董一唯，孫艷莎，李宗海，蔣華

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）作為一種惡性漿細(xì)胞腫瘤，其特征為骨髓中單克隆漿細(xì)胞的惡性增殖并產(chǎn)生單克隆免疫球蛋白，臨床癥狀主要表現(xiàn)為貧血、腎功能損害、溶骨性損害和高血鈣等引起的終末器官損傷[1]。MM是第2常見的血液惡性腫瘤，在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中約占10%，在所有腫瘤中約占1%[2]。盡管由于新興治療手段的發(fā)展，MM的中位生存期延長至6年[3]，但多數(shù)患者會復(fù)發(fā)，所以目前MM仍被認(rèn)為是無法治愈的惡性腫瘤。B細(xì)胞成熟抗原（B cell maturation antigen，BCMA）即CD269，也稱作腫瘤壞死因子超家族成員17（tumor necrosis factor receptor superfamily member-17，TNFRSF-17），是由184個氨基酸組成的3型跨膜蛋白，對B細(xì)胞增殖、成熟、存活和向漿細(xì)胞分化發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[4]。BCMA僅在漿細(xì)胞上表達(dá)，且在惡性漿細(xì)胞中的表達(dá)比例高于正常漿細(xì)胞[5]。80%～100%的MM細(xì)胞上都表達(dá)BCMA，并且隨著疾病進(jìn)展，BCMA表達(dá)上調(diào)[4]。另外，BCMA高表達(dá)與不良預(yù)后有關(guān)，因此被當(dāng)做免疫治療的理想靶抗原[5]。

近年來，嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）修飾的T細(xì)胞療法成為腫瘤治療領(lǐng)域最具前景的發(fā)展方向之一。CAR-T細(xì)胞治療的主要流程為從體外獲取人外周血T細(xì)胞，通過基因重組技術(shù)，獲得表達(dá)CAR的T細(xì)胞，使得CAR-T細(xì)胞能夠特異性識別和結(jié)合腫瘤表面抗原，并殺傷帶有該特定抗原的腫瘤細(xì)胞。目前CAR-T療法已被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于治療難治性前B細(xì)胞急性淋巴結(jié)白血病和彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤[6]。然而，傳統(tǒng)的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品主要由處于終末分化狀態(tài)的效應(yīng)T細(xì)胞（effector T cell，Teff）組成，這一定程度上導(dǎo)致了CAR-T細(xì)胞治療血液腫瘤過程中的低免疫應(yīng)答和治療后復(fù)發(fā)。有研究顯示，良好的治療效果與T細(xì)胞的存活持久性有關(guān)[7]。除了腫瘤負(fù)荷的大小，不同的T細(xì)胞亞群比例也影響了臨床治療中的免疫應(yīng)答和抗腫瘤效果。在治療慢性淋巴細(xì)胞白血?。╟hronic lymphocytic leukemia，CLL）過程中，靶向CD19的CAR-T細(xì)胞中低分化T細(xì)胞所占的百分比越高，患者對CAR-T細(xì)胞治療的免疫應(yīng)答越完全且持久。并且，完全應(yīng)答的CLL患者的CAR-T細(xì)胞高表達(dá)記憶相關(guān)的基因，而未高表達(dá)終末分化和糖酵解相關(guān)的基因[8]。

