尹彩星，劉 展，司海超，張新科，秦洪猛，杜守峰，李東峰，古婷婷，馮 丹，張蓉蓉，司小萌*

(1 南陽市中心醫(yī)院，南陽 473000；2 三亞市中醫(yī)院，三亞 572000)

先心病患兒體外循環(huán)(cardiopulmonary bypass，CPB)術(shù)后急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)發(fā)病率達(dá)10% ～45%[1]，主要與CPB誘發(fā)的全身炎性反應(yīng)、腎小管細(xì)胞凋亡等有關(guān)[2-4]。右美托咪定是一種α2腎上腺素能受體激動劑，可降低患者CPB術(shù)后AKI的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[5-7]，但具體機(jī)制尚不明確。Toll樣受體(Toll like receptor,TLR)家族中部分成員可通過多種途徑介導(dǎo)機(jī)體的炎性反應(yīng)。羅琳等[8]發(fā)現(xiàn)，右美托咪定通過抑制患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中Toll樣受體2(Toll like receptor 2，TLR2)和Toll樣受體4(Toll like receptor 4，TLR4)的表達(dá)，從而減輕體外循環(huán)術(shù)后的炎性反應(yīng)。相關(guān)研究也證實(shí)[9-10]，右美托咪定可降低患者PBMC中TLR2和TLR4的表達(dá)水平。有研究發(fā)現(xiàn)[11]，TLR3及其下游信號通路中的炎癥介質(zhì)參與了AKI的發(fā)病。鑒于目前關(guān)于右美托咪定和TLR3的相關(guān)性研究報(bào)道較少，本研究探討了右美托咪定對先心病患兒CPB術(shù)后的腎臟保護(hù)作用，以期為臨床研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年6月～2019年6月于本院行CPB手術(shù)的先心病患兒168例作為研究對象，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組和觀察組，每組84例。其中，男性患兒78例，女性患兒90例；年齡2～6歲，平均年齡(4.52±0.62)歲；先天性房間隔缺損40例，室間隔缺損128例。兩組患兒一般資料比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，具有可比性(見表1)。所有患兒監(jiān)護(hù)人均知情同意并簽署知情同意協(xié)議書。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)(倫理批件號：YXLL2017-0311)。

表1 兩組患兒一般資料比較

(續(xù)表)

納入標(biāo)準(zhǔn)：① 兒童先心病診斷明確，符合《兒童常見先天性心臟病介入治療專家共識》標(biāo)準(zhǔn)[12]，在本院擇期行房間隔缺損或室間隔缺損修補(bǔ)，麻醉學(xué)ASA分級為Ⅰ～Ⅱ級，且所有患兒均在體外循環(huán)下完成心臟根治手術(shù)。② 臨床資料完整者。

排除標(biāo)準(zhǔn)：① 紫紺型先天性心臟病患者。② 術(shù)前肝腎功能異常、左室射血分?jǐn)?shù)低于40%、右心衰竭、心律失常者。③ 術(shù)中開放升主動脈后心臟不能自動復(fù)跳、有嚴(yán)重心律失常者。④ 存在急性感染性疾病、自身免疫性疾病、貧血者。

