卞京，李夏伊，鄭于銘，徐文暉，朱美玲，鄭磊貞

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球第3大常見的惡性腫瘤和第2大常見的腫瘤死亡原因[1]，全球每年死于結(jié)直腸癌的病例數(shù)約90萬[2]，約占全部癌癥及癌癥相關(guān)死因的10%，嚴(yán)重威脅人類健康。近年來，我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率均呈快速上升的趨勢，傳統(tǒng)化療藥物的使用效果進(jìn)入瓶頸期。結(jié)腸癌的治療經(jīng)歷了從單純化療到分子靶向藥物和免疫治療藥物的過渡。因此，尋求新的、更加有效的針對晚期結(jié)腸癌的治療方案變得刻不容緩。隨著個體化、精準(zhǔn)化醫(yī)療時代的到來，溶瘤病毒治療方案正成為結(jié)腸癌研究的新方向[3]。

溶瘤病毒是一種具有高效復(fù)制能力的腫瘤殺傷型病毒，能特異性識別并感染殺傷腫瘤細(xì)胞。2006年，經(jīng)改良的腺病毒溶瘤病毒缺陷型溶瘤腺病毒H101在中國被批準(zhǔn)用于治療頭頸部鱗狀細(xì)胞癌[4]。缺陷型溶瘤腺病毒H101是世界上首個被批注上市的溶瘤病毒類藥物[5]，其能特異性地殺滅腫瘤細(xì)胞，但對正常組織并不會不造成傷害，避免了常規(guī)放療和化療等由于選擇性差而引起的造血功能抑制、脫發(fā)以及肝腎功能損害等不良反應(yīng)。缺陷型溶瘤腺病毒H101由5型腺病毒通過基因工程改造而成，通過刪除E1B區(qū)編碼的55 kDa蛋白的序列（E1B-55kDa）和E3區(qū)78.3～85.8 μm的基因片段，降低了病毒的復(fù)制能力。

既往研究發(fā)現(xiàn)，缺陷型溶瘤腺病毒H101在體外可抑制食管癌[6-7]、葡萄膜黑素瘤[8-9]、肝癌[10-12]以及肺癌[13]等腫瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的死亡。然而，缺陷型溶瘤腺病毒H101對結(jié)腸癌細(xì)胞的抗腫瘤作用目前尚不清楚。因此，本研究選擇結(jié)腸癌HCT-116、SW480和RKO細(xì)胞作為研究對象，用E1B-55kDa基因缺陷型溶瘤腺病毒H101感染各株細(xì)胞后，檢測缺陷型溶瘤腺病毒H101對結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、細(xì)胞形態(tài)、遷移、侵襲和細(xì)胞周期等的影響，以評估其在體外的抗腫瘤作用；并通過建立結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞的裸鼠皮下移植瘤模型，進(jìn)一步驗(yàn)證其在體內(nèi)的抗腫瘤作用。本研究為闡明溶瘤腺病毒缺陷型H101參與結(jié)直腸癌發(fā)生和發(fā)展的生物學(xué)機(jī)制提供重要的理論依據(jù)，并為今后采用新的、有效的結(jié)直腸癌治療方法提供了新的方向。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動物

結(jié)腸癌HCT-116、SW480和RKO細(xì)胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。BALB/c裸鼠、3～4周齡、雄性購自上海吉輝實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)有限公司[實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2017-0012]。

1.2 試劑和儀器

重組人5型腺病毒注射液（H101）由上海三維生物技術(shù)有限公司惠贈。胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、青鏈霉素、含EDTA的胰蛋白酶和二甲亞砜（DMSO）購自美國Gibco公司，DMEM高糖培養(yǎng)液購自美國HyClone公司。CCK-8試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、細(xì)胞周期檢測試劑盒、4%多聚甲醛溶液、結(jié)晶紫染液、RIPA裂解液、PMSF、快速封閉液、抗體稀釋液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自中國碧云天公司。預(yù)染蛋白Marker購自美國Thermo公司。鼠抗人Hexon單克隆抗體購自美國Santa公司，兔抗人GAPDH（內(nèi)參照）多克隆抗體購自美國Bioworld公司。TBST購自生工生物工程（上海）股份有限公司，PVDF膜和電化學(xué)發(fā)光液購自美國Millipore公司，Transwell小室購自美國Corning公司，基質(zhì)膠購自美國BD公司。