初始T細(xì)胞（na?ve T cell，Tn）遇到抗原刺激后分化為干細(xì)胞樣記憶T細(xì)胞（stem-cell memory T cell，Tscm），隨后逐漸分化為中央型記憶型T細(xì)胞（central memory T cell，Tcm）、效應(yīng)記憶型T細(xì)胞（effector memory T cell，Tem）和效應(yīng)T細(xì)胞（effector T cell，Teff）。在分化過程中，T細(xì)胞的效應(yīng)殺傷功能逐漸增強(qiáng)，而干性逐漸喪失[9]。Tscm作為初始的記憶型T細(xì)胞，其干性最強(qiáng)，即具有自我更新和多向分化的能力。Tscm遇到抗原后能夠分化為其他T細(xì)胞亞群，尤其是細(xì)胞毒性CD8＋T細(xì)胞[10]。在動物模型中，相較于記憶型T細(xì)胞的其他亞群，Tscm顯示出更強(qiáng)的增殖、存活和抗腫瘤能力[11]。長期接受抗原刺激后，腫瘤細(xì)胞表面的檢查點分子會使細(xì)胞毒性CD8＋T細(xì)胞耗竭進(jìn)而功能失調(diào)[12]，而Tscm富集的T細(xì)胞可以重新分化為細(xì)胞毒性CD8＋T細(xì)胞，并增強(qiáng)T細(xì)胞的瘤內(nèi)浸潤[13]。因此，Tscm亞群有希望解決免疫治療中T細(xì)胞存活時間短、瘤內(nèi)浸潤不足和T細(xì)胞失能等問題。本研究中采取體外誘導(dǎo)的策略，將傳統(tǒng)的CAR-T細(xì)胞誘導(dǎo)為Tscm富集的CAR-T細(xì)胞，再進(jìn)行體內(nèi)治療，以期提高免疫治療效果。

T細(xì)胞的代謝對于T細(xì)胞分化十分重要，代謝重編程是獲得大量記憶型T細(xì)胞的策略之一。活化后的T細(xì)胞利用需氧的糖酵解過程向效應(yīng)T細(xì)胞分化。在T細(xì)胞亞群中，效應(yīng)T細(xì)胞處于終末分化狀態(tài)，記憶能力最低，僅能發(fā)揮短時的殺傷作用；而長期存活的記憶型T細(xì)胞仍然通過氧化磷酸化來供能[14]。研究表明，抑制雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin，mTOR）通路，以及促進(jìn)脂肪酸氧化（fatty acid oxidation，F(xiàn)AO）都可以促進(jìn)記憶型CD8＋T細(xì)胞的生成[15-17]。近年來，許多研究根據(jù)此思路更新了體外擴(kuò)增T細(xì)胞的方案，以獲得富集Tscm的T細(xì)胞庫，例如體外培養(yǎng)T細(xì)胞過程中添加絲裂原活化蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase，MEK）抑制劑和mTOR抑制劑等，主要機(jī)制涉及增強(qiáng)Notch信號，減少活性氧（reacitive oxygen species，ROS）或減少mTOR通路的活性[18-19]。二甲雙胍是治療糖尿病的常用藥，其調(diào)節(jié)能量代謝的主要機(jī)制為促進(jìn)AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）的活化、減少T細(xì)胞的脂肪酸氧化[15]。二甲雙胍能抑制線粒體電子傳遞鏈（electron transport chain，ETC）和ATP生成，通過激活A(yù)MPK和抑制mTOR復(fù)合體Ⅰ來促進(jìn)分解代謝、抑制合成代謝，從而調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境[20]。另外，二甲雙胍降低T細(xì)胞表面程序性死亡配體1（programmed cell death protein ligand 1，PD-L1）的表達(dá)水平，提高腫瘤浸潤C(jī)D8＋T細(xì)胞的數(shù)量和分泌效應(yīng)細(xì)胞因子的能力，使耗竭的T細(xì)胞由失活狀態(tài)“復(fù)活”[21-22]。因此，作為AMPK激活劑，二甲雙胍是T細(xì)胞代謝重編程的理想分子。因此，本研究中采用二甲雙胍體外誘導(dǎo)BCMA靶向的CAR-T細(xì)胞，觀察其對CAR-T細(xì)胞分化的影響，并進(jìn)一步探究其對小鼠MM移植瘤模型生長的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系和實驗動物