1.2 治療方法

所有患兒均行脈搏血氧飽和度、心率及袖帶血壓監(jiān)測。有文獻(xiàn)報(bào)道[13]，右美托咪定腎臟保護(hù)作用推薦劑量為0.2～0.7 μg/(kg·h)。參考前期資料，本研究右美托咪定劑量選擇0.5 μg/(kg·h)。常規(guī)麻醉誘導(dǎo)前15 min，觀察組患兒給予靜脈注射鹽酸右美托咪定注射液[江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20090248，規(guī)格2 ml∶200 g(按右美托咪定計(jì))]負(fù)荷劑量1 μg/(kg·h)，隨后以0.5 μg/(kg·h)速度持續(xù)泵入至術(shù)后12 h；對照組僅給予靜脈泵入生理鹽水至術(shù)后12 h。麻醉誘導(dǎo)：靜脈注射咪達(dá)唑侖注射液(江蘇九旭藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20153019,規(guī)格3 ml∶15 mg)0.1～0.2 mg/kg；羅庫溴銨注射液(浙江仙琚制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20093186，規(guī)格5 ml∶50 mg)0.6 mg/kg；枸櫞酸舒芬太尼注射液(國藥集團(tuán)工業(yè)有限公司廊坊分公司，國藥準(zhǔn)字H20203713，規(guī)格按C22H30N2O2S計(jì)2 ml∶100 ug)1～2 μg/kg；丙泊酚乳狀注射液(廣東嘉博制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20133360,規(guī)格50 ml∶500 mg)2 mg/kg。麻醉誘導(dǎo)后在可視喉鏡下行氣管內(nèi)插管機(jī)械通氣，維持潮氣量為8～10 ml/kg，頻率20～30次/min，維持呼氣末CO2分壓30～35 mmHg?；純簶飫用}和右頸內(nèi)靜脈(超聲引導(dǎo)下)穿刺置管，持續(xù)泵入復(fù)方電解質(zhì)[2～4 ml/(kg·h)]，采用舒芬太尼1～2 μg/(kg·h)及羅庫溴銨1 mg/(kg·h)進(jìn)行麻醉維持，體外循環(huán)開始前吸入七氟烷(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20040771)濃度1.5%～3%、空氣1 L/min和氧氣1 L/min。兩組術(shù)中操作：低分子量肝素鈉注射液(杭州九源基因工程有限公司，國藥準(zhǔn)字H19990035，規(guī)格0.3 ml∶3000 IU)400 IU/kg靜脈推注，當(dāng)穩(wěn)定的激活全血凝固時(shí)間 >480 s 后建立CPB，預(yù)充液為高滲羥乙基淀粉200/0.5氯化鈉注射液(山東齊都藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20173260,規(guī)格250 ml∶羥乙基淀粉200/0.5 15 g與氯化鈉18 g)20 ml/kg滴注和乳酸林格注射液(上海長征富民金山制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H31020947，規(guī)格500 ml)10 ml/kg滴注。轉(zhuǎn)流中注意維持血液中度稀釋紅細(xì)胞壓積0.2～0.3，術(shù)中維持食管溫度26 ℃～28 ℃，灌注流量100～150 ml/(kg·min)恒流灌注，灌注壓維持在50～80 mmHg。心肌保護(hù)采用組氨酸色氨酸-酮戊二酸鹽液(20～40 ml/kg)，主動脈根部灌注。轉(zhuǎn)流中根據(jù)血?dú)夥治鼋Y(jié)果調(diào)節(jié)電解質(zhì)，恢復(fù)循環(huán)。開放升主動脈時(shí)，常規(guī)輸注鹽酸多巴胺注射液(廣州白云山明興制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H44022388，規(guī)格2 ml∶20 mg)0.5～5 μg/(kg·min)，必要時(shí)加用去氧腎上腺素0.1～10 μg/(kg·min)、多巴酚丁胺2.5～10 μg/(kg·min)等血管活性藥物。轉(zhuǎn)流停止后，靜脈注射硫酸魚精蛋白注射液(悅康藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H11020246，規(guī)格5 ml∶50 mg)中和肝素，魚精蛋白與肝素之比為1∶1.2。所有患兒手術(shù)均由本院胸心外科同一治療組的醫(yī)生完成。

1.3 觀察指標(biāo)

記錄兩組患兒圍手術(shù)期的整體情況，主要包括麻醉誘導(dǎo)至切皮時(shí)間、主動脈阻斷時(shí)間、手術(shù)時(shí)間、麻醉時(shí)間、血流動力學(xué)指標(biāo)[如心率、平均動脈壓(mean arterial pressure，MVP)、中心靜脈壓(central venous pressure，CVP)]等；在術(shù)前(T0)、麻醉誘導(dǎo)后30 min(T1)、術(shù)后24 h(T2)、術(shù)后48 h(T3)及術(shù)后 72 h(T4)分別抽取外周靜脈血3 ml于抗凝管中，用JIDI-20D離心機(jī)(廣州吉迪儀器有限公司)8000 r/min 離心5 min，收集上層血清后置于-80 ℃冰箱中保存。血清肌酐水平由本院檢驗(yàn)科采用BK-400自動生化儀(Biobase公司)進(jìn)行檢測。AKI參考診斷標(biāo)準(zhǔn)[14]：腎功能48 h內(nèi)急劇下降，血清肌酐水平上升≥26.5 μmol/L或≥基礎(chǔ)水平的1.5倍，或者尿量減少<0.5 ml/(kg·h)，時(shí)間超過6 h。