流式細(xì)胞分析儀（型號：B49007AD）為美國BD公司產(chǎn)品，化學(xué)發(fā)光成像儀（型號：ChemidocXRS+Gel 3004081）為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

結(jié)腸癌HCT-116、SW480和RKO細(xì)胞株用含10% FBS和1%青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心重懸后進(jìn)行傳代處理，取對數(shù)生長期、狀態(tài)良好的細(xì)胞用作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 病毒感染

將細(xì)胞接種于96孔、6孔、12孔板或直徑為60 mm的培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，第2天換成含不同效價(jià)（1.0×106、2.5×106、5.0×106、7.5×106和1.0×107vp/mL）缺陷型溶瘤腺病毒H101的培養(yǎng)液，對照組為加入不含病毒的培養(yǎng)液。

1.5 CCK-8法檢測細(xì)胞的生存能力

將對數(shù)生長期的HCT-116、SW480和RKO細(xì)胞接種于96孔板中，5×103個細(xì)胞/孔。將96孔板置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，至細(xì)胞貼壁生長。實(shí)驗(yàn)設(shè)立實(shí)驗(yàn)組、對照組及空白組：實(shí)驗(yàn)組為待細(xì)胞貼壁生長后，除去培養(yǎng)液，換為含不同效價(jià)（1.0×106、2.5×106、5.0×106、7.5×106和1.0×107vp/mL）缺陷型溶瘤腺病毒H101的培養(yǎng)液處理細(xì)胞；對照組為待細(xì)胞貼壁生長后，除去培養(yǎng)液，加入不含病毒的培養(yǎng)液處理細(xì)胞；空白組中不接種細(xì)胞僅加入不含病毒的培養(yǎng)液；每孔培養(yǎng)液的體積為100 μL，每組設(shè)置3個復(fù)孔。病毒感染24、48和72 h后，分別除去培養(yǎng)液，加入10 μL CCK-8試劑；在培養(yǎng)箱中避光處理2 h后取出96孔板，在酶聯(lián)免疫檢測儀波長450 nm波長處測量各孔的D值，并計(jì)算各組細(xì)胞的存活率。細(xì)胞存活率（%）＝（實(shí)驗(yàn)組D值-空白組D值）/（對照組D值-空白組D值）×100%。

1.6 細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析

取處于對數(shù)生長期的HCT-116細(xì)胞（5×105個）接種到直徑為60 mm的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，實(shí)驗(yàn)組中加入含效價(jià)為1.0×107vp/mL的缺陷型溶瘤腺病毒H101培養(yǎng)液，對照組中加入不含病毒的培養(yǎng)液；將細(xì)胞置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的形態(tài)，并對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行拍照。

1.7 細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)

將處于對數(shù)生長期的HCT-116細(xì)胞（5×105個）接種至60 mm 的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，實(shí)驗(yàn)組中加入含效價(jià)為1.0×106和2.5×106vp/mL的缺陷型溶瘤腺病毒H101培養(yǎng)液，對照組中加入不含病毒的培養(yǎng)液。將細(xì)胞置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，將細(xì)胞接種于6孔板中（500個細(xì)胞/孔）。將6孔板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞集落形成情況。待觀察到大部分細(xì)胞集落所含細(xì)胞數(shù)＞50個時，終止培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)液，用PBS清洗2次后，加入4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞15 min；除去4%多聚甲醛溶液，用PBS清洗2次后，加入結(jié)晶紫染液染色15 min；除去結(jié)晶紫染液，清水洗凈，空氣干燥后，拍照并計(jì)數(shù)細(xì)胞集落數(shù)。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法檢測Hexon蛋白的表達(dá)水平