人MM細(xì)胞系RPMI-8226購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)；人胚腎上皮細(xì)胞293T細(xì)胞構(gòu)自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，在含有10%胎牛血清、不含抗生素的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)；所有細(xì)胞均置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

5～6周齡的雌性高度免疫缺陷型NPG小鼠購自北京維通達(dá)生物技術(shù)有限公司[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0002]。小鼠飼養(yǎng)于上海市腫瘤研究所實驗動物中心[實驗動物使用許可證號：SYXK（滬）2017-0011]的無特定病原體（specific pathogen free，SPF）環(huán)境。本研究的動物實驗嚴(yán)格按照上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院實驗動物管理委員會制定的實驗動物倫理條例進(jìn)行。

1.2 試劑和儀器

胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)液、AIM-V培養(yǎng)液和DMEM培養(yǎng)液購自美國Gibco公司。人AB血清購自美國Gemini公司，細(xì)胞培養(yǎng)用青霉素-鏈霉素購自美國Invitrogen公司，非放射性細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自瑞士Roche公司。人CD3/CD28 T細(xì)胞活化磁珠購自美國Invitrogen公司。重組人白細(xì)胞介素2（recombinant human interleukin-2，rhIL-2）購自上海華新生物高技術(shù)有限公司，rhIL-7和rhIL-21購自美國PeproTech公司；鹽酸二甲雙胍購自美國Selleck Chemicals公司。生物素（biotin）標(biāo)記的羊抗人F（ab’）多克隆抗體購自美國Jackson ImmunoResearch公司。藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）標(biāo)記的鏈霉親和素購自美國eBioscience公司。PerCP標(biāo)記的抗人CD3抗體、FITC標(biāo)記的抗人CD4抗體、PE標(biāo)記的抗人CD8抗體、BV510標(biāo)記的抗人CD8抗體、APC標(biāo)記的抗人CD95抗體、PE-CF594標(biāo)記的抗人C-C基序趨化因子受體7（C-C motif chemokine receptor 7，CCR7）抗體購自美國BD公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗人CD45RA抗體購自美國Invitrogen公司。FITC-Annexin Ⅴ和碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙染細(xì)胞凋亡試劑盒和絕對計數(shù)管購自美國BD公司。人外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）由上海市血液中心提供。聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）-8000和聚乙烯亞胺（polyethyleneimine，PEI）購自美國Sigma公司。

流式細(xì)胞儀（BD FACSCelesta?）為美國BD公司產(chǎn)品，生物安全柜為新加坡ESCO公司產(chǎn)品，細(xì)胞培養(yǎng)箱為美國Thermo公司產(chǎn)品。

1.3 慢病毒包裝與濃縮

將293T細(xì)胞接種于直徑為10 cm的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞狀態(tài)良好時使用。在800 μL DMEM培養(yǎng)液中分別加入一定比例的pAX2、pMD2.G和攜帶有BCMA-BBZ的重組載體（由本實驗室構(gòu)建并保存）混勻（即為A液）；在800 μL DMEM培養(yǎng)液中加入PEI溶液（PEI與質(zhì)粒的質(zhì)量比為2∶1）混勻（即為B液）。將A液滴加入B液中，室溫靜置10 min后將混合液滴加入接種有293T細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。4～6 h后收集細(xì)胞，除去原培養(yǎng)上清液，更換為新鮮的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后收集病毒，用孔徑為0.45 μm的尼龍過濾膜過濾后，加入1/4體積的5×PEG-8000溶液，混勻后置于4 ℃冰箱中過夜。次日，離心后收集病毒，用含2%人AB血清的AIM-V培養(yǎng)液重懸病毒，混勻后保存于-80 ℃冰箱備用。