1.3.1流式細(xì)胞儀檢測TLR3+細(xì)胞百分比

取上述相同時(shí)間點(diǎn)患兒外周靜脈血2 ml于肝素鈉抗凝管中，采用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離PBMC。全血中PBMC具體分離步驟為：2 ml外周靜脈血加入抗凝管中，室溫下加入等體積PBS吹打混勻，繼續(xù)加到含有5 ml Ficoll淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，8000 r/min離心30 min后，采用移液管插入離心管中的云霧層，輕輕吸出全部云霧層于新的離心管中，再次加入2倍體積的PBS洗滌2次，5000 r/min離心10 min并棄上清，獲得的PBMC細(xì)胞濃度調(diào)整至106個(gè)/ml，取500 μl并加入破膜劑孵育30 min，再加入異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的TLR3單抗，置于4 ℃冰箱中繼續(xù)孵育30 min，PBS洗滌1次，重懸細(xì)胞，用Accuri C6流式細(xì)胞儀(BD公司)上機(jī)檢測樣本中TLR3+細(xì)胞百分比。

1.3.2ELISA法檢測血清NF-κB、IL-1β和TNF-α表達(dá)水平

采用ELISA法檢測血清炎癥因子NF-κB(美國R&D公司)、IL-1β和TNF-α(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，實(shí)驗(yàn)操作步驟參考試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組患兒圍手術(shù)期血流動力學(xué)比較

兩組患兒在T0～T35個(gè)時(shí)間點(diǎn)的心率、MAP和CVP比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表2。

表2 兩組患兒圍手術(shù)期心率、MVP、CVP比較

2.2 兩組患兒不同時(shí)間點(diǎn)外周靜脈血PBMC中TLR3+細(xì)胞百分比

在T0和T1時(shí)間點(diǎn)，兩組患兒外周血PBMC中TLR3+細(xì)胞百分比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；在T2、T3和T4時(shí)間點(diǎn)，觀察組患兒PBMC中TLR3+細(xì)胞百分比低于對照組(P<0.05)。見表3。

表3 兩組患兒PBMC中TLR3+細(xì)胞百分比

2.3 兩組患兒不同時(shí)間點(diǎn)肌酐、NF-κB、IL-1β、TNF-α表達(dá)水平比較

T3和T4時(shí)間點(diǎn)，觀察組患兒血清肌酐水平低于對照組(P<0.05)；T2、T3和T4時(shí)間點(diǎn)，觀察組患兒血清NF-κB水平低于對照組(P<0.05)；T3和T4時(shí)間點(diǎn)觀察組患兒血清IL-1β和TNF-α表達(dá)水平低于對照組(P<0.05)。見表4。

表4 兩組患兒肌酐、NF-κB、IL-1β和TNF-α表達(dá)水平比較

2.4 兩組患兒術(shù)后AKI發(fā)生率比較

術(shù)后48 h對兩組患兒AKI發(fā)生率進(jìn)行評估，觀察組患兒AKI發(fā)生率(5.95%)低于對照組(19.05%)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=6.585，P=0.010)。

3 討論

國內(nèi)外研究證實(shí)，先心病患兒CPB術(shù)后AKI發(fā)生率在10% ～45%[1,15]，其中死亡患兒比例達(dá)15.25%[15]，且術(shù)后合并AKI嚴(yán)重影響了患兒的臨床預(yù)后。因此，盡快明確AKI發(fā)病機(jī)制尤為重要。盡管有文獻(xiàn)報(bào)道[15-16]患兒CPB術(shù)后發(fā)生AKI可能與多種誘因(如血糖水平、年齡、體外循環(huán)時(shí)間、主動脈阻斷時(shí)間等)有關(guān)，但術(shù)后全身炎性反應(yīng)在AKI的發(fā)病機(jī)制中扮演了重要作用[2-3]。Abdallah等[17]發(fā)現(xiàn)白介素18(interleukin-18，IL-18)水平較高是術(shù)后AKI發(fā)病的重要預(yù)測因子，且與致死率相關(guān)；Jacob等[18]開展的前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，采用高劑量地塞米松抗炎預(yù)處理后可顯著降低AKI的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)心臟手術(shù)中應(yīng)用白細(xì)胞過濾器能緩解患者術(shù)后腎功能的惡化[19]。上述結(jié)果均提示炎性反應(yīng)在AKI發(fā)病中發(fā)揮了重要作用。目前，多數(shù)研究僅探討右美托咪定對TLR2和TLR4表達(dá)水平的影響[8-10]，然而其與TLR3的相關(guān)性研究報(bào)道較少。另一方面，TLR3/NF-κB信號通路在AKI發(fā)病機(jī)制中作用顯著[11]，且右美托咪定具有腎臟保護(hù)作用。因此，本研究系統(tǒng)分析了右美托咪定干預(yù)對CPB患兒PBMC中TLR3表達(dá)及其下游信號NF-κB、TNF-α及IL-1β水平的影響。

