柜（XO-120L-II 型），南京先歐儀器制造有限公司；冰凍切片機（CM-1850 型），德國萊卡公司；場發(fā)射掃描電子顯微鏡（S-4800 型），日本日立公司；正置顯微鏡（Nikon80i 型），日本尼康公司；差示量熱掃描儀（Netzsch 204 F1 型），德國耐馳公司。

1.2 樣品處理

取鮮活海鱸魚冰浴下敲擊頭部致死，流水洗凈，瀝干水分，然后去皮、剖片裝入聚乙烯自封袋中。將其隨機分為4 組，分別采用-20，-40 ℃超聲波輔助冷凍（320 W）及-20，-40 ℃低溫速凍處理，待魚肉中心溫度達-18 ℃時停止凍結，取出，迅速轉(zhuǎn)移至（-18±2）℃環(huán)境中貯藏，待用。

1.3 主要指標測定方法

1.3.1 凍結速率和凍結曲線的測定 在每組樣品中隨機抽選3 個樣品，將溫度記錄儀傳感探頭插入海鱸魚魚片的中心位置，以1 min 為間隔記錄1次溫度，以海鱸魚魚片放入超聲波輔助速凍冰柜和低溫速凍試驗箱中為起始凍結時間點，待樣品中心溫度達到-18 ℃時凍結完成。記錄海鱸魚魚片中心溫度隨凍結時間的變化情況。以溫度為縱坐標，凍結時間為橫坐標繪制不同凍結方式凍結海鱸魚片的溫度變化曲線圖。

國際制冷協(xié)會提出的凍結速率（V）計算方法：

式中，δ0——食品表面與中心溫度點間的最短距離（cm）；τ0——食品表面達到0 ℃時食品中心溫度降到比初始凍結點低10 ℃所需時間（h）。

1.3.2 冰晶形態(tài)觀察 冷凍切片制備參照宋敏[14]的方法。微觀圖片參考向迎春等[15]的方法，于100倍顯微鏡觀察獲得。應用圖像分析軟件Image pro plus 6.0 分析橫截面面積A、當量直徑D、圓度R 和拉伸度。

1.3.3 蛋白質(zhì)提取與分析

1.3.3.1 肌原纖維蛋白的提取 參照Cao 等[16]方法提取肌原纖維蛋白。

1.3.3.2 蛋白含量的測定 選擇牛血清蛋白為標準品制作標準曲線，使用雙縮脲法測定蛋白含量。移取1 mL 肌原纖維蛋白溶液加入4 mL 雙縮脲試劑，混勻，置室溫避光反應20 min，在波長540 nm處測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算蛋白質(zhì)含量。每個試驗組重復3 次，數(shù)據(jù)取平均值。

1.3.3.3 溶解度的測定 把所得肌原纖維蛋白溶液稀釋到質(zhì)量濃度5 mg/mL，取5 mL 稀釋液，4℃，10 000 r/min 離心10 min，取1 mL 上清液，加入4 mL 雙縮脲試劑混合，均勻，室溫避光放置30 min，在波長540 nm 處測定吸光度，重復3 次。1 mL 去離子水和4 mL 雙縮脲試劑的混勻液為空白對照。溶解度計算公式：

1.3.3.4 總巰基的測定 使用DTNB 法測定蛋白質(zhì)的總巰基含量[17]。4 組樣品的MFP 用PBS （20 mmol/L，pH 6.7，含0.6 mol/L NaCI）稀釋至質(zhì)量濃度為4 mg/mL。分別取1 mL 4 mg/mL MFP 溶于9 mL 緩沖液【3 mmol/L EDTA，1%SDS，8 mol/L 尿素和0.2 mol/L Tris-HCl （pH 8.0）】中，充分混勻后取4 mL 置0.5 mL 緩沖液 【10 mmol/L DTNB，0.2 mol/L Tris-HCl （pH 8.0）】中，將反應后的混合液40 ℃保溫25 min，在波長412 nm 處測定吸光度。樣品中肌原纖維蛋白總巰基含量采用公式（3）計算：

式中，A——吸光度；D——稀釋倍數(shù)；ε——分子吸光系數(shù)，13 600 L/（mol·cm）；m——肌原纖維蛋白質(zhì)量（g）。

1.3.3.5 DSC 掃描分析 應用差式掃描量熱儀（DSC）檢測。稱取5～8 mg 解凍后的海鱸魚樣品，將其密封在標準DSC 鋁盤中，把空盤當作對照。在樣品爐中的熱電偶上按對應的位置放入樣品盤和對照盤，以5 ℃/min 的加熱速率將溫度從20 ℃加熱到90 ℃，記錄并計算吸熱曲線上蛋白變性的起始溫度、峰值溫度和終止溫度。