取處于對數(shù)生長期的HCT-116細(xì)胞（5×105個）接種至60 mm 的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，實(shí)驗(yàn)組中加入含效價(jià)為1.0×107vp/mL的缺陷型溶瘤腺病毒H101培養(yǎng)液，對照組中加入不含病毒的培養(yǎng)液。將2組細(xì)胞置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，提取細(xì)胞總蛋白，并用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。每孔加入20 μg蛋白樣品，進(jìn)行SDS-PAGE（分離膠濃度為10%）分離蛋白。電泳結(jié)束后，采用濕轉(zhuǎn)法將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，然后用快速封閉液封閉15 min。隨后，分別加入一抗[鼠抗人Hexon單克隆抗體（體積稀釋比例為1∶1 000），兔抗人GAPDH（內(nèi)參照）多克隆抗體（體積稀釋比例為1∶5 000）] 4 ℃條件下反應(yīng)過夜；次日用TBST清洗膜3次，每次10 min，室溫下加入二抗[辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠或羊抗兔IgG（體積稀釋比例均為1∶5 000）]，置于搖床上室溫條件下孵育1 h，再用TBST清洗3次，每次10 min。配制并滴加電化學(xué)發(fā)光液，經(jīng)Bio-Rad成像系統(tǒng)顯影，采用Image Lab 5軟件對蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析。

1.9 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測缺陷型溶瘤腺病毒H101對HCT-116細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

取處于對數(shù)生長期的HCT-116細(xì)胞（5×105個）接種至60 mm 的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，實(shí)驗(yàn)組加入含效價(jià)為1.0×106和2.5×106vp/mL的缺陷型溶瘤腺病毒H101培養(yǎng)液，對照組中加入不含病毒的培養(yǎng)液。將各組細(xì)胞置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，消化計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×105個/mL；在小室的上室中接種200 μL不含F(xiàn)BS的細(xì)胞懸液，小室的下室中加入600 μL含F(xiàn)BS的培養(yǎng)液。將小室置于胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，取出小室，除去上層液體，加入4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞20 min后，PBS清洗2次。用棉簽將上室中未穿過小室膜的細(xì)胞輕柔擦去，加入結(jié)晶紫染液染色15 min。清水洗凈，空氣干燥后，拍照，每個小室選取3個視野。

細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，提前將基質(zhì)膠與無血清培養(yǎng)液按1∶7的體積稀釋比例稀釋后，以每孔100 μL的體積均勻鋪于Transwell小室的上室膜上，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置4～5 h，待其凝固成膜后行小室侵襲實(shí)驗(yàn)，其余操作同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。

1.10 FCM法檢測缺陷型溶瘤腺病毒H101對細(xì)胞周期的影響

取處于對數(shù)生長期的HCT-116細(xì)胞（5×105個）接種至60 mm 的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，實(shí)驗(yàn)組加入含效價(jià)為1.0×107vp/mL的缺陷型溶瘤腺病毒H101培養(yǎng)液，對照組中加入不含病毒的培養(yǎng)液。將2組細(xì)胞置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后消化細(xì)胞，離心后收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2遍；緩慢加入700 μL預(yù)冷的無水乙醇溶液，于-20 ℃條件下固定過夜。收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞，加入碘化丙啶染色液，37 ℃避光處理30 min后上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.11 構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤模型