本研究結(jié)果表明，右美托咪定可降低CPB術(shù)后患兒PBMC中TLR3+細(xì)胞百分比，TLR3與含TIR結(jié)構(gòu)域的銜接蛋白(TIR domain-containing adaptor inducing interferon β，TRIF)結(jié)合后，通過腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)N端的結(jié)合域誘導(dǎo)NF-κB的激活[20]，而NF-κB可通過多種途徑介導(dǎo)機(jī)體的炎性反應(yīng)，其中最為常見的是其下游的炎癥因子IL-1β和TNF-α的表達(dá)[21]。李霽等[22]發(fā)現(xiàn)，百草枯中毒誘導(dǎo)的AKI大鼠腎組織中，NF-κB和TNF-α蛋白表達(dá)水平升高；丁仁彧等[23]也證實(shí)，脂多糖誘導(dǎo)的AKI小鼠模型的血清和腎臟組織中IL-1β和TNF-α表達(dá)水平升高。本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組患兒在術(shù)后 24 h 開始，血清NF-κB水平低于對照組，但血清 IL-1β 和TNF-α表達(dá)水平與對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；在術(shù)后48和72 h時(shí)間點(diǎn)，血清IL-1β和TNF-α表達(dá)水平低于對照組。另一方面，F(xiàn)as相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域在NF-κB的介導(dǎo)下進(jìn)一步活化Caspase信號通路，從而誘導(dǎo)細(xì)胞的大量凋亡。Caspase-3是細(xì)胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的主要蛋白[24]。國內(nèi)外研究[23，25]均證實(shí)，AKI動物模型的腎臟組織中Caspase-3蛋白和Caspase-3 mRNA表達(dá)水平較高；Li等[26]研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定可降低肺組織中Caspase-3蛋白的表達(dá)，且呈現(xiàn)劑量依賴性。因此，本研究提出右美托咪定預(yù)處理對CPB患兒術(shù)后腎損傷的保護(hù)作用可能與降低Caspase-3蛋白表達(dá)水平有關(guān)。

術(shù)后48 h觀察組患兒AKI發(fā)生率低于對照組，說明右美托咪定對CPB患兒腎臟具有保護(hù)作用；檢測肌酐水平發(fā)現(xiàn)，術(shù)后24 h兩組肌酐水平相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而在48 h觀察組患兒肌酐水平低于對照組，這可能是腎臟受損后血清肌酐水平變化不敏感所致。因此，其他研究也提出采用其他分子標(biāo)志物[如血或尿中IL-18、尿液中腎損傷分子-1(kidney injury molecule-1，KIM-1)及中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白(neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL)]等預(yù)測AKI的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[27]。

綜上所述，本研究參考前期文獻(xiàn)報(bào)道將右美托咪定干預(yù)劑量設(shè)置為0.5 μg/(kg·h)，發(fā)現(xiàn)其對CPB術(shù)后腎臟具有保護(hù)作用，推測其主要與抑制TLR3/NF-κB信號通路及其下游的炎癥因子有關(guān)。本研究有一定局限性，右美托咪定對CPB術(shù)后腎臟保護(hù)作用與其他濃度的關(guān)系還需進(jìn)一步研究。此外，本研究未對患兒PBMC和腎臟組織中的相關(guān)蛋白(如NF-κB、IL-1β、TNF-α等)進(jìn)行檢測；右美托咪定對CPB術(shù)后腎臟保護(hù)作用的其他機(jī)制也將是我們下一步探討的方向。