1.4 統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 不同冷凍方式的海鱸魚冰晶形態(tài)變化

2.1.1 凍結曲線和凍結速率的變化 圖1反映4種凍結方式處理的海鱸魚魚片中心溫度隨凍結時間由8 ℃到-18 ℃的溫度變化曲線。將不同冷凍方式處理的海鱸魚冷凍曲線標記為3 個階段：預冷階段（4～-1 ℃）、相變階段（-1～-5 ℃）、凍結降溫階段（-5～-18 ℃）?？梢钥闯觯煌瑑鼋Y方式處理的樣品凍結曲線存在明顯的差異，其中-20 ℃低溫速凍的凍結曲線呈下降、平緩、下降，趨于平緩的趨勢，通過最大冰晶生成帶的時間和凍結時間最長。而-20 ℃超聲輔助冷凍、-40 ℃低溫速凍和-40 ℃超聲輔助冷凍的速率相對較快，凍結曲線呈下降、平緩、下降的走勢。其中-40 ℃超聲輔助冷凍通過最大冰晶生成帶的時間和凍結時間明顯短于其它3 個凍結組，說明-40 ℃超聲輔助冷凍凍結速率最快，可大大縮短凍結時間。超聲輔助冷凍相比于低溫速凍具有更快的凍結速率。這是因為超聲波的空化效應和機械效應加速介質(zhì)的流動，提升傳熱傳質(zhì)的效率，縮短凍結時間，從而極大地提高了海鱸魚魚片的凍結速率。

圖1 不同凍結方式冷凍的海鱸魚魚片中心溫度的變化Fig.1 Changes in center temperature in Lateolabrax japonicus fillets with different freezing methods

凍結速率指食品物料內(nèi)某點溫度下降的速率[18]。表1反映4 種凍結方式處理的海鱸魚魚片凍結速率。4 個處理組凍結速率排序為：-40 ℃超聲輔助冷凍＞-20 ℃超聲輔助冷凍＞-40 ℃低溫速凍＞-20 ℃低溫速凍，各組間差異顯著（P＜0.05）。對比圖1可以看出，當樣品凍結速率越大時，通過最大冰晶生成帶的時間越短。-20 ℃低溫速凍屬于慢速凍結（凍結速率＜1 cm/h，通過最大冰晶生成帶的時間大于30 min）；-40 ℃超聲輔助冷凍、-20℃超聲輔助冷凍及-40 ℃低溫速凍屬于快速凍結（通過最大冰晶生成帶的時間少于30 min）[19]。

表1 不同凍結方式冷凍的海鱸魚魚片的凍結速率（n=3）Table 1 Freezing rates under different freezing methods of Lateolabrax japonicus fillets （n=3）

2.1.2 冰晶圖像觀測 圖2為不同凍結方式處理的海鱸魚魚片中冰結晶的顯微鏡圖片?？梢钥闯?，4 種凍結方式處理的海鱸魚魚片冰晶大小和形狀都存在明顯的差異。-40 ℃超聲輔助冷凍海鱸魚魚片冰晶最小，均勻分布且規(guī)則，肌纖維相對較完整且細胞間隙最?。?20 ℃超聲輔助冷凍的海鱸魚魚片冰晶較小，分布相對均勻；-40 ℃低溫速凍的海鱸魚魚片肌纖維較為完整，形狀規(guī)則，而冰晶較大；-20 ℃低溫速凍方式處理的海鱸魚魚片生成許多大且不規(guī)則的胞外冰晶，對肌肉組織造成損傷，這樣會影響長期冷凍貯藏的魚的品質(zhì)。在超聲輔助冷凍樣品中觀察到比低溫速凍樣品更小且均勻冰晶，這可用超聲波產(chǎn)生的空化效應來解釋，空化效應可用作誘導冰晶成核，空化氣泡破裂將預先存在的冰晶破碎成較小的尺寸，再次充當初級核。此外，空化氣泡運動產(chǎn)生的微流增強了熱量和質(zhì)量的傳遞。所有這些都可能加快了凍結速率，并促進了小而均勻的冰晶形成[20]。

圖2 新鮮和冷凍海鱸魚魚片組織的顯微圖片（放大100x）Fig.2 Micrographs of unfrozen and frozen Lateolabrax japonicus fillets tissues （magnification is 100x）