14只3～4周齡的雄性BALB/c裸鼠在室溫25 ℃、相對濕度為40%～70%、12 h光-暗交替的環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，構(gòu)建皮下移植瘤模型。將處于對數(shù)生長期且生長狀態(tài)良好的結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞消化和離心后，用無血清的DMEM高糖培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并將細(xì)胞懸液調(diào)整為5×107個/mL，置于冰上備用。選取裸鼠右側(cè)臀部上方皮下位置作為進(jìn)針點(diǎn)，常規(guī)皮膚消毒后，緩慢推注100 μL腫瘤細(xì)胞懸液（5×106個HCT-116細(xì)胞），觀察并記錄裸鼠皮下移植瘤的生長情況。細(xì)胞接種4 d后，皮下種植瘤體積達(dá)到80 mm3時開始給藥，采用隨機(jī)分組的方法，將小鼠分為2組，每組7只。根據(jù)既往研究結(jié)果給藥：實(shí)驗(yàn)組每天瘤內(nèi)注射缺陷型溶瘤腺病毒H101（1×1010vp/只），第5～第9天；對照組每天瘤內(nèi)注射等體積的PBS，第5～第9天。每2 d用體重計(jì)測量裸鼠的體質(zhì)量，每2 d用游標(biāo)卡尺測量腫瘤長徑（a）和腫瘤短徑（b），并計(jì)算腫瘤體積（VT）（VT＝0.5×a×b2）。治療結(jié)束后，第14天時處死所有裸鼠，從皮下盡可能完整地剝?nèi)∧[瘤組織，電子天平上稱取腫瘤質(zhì)量，并計(jì)算抑瘤率，抑瘤率（%）＝（對照組平均腫瘤質(zhì)量-實(shí)驗(yàn)組平均腫瘤質(zhì)量）/對照組腫瘤質(zhì)量×100%。

將取得的新鮮腫瘤組織置于甲醛溶液中固定，由上海睿寶和生物科技有限公司進(jìn)行HE染色，并采用免疫組織化學(xué)法檢測Ki-67和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達(dá)情況。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理分析。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，計(jì)量資料以表示。2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間首先采用單因素方差分析，再行組內(nèi)兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 缺陷型溶瘤腺病毒H101降低結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞的生長活力

用不同效價(jià)（1.0×106、2.5×106、5.0×106、7.5×106和1.0×107vp/mL）的缺陷型溶瘤腺病毒H101作用于HCT-116、SW480和RKO細(xì)胞24、48和72 h后，采用CCK-8法檢測對結(jié)腸癌增殖的影響。結(jié)果（圖1A）顯示，缺陷型溶瘤腺病毒H101能明顯抑制HCT-116細(xì)胞的存活率（P均＜0.05），且呈一定的濃度依賴性和時間依賴性；而SW480和RKO細(xì)胞中，相較與對照組，僅在缺陷型溶瘤腺病毒H101效價(jià)較高（1.0×107vp/mL）和作用時間較長（72 h）的情況下，細(xì)胞的增殖被抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。因此，本研究選用更敏感的結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

采用效價(jià)為1.0×107vp/mL的缺陷型溶瘤腺病毒H101處理HCT-116細(xì)胞72 h后，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果（圖1B）顯示，對照組中HCT-116細(xì)胞呈貼壁生長狀態(tài)且生長迅速，細(xì)胞與細(xì)胞間的間隙較窄，細(xì)胞的胞質(zhì)飽滿，胞膜清晰；而缺陷型溶瘤腺病毒H101感染后HCT-116細(xì)胞與細(xì)胞間的間隙增寬，細(xì)胞密度降低，細(xì)胞數(shù)目不斷減少，細(xì)胞失去正常形態(tài)，懸浮細(xì)胞數(shù)目增多，并出現(xiàn)細(xì)胞破裂導(dǎo)致膜內(nèi)容物流出的現(xiàn)象。

為進(jìn)一步觀察缺陷型溶瘤腺病毒H101對HCT-116細(xì)胞增殖的抑制作用，根據(jù)CCK-8法檢測結(jié)果，采用低效價(jià)的缺陷型溶瘤腺病毒H101（1.0×106和2.5×106vp/mL）進(jìn)行細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)。檢測結(jié)果（圖1C）顯示，對照組、缺陷型溶瘤腺病毒（1.0×106vp/mL）組、缺陷型溶瘤腺病毒（2.5×106vp/mL）組的克隆形成數(shù)分別為（438.67±16.50）個、（196.67±18.77）個 和（72.67±2.08）個。與對照組相比，不同效價(jià)的缺陷型溶瘤腺病毒H101的集落形成能力均受到不同程度的抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.001）。