2.1.3 冰晶形態(tài)分析 如表2所示，-20 ℃低溫速凍處理組的冰結晶的直徑和橫截面積最大，冰晶不規(guī)則連接在一起。-20 ℃低溫速凍屬于慢速凍結，在慢速凍結過程中冰晶的數(shù)量增加較慢，使很少活躍的晶核形成大的胞外冰晶。這會導致細胞膜受到破壞以及細胞組織超微結構紊亂，提高了凍藏和解凍后氧化速率及酶的活性[15]，使食品結構發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的損害。對于-20 ℃超聲輔助冷凍和-40 ℃低溫速凍的樣品，產(chǎn)生的胞內(nèi)冰晶和胞外冰晶相對-20 ℃低溫速凍處理組更小，其直徑和截面積也比-20 ℃低溫速凍處理組小。這是因為冷凍速率提高，成核速率提高，生成更多的細小冰晶；同時也存在較大的胞外冰晶，使肌肉組織出現(xiàn)明顯間隙，也會破壞食品結構。而-40 ℃超聲輔助冷凍產(chǎn)生大量的胞內(nèi)冰晶，細小且分布均勻，組織之間空隙更小，其冰晶直徑和橫截面積最小，同時它的圓度和拉伸度皆最小，說明-40 ℃超聲輔助冷凍產(chǎn)生的冰晶是最圓、最規(guī)則的。在凍結過程中超聲波可以降低初次成核的過冷度，促進二次成核和抑制冰晶的生長[21]，更快的凍結速率使細胞內(nèi)剩余的水分在擴散出細胞前就凍結成冰，以及初期開始時冰晶的數(shù)量增加較快，成核的頻率提高，活躍的成核位點增加，使細小冰晶增多[22]。

表2 海鱸魚魚片冰晶的顯微分析Table 2 Microscopic analysis of the ice crystals in different frozen Lateolabrax japonicus fillets

2.2 不同處理方式的海鱸魚蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和結構的變化

2.2.1 凍藏過程中海鱸魚蛋白質(zhì)溶解度的變化蛋白質(zhì)溶解度是蛋白質(zhì)變性及肌肉品質(zhì)改變的一項重要指標。由圖3可看出，每個處理組的溶解度隨貯藏時間的延長而下降。其中，-20 ℃低溫速凍處理組樣品的溶解度最低，可能是由于蛋白質(zhì)的空間結構在冷凍和解凍過程中發(fā)生改變，使分子內(nèi)部的疏水基團結構松散而大量暴露，蛋白質(zhì)與水分子間的作用力減輕，最終降低了蛋白質(zhì)的溶解度。除此之外，肌原纖維蛋白可與脂肪的氧化產(chǎn)物如丙二酸等相互作用使蛋白質(zhì)變性，形成復合物，降低蛋白溶解性[23]。-20 ℃超聲輔助冷凍處理也表現(xiàn)出較低的溶解度，可能是因為超聲輔助冷凍過程中受超聲波較長時間的機械和空化效應的作用，蛋白質(zhì)變性，溶解性降低[24]。與其它3 組相比，-40 ℃超聲輔助冷凍的樣品溶解度最高，可能是因減少了由冰晶引起的蛋白質(zhì)變性和肌肉細胞器、細胞膜的機械損傷，有效降低了海鱸魚肌原纖維蛋白的氧化程度。

圖3 凍藏期間海鱸魚肌原纖維蛋白溶解度的變化Fig.3 Changes of the solubility of myofibrillar protein during frozen storage

2.2.2 凍藏過程中海鱸魚總巰基的變化 大量研究發(fā)現(xiàn)，總巰基含量的變化能夠反映蛋白質(zhì)變性的程度，這是因為凍藏過程中蛋白質(zhì)的部分巰基易被氧化形成二硫鍵，不僅使總巰基含量下降，而且改變了蛋白質(zhì)的空間結構[25]。由圖4可知，海鱸魚肌原纖維蛋白樣品的總巰基隨凍藏時間的延長含量明顯降低，且呈先快后慢的下降趨勢。同時，相對于其它3 組樣品-40 ℃超聲輔助冷凍的樣品總巰基含量一直保持最高，說明-40 ℃超聲輔助冷凍可以減少蛋白質(zhì)在冷凍過程中的氧化程度。海鱸魚的總巰基含量在前4 周有較快的下降速率。這種現(xiàn)象是由于肌原纖維蛋白中的一些暴露在蛋白質(zhì)表面的巰基，在凍藏初期蛋白質(zhì)結構沒有發(fā)生顯著變化時就被氧化成二硫鍵[26]。在凍藏過程中檢測到的巰基數(shù)量減少也可能因蛋白質(zhì)的聚集[27]。