為進(jìn)一步驗(yàn)證缺陷型溶瘤腺病毒H101在結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞中的感染效率，用效價(jià)為1.0×107vp/mL的缺陷型溶瘤腺病毒H101感染HCT-116細(xì)胞72 h后，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測HCT-116細(xì)胞中腺病毒衣殼蛋白Hexon的表達(dá)情況。結(jié)果（圖1D）顯示，與對照組相比，Hexon在缺陷型溶瘤腺病毒H101感染的HCT-116細(xì)胞中高表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。這一結(jié)果提示，缺陷型溶瘤腺病毒H101可在結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞中有效表達(dá)。

2.2 缺陷型溶瘤腺病毒H101抑制HCT-116細(xì)胞的遷移與侵襲

用效價(jià)為1.0×106和2.5×106vp/mL的缺陷型溶瘤腺病毒H101處理HCT-116細(xì)胞48 h后，采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移和侵襲能力（圖2）。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，對照組中每視野下發(fā)生遷移的細(xì)胞數(shù)為（203.67±10.21）個，而效價(jià)為1.0×106vp/mL和2.5×106vp/mL缺陷型溶瘤腺病毒H101感染組中發(fā)生遷移的細(xì)胞數(shù)為（123.50±15.63）個和（79.50±2.63）個；與對照組相比，缺陷型溶瘤腺病毒H101感染組發(fā)生遷移的細(xì)胞數(shù)均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.001）。

細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，對照組中每視野下發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)為（156.00±14.11）個，而效價(jià)為1.0×106vp/mL和2.5×106vp/mL缺陷型溶瘤腺病毒H101感染組中發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)為（86.33±8.50）個和（37.33±5.86）個；與對照組相比，缺陷型溶瘤腺病毒H101感染組發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.001）。上述結(jié)果提示，缺陷型溶瘤腺病毒H101感染結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞后，能明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力。

Fig.1 The cell viabilities of colon cancer HCT-116,SW480 and RKO cells treated with different virus titers (1.0×106,2.5×106,5.0×106,7.5×106 and 1.0×107 vp/mL) of defective oncolytic adenovirus H101 for 24,48 and 72 h were detected by CCK-8 assay (A).The cell morphology of HCT-116 cells treated with defective oncolytic adenovirus H101 (1.0×107 vp/mL) for 72 h was observed under a light microscope (B).The colony formation ability of HCT-116 cells treated with defective oncolytic adenovirus H101 (1.0×106 and 2.5×106 vp/mL) for 48 h was detected by colony formation assay (C).The expression level of adenovirus Hexon protein in HCT-116 cells treated with defective oncolytic adenovirus H101 (1.0×107 vp/mL) for 72 h was detected by Western blotting (D).HCT-116 cells were treated without any drugs as the control.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001,vs the control group (n=3).圖1 分別采用CCK-8法（A）、細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析（B）和細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)（C）檢測缺陷型溶瘤腺病毒H101對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響以及蛋白質(zhì)印跡法檢測腺病毒衣殼蛋白Hexon在HCT-116細(xì)胞中的表達(dá)情況（D）

2.3 缺陷型溶瘤腺病毒H101阻滯HCT-116細(xì)胞的細(xì)胞周期

采用FCM法檢測缺陷型溶瘤腺病毒H101對HCT-116細(xì)胞周期的影響。用效價(jià)為1.0×107vp/mL的缺陷型溶瘤腺病毒H101處理HCT-116細(xì)胞72 h后，結(jié)果（圖3）顯示對照組中S期細(xì)胞所占百分比為（6.82±3.33）%，而缺陷型溶瘤腺病毒H101感染組S期細(xì)胞所占百分比為（20.85±2.04）%；與對照組相比，缺陷型溶瘤腺病毒H101感染組S期細(xì)胞所占百分比明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。這一結(jié)果提示，缺陷型溶瘤腺病毒H101可將HCT-116細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯在S期。

2.4 缺陷型溶瘤腺病毒H101抑制裸鼠皮下移植瘤的生長

Fig.2 The migration and invasion abilities of HCT-116 cells treated with defective oncolytic adenovirus H101 (1.0×106 and 2.5×106 vp/mL) for 48 h were detected by Transwell chamber assay (crystal violet staining,×100).HCT-116 cells were treated without any drugs as the control.**P＜0.01,***P＜0.001,vs the control group (n=3).圖2 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測缺陷型溶瘤腺病毒H101處理后對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

Fig.3 The cell cycle distribution of HCT-116 cells treated with defective oncolytic adenovirus H101(1.0×107 vp/mL) for 72 h was detected by FCM method.HCT-116 cells were treated without any drugs as the control.**P＜0.01,***P＜0.001,vs the control group (n=3).圖3 FCM法檢測缺陷型溶瘤腺病毒H101對HCT-116細(xì)胞周期的影響

Fig.4 The growth of HCT-116 cell xenograft tumor in nude mice was inhibited by defective oncolytic adenovirus H101.A: The gross picture of HCT-116 cell xenograft tumor mice;The tumor volume and tumor weight of HCT-116 cell xenograft tumor mice;B: The HE staining result (×100) of tumor tissues;C: The expression levels of Ki-67 and VEGF were detected by immunohistochemistry (DAB staining,×100).H101 group: The nude mice bearing HCT-116 cell xenograft tumor treated with defective oncolytic adenovirus H101 (intratumoral injection,1.0×107 vp/piece);Control group: The nude mice bearing HCT-116 cell xenograft tumor treated with PBS (intratumoral injection,1.0×107 vp/piece).*P＜0.05,***P＜0.001,vs the control group (n=7).圖4 缺陷型溶瘤腺病毒H101抑制裸鼠皮下移植瘤的生長

構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤模型，進(jìn)一步觀察缺陷型溶瘤腺病毒H101對結(jié)腸癌抑制作用。結(jié)果（圖4A）顯示，與對照組相比，缺陷型溶瘤腺病毒H101能明顯抑制HCT-116細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤的生長。繪制裸鼠皮下移植瘤生長曲線圖，結(jié)果顯示，第14天時缺陷型溶瘤腺病毒H101治療組裸鼠皮下移植瘤體積為（221.76±119.40）mm3，明顯小于對照組的（1 027.86±277.54）mm3，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。缺陷型溶瘤腺病毒H101組裸鼠皮下移植瘤質(zhì)量為（0.054 9±0.080 1）g，明顯小于對照組的（0.711 2±0.125 5）g，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。計(jì)算結(jié)果顯示，缺陷型溶瘤腺病毒H101的抑瘤率為92.28%。上述結(jié)果表明，缺陷型溶瘤腺病毒H101顯著抑制裸鼠皮下移植瘤的體內(nèi)生長，具有很好的體內(nèi)抗腫瘤作用。

皮下移植瘤組織經(jīng)HE染色后，光學(xué)顯微鏡鏡下觀察發(fā)現(xiàn)（圖4B），對照組腫瘤組織中以實(shí)體腫瘤組織為主，腫瘤細(xì)胞彌漫分布，有大量炎癥細(xì)胞浸潤，壞死區(qū)域極少，腫瘤組織中心可見大量血管增生。而缺陷型溶瘤腺病毒H101治療組腫瘤組織中可見細(xì)胞大面積壞死，細(xì)胞核異型性明顯，大量細(xì)胞核消失留下殘影，可見大面積炎癥細(xì)胞浸潤。

應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測移植瘤中Ki-67和VEGF的表達(dá)情況（圖4C）。結(jié)果顯示對照組腫瘤組織中Ki-67蛋白陽性細(xì)胞分布較廣，而缺陷型溶瘤腺病毒H101干預(yù)后，腫瘤組織中Ki-67蛋白陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)明顯減少；這一結(jié)果說明，缺陷型溶瘤腺病毒H101能明顯抑制腫瘤細(xì)胞增殖，使腫瘤組織生長減弱。應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測移植瘤中VEGF蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示對照組結(jié)腸癌移植瘤內(nèi)VEGF表達(dá)陽性細(xì)胞的分布較廣，而缺陷型溶瘤腺病毒H101干預(yù)后，VEGF陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)明顯減少；這一結(jié)果說明，缺陷型溶瘤腺病毒H101明顯抑制腫瘤組織中血管生成。