圖4 凍藏期間海鱸魚肌原纖維蛋白總巰基含量的變化Fig.4 Changes of total sulfhydryl content of myofibrillar protein during frozen storage

2.2.3 不同處理方式冷凍魚樣品的DSC 掃描分析 冷凍魚樣品的DSC 結果如圖5和表3所示。在溫度45.25～54.45 ℃（Tmax1）、56.93～59.73 ℃（Tmax2）和68.24～76.07 ℃（Tmax3）范圍有3 個特征峰，分別代表肌球蛋白頭部引起的熱流變化，肌球蛋白尾部和肌漿蛋白引起的熱流變化以及肌動蛋白引起的熱流峰。魚肉的最高轉(zhuǎn)變溫度（Tmax）隨冷凍儲存時間的延長而降到更低的溫度。新鮮的魚肉樣品Tmax1在0 d 時為54.76 ℃，Tmax2為59.62 ℃，Tmax3為76.53 ℃。第12 周時4 組處理組樣品的Tmax1、Tmax2及Tmax3均下降。-40 ℃超聲輔助冷凍樣品的Tmax1、Tmax2及Tmax3顯著高于其它3 組樣品，而-20 ℃低溫速凍樣品在冷凍儲存中具有最低的Tmax1和Tmax3（P＜0.05）。這說明從Tmax開始，整個冷凍存儲期間，-40 ℃超聲輔助冷凍樣品具有比其它3 組樣品更高的熱穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)變性包括分子內(nèi)鍵（主要的非共價鍵和少數(shù)共價鍵）的解離，這是一個吸熱過程，會產(chǎn)生吸熱峰。轉(zhuǎn)變溫度顯著下降表明，凍藏過程中，肌肉蛋白的熱穩(wěn)定性降低了，這可能是肌動蛋白變性和肌球蛋白中的亞基解離所致[28]。同樣，凍藏過程中，肌球蛋白的變性焓值△H及肌動蛋白變性也顯著降低（P＜0.05）。-40 ℃超聲輔助冷凍樣品的△H1和△H3均高于另3 組樣品，而-20 ℃低溫速凍樣品的△H1和△H3均顯著低于其它3 組（P＜0.05）。這說明-40℃超聲輔助冷凍樣品的變性程度較低，而-20 ℃低溫速凍樣品的變性程度最高。通常，△H的減少可能與蛋白質(zhì)變性引起的蛋白質(zhì)聚集增加和氫鍵減弱有關。冷凍和冷凍儲存過程中冰晶的形成和尺寸增加會導致蛋白質(zhì)變性和細胞破裂。在冷凍儲存過程中-40 ℃超聲輔助冷凍產(chǎn)生小而均勻的冰晶，破壞蛋白質(zhì)結構，蛋白質(zhì)變性程度下降。

圖5 凍藏期間海鱸魚魚肉DSC 掃描曲線的變化Fig.5 Changes of on DSC scanning curve of Lateolabrax japonicus muscle during frozen storage

表3 凍藏期間海鱸魚肉相變溫度（Tm）和熱焓值的變化Table 3 Changes of enthalpy value and transition temperature （Tm） of Lateolabrax japonicus muscle during frozen storage

3 結論

以海鱸魚為對象，研究了-20，-40 ℃超聲波輔助冷凍與-20，-40 ℃低溫速凍對海鱸魚冰晶生成情況，魚肉肌原纖維蛋白理化特性及結構的影響。結果表明，兩個超聲波輔助冷凍處理組有較高的凍結速率，通過冰晶最大生成帶的速度更快，凍結時間相對較短；-40 ℃超聲輔助冷凍與其它3 種凍結方式相比，凍結速率快，胞內(nèi)冰晶更小、更規(guī)則。-40 ℃超聲輔助冷凍的樣品與其它3 組相比，溶解度、總巰基含量最高，能夠有效降低肌原纖維蛋白的氧化程度。DSC 結果表示，-40 ℃超聲輔助冷凍方法可提高魚肉蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性，減少蛋白質(zhì)在冷凍過程中的氧化程度，蛋白質(zhì)變性和結構的破壞程度最低，對魚肉品質(zhì)保藏有較好的效果。