3 討論

溶瘤腺病毒是一種直徑為70～90 nm、基因組大小為25～45×103bp的無包膜的雙鏈DNA病毒[14]。在正常細(xì)胞被腺病毒感染時，會表達(dá)與病毒復(fù)制有關(guān)的早期基因E1A和E1B。其中E1A可調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤相關(guān)蛋白（retinoblastoma associated protein，Rb）。E1B編碼的一種大小為55 kDa的蛋白（E1B-55kDa），其可以使細(xì)胞抑癌基因p53失活，從而有利于病毒復(fù)制。缺陷型溶瘤腺病毒H101是一種重組人5型腺病毒，刪除了E1B區(qū)編碼55kD蛋白的序列和E3區(qū)78.3～85.8 μm的基因片段，降低了病毒的復(fù)制能力[5]。

細(xì)胞增殖與細(xì)胞死亡的調(diào)控失衡是細(xì)胞發(fā)生惡變的核心。正常細(xì)胞可以通過調(diào)控促生長信號的產(chǎn)生和釋放，維持正常的結(jié)構(gòu)和功能；而腫瘤細(xì)胞逃避正常的信號調(diào)控，呈現(xiàn)無限增殖的狀態(tài)。因此，抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡是治療腫瘤的重要方式。本研究結(jié)果顯示，缺陷型溶瘤腺病毒H101感染HCT-116細(xì)胞后，細(xì)胞的生長活力和集落形成能力被顯著抑制，提示腫瘤細(xì)胞的增殖能力被大大減弱。進(jìn)一步檢測其遷移及侵襲能力，發(fā)現(xiàn)缺陷型溶瘤腺病毒H101感染后HCT-116細(xì)胞的遷移及侵襲能力明顯降低。破壞宿主細(xì)胞的復(fù)制周期，是許多病毒用來創(chuàng)建有利于病毒復(fù)制的細(xì)胞環(huán)境的常用策略。研究發(fā)現(xiàn)，異常的細(xì)胞周期控制和E1A的表達(dá)與溶瘤腺病毒活性之間關(guān)系密切，功能失調(diào)的細(xì)胞周期有利于提高溶瘤腺病毒的功效[15]。LEI等[13]研究發(fā)現(xiàn)，H101可通過細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞壞死誘導(dǎo)對肺癌XWLC-05細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用；SONG等[16]研究發(fā)現(xiàn)，H101在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤HXO-RB44細(xì)胞中大量復(fù)制，其殺傷腫瘤和抑制生長的作用與H101導(dǎo)致的細(xì)胞G2/M期停滯并直接裂解腫瘤細(xì)胞有關(guān)，這與CHERΜBINI等[17]的研究結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)，缺陷型溶瘤腺病毒H101感染過的HCT-116細(xì)胞，S期細(xì)胞所占百分比明顯增加，提示H101可能通過使細(xì)胞停滯在S期抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，從而達(dá)到抗腫瘤的作用。上述結(jié)果表明，E1B-55kDa缺陷型溶瘤腺病毒H101對HCT-116細(xì)胞具有明顯的體外抗腫瘤作用。

根據(jù)體外研究結(jié)果，本研究進(jìn)一步構(gòu)建了裸鼠皮下移植瘤模型，以觀察缺陷型溶瘤腺病毒H101對結(jié)腸癌細(xì)胞體內(nèi)抗腫瘤作用。采用BALB/c裸鼠作為荷瘤動物，剔除了免疫系統(tǒng)對病毒抗腫瘤效能的影響，可直接觀察病毒的抗腫瘤作用。溶瘤病毒的給藥途徑通常包括瘤內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射和腹膜內(nèi)注射等[18]。瘤內(nèi)注射多用于實(shí)體腫瘤的治療，是溶瘤病毒最常用的給藥方式，目前已在多項(xiàng)Ⅲ期臨床試驗(yàn)中證明有效[19]，但該方法存在操作復(fù)雜、介入昂貴和不良反應(yīng)多等缺點(diǎn)。靜脈內(nèi)注射多用于轉(zhuǎn)移性腫瘤患者、血液治療患者或者對血清中的抗體有抵抗力的患者，但該方法的不足之處在于，溶瘤病毒不能直接到達(dá)病灶，需經(jīng)過血液的稀釋且易被肝臟、脾臟等器官和血清中的抗體中和殺傷，導(dǎo)致其在病灶中難以達(dá)到有效濃度，此外，靜脈內(nèi)注射還可能引起全身擴(kuò)散，引發(fā)嚴(yán)重感染。一項(xiàng)針對瘤內(nèi)注射及靜脈內(nèi)注射有效性和安全性進(jìn)行分析的Meta分析發(fā)現(xiàn)，瘤內(nèi)注射的給藥方式對療效有顯著改善（P＝0.000 2），而靜脈注射無顯著改善（P＝0.99）[20]。因此，本實(shí)驗(yàn)選用瘤內(nèi)注射進(jìn)行H101的治療。

缺陷型溶瘤腺病毒H101瘤內(nèi)注射的裸鼠瘤體的生長速度明顯比對照組減緩。腫瘤組織HE染色后觀察發(fā)現(xiàn)，對照組腫瘤組織以實(shí)體腫瘤組織為主，腫瘤組織內(nèi)未見明顯壞死；而缺陷型溶瘤腺病毒H101治療組中可見大面積細(xì)胞壞死，細(xì)胞核異型性明顯，大量細(xì)胞核消失留下殘影，其內(nèi)可見大量炎性細(xì)胞浸潤。缺陷型溶瘤腺病毒H101瘤內(nèi)注射組腫瘤組織中Ki-67陽性表達(dá)細(xì)胞分布明顯降低，這一結(jié)果表明缺陷型溶瘤腺病毒H101能顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，這一結(jié)果與體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。有研究發(fā)現(xiàn)，溶瘤病毒可影響腫瘤的脈管系統(tǒng)，促進(jìn)腫瘤內(nèi)血管萎縮，并具有抗血管生成作用[21]。被病毒感染的腫瘤細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子，其中中性粒細(xì)胞的浸潤可導(dǎo)致血栓形成、急性缺血和腫瘤細(xì)胞死亡[22]。此外，痘苗病毒株能夠在腫瘤相關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)感染并復(fù)制，從而直接導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的破壞和血管塌陷，腫瘤內(nèi)出現(xiàn)缺氧和大量壞死[23]，這在晚期肝細(xì)胞癌臨床實(shí)驗(yàn)中得到了證實(shí)。除了促進(jìn)腫瘤內(nèi)血管萎縮外，溶瘤病毒具有抗腫瘤血管生成特性，被感染的腫瘤內(nèi)VEGF表達(dá)水平被明顯降低[24]。有研究顯示，一種新型的，表達(dá)FP3（VEGF誘餌受體）的溶瘤腺病毒（RdB/FP3/Ad）可大大降低VEGF的表達(dá)水平和血管密度并增加腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的凋亡，有效抑制VEGF介導(dǎo)的腫瘤血管生成作用[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)缺陷型溶瘤腺病毒H101瘤內(nèi)注射后的腫瘤組織中VEGF蛋白陽性表達(dá)細(xì)胞的分布明顯降低，這一結(jié)果同樣提示缺陷型溶瘤腺病毒H101具有抗腫瘤血管生成的作用。因此，通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)同樣表明，E1B-55kDa基因缺陷型溶瘤腺病毒H101可抑制結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞的增殖，具有抗腫瘤作用。

綜上所述，E1B-55kDa基因缺陷型溶瘤腺病毒H101對結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞具有顯著的體內(nèi)和體外抗腫瘤作用，是一個潛在的抗腫瘤藥物，其在結(jié)腸癌臨床治療中可能有良好的應(yīng)用前景。