1.4 CAR-T細(xì)胞的制備及擴(kuò)增

二甲雙胍誘導(dǎo)靶向BCMA的CAR-T細(xì)胞構(gòu)建流程見圖1A。采用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離獲得健康人群的PBMC，將約1×107個PBMC置于含2%人AB血清和rhIL-2（300 IU/mL）的AIM-V培養(yǎng)液中培養(yǎng)過夜。為了分離出PBMC中的T細(xì)胞，首先采用人CD3/CD28 T細(xì)胞活化磁珠進(jìn)行活化∶按照CD3陽性細(xì)胞數(shù)與活化磁珠數(shù)比例為1∶2估算出所需活化磁珠的數(shù)量，加入相應(yīng)的活化磁珠于培養(yǎng)體系內(nèi)，將細(xì)胞密度調(diào)整為2×106個/mL，同時加入rhIL-2激活細(xì)胞，記為Day 0。為了將CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)至活化后的T細(xì)胞上，T細(xì)胞活化24 h后，更換新鮮的培養(yǎng)液并加入BCMA-BBZ慢病毒[感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）＝5]進(jìn)行感染，同時添加8 μg/mL聚凝胺（polybrene）以提高感染效率，記為Day 1。為使CAR-T細(xì)胞擴(kuò)增并誘導(dǎo)出更高比例的Tscm，在慢病毒感染T細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞并將原有的培養(yǎng)液更換為含2%人AB血清、rhIL-7（5 ng/mL）和rhIL-21（25 ng/mL）的AIM-V培養(yǎng)液，培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶中，記為Day 2。二甲雙胍誘導(dǎo)組（rhIL-7＋rhIL-21＋二甲雙胍）為CAR-T細(xì)胞在rhIL-7和rhIL-21基礎(chǔ)上加入二甲雙胍（0.25 mmol/L），非二甲雙胍誘導(dǎo)組（rhIL-7＋rhIL-21）為CAR-T細(xì)胞在rhIL-7和rhIL-21基礎(chǔ)上加入與二甲雙胍溶劑等量的PBS，空白對照組為未感染慢病毒的人T細(xì)胞（untransduced T cell，UTD）。T細(xì)胞感染后3 d，用磁極吸附除去活化磁珠，各組分別更換為與Day 2一致的新鮮的培養(yǎng)液，記為Day 5。次日，收集細(xì)胞用于檢測CAR-T細(xì)胞陽性率、表型和功能，記為Day 6。隨后，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.5 篩選二甲雙胍體外誘導(dǎo)CAR-T細(xì)胞最佳條件

1.5.1 FCM法檢測二甲雙胍處理不同時間對CAR-T細(xì)胞陽性率的影響

收集各組CAR-T細(xì)胞[UTD組、rhIL-7＋rhIL-21組、rhIL-7＋rhIL-21＋二甲雙胍（0.25 mmol/L）組（分別在T細(xì)胞活化當(dāng)天、活化后1 d和活化后2 d時進(jìn)行處理）]，使用含1%小牛血清的PBS洗滌后，加入Biotin標(biāo)記的羊抗人F（ab’）抗體（體積稀釋比例為1∶50），冰上避光孵育45 min；洗滌后加入PE標(biāo)記的鏈霉親和素（體積稀釋比例為1∶200），室溫避光孵育20 min后重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測。PE陽性的細(xì)胞即為慢病毒感染后表達(dá)CAR的T細(xì)胞，PE陽性細(xì)胞占總淋巴細(xì)胞的比例即為CAR-T細(xì)胞陽性率。

1.5.2 FCM檢測不同濃度的二甲雙胍對CAR-T細(xì)胞記憶表型的影響

收集不同濃度二甲雙胍處理至第6天的各組CAR-T細(xì)胞[rhIL-7＋rhIL-21組、rhIL-7＋rhIL-21＋二甲雙胍（0.125 mmol/L）組、rhIL-7＋rhIL-21＋二甲雙胍（0.25 mmol/L）組和rhIL-7＋rhIL-21＋二甲雙胍（0.5 mmol/L）組]，洗滌后同時加入BV510標(biāo)記的抗人CD8抗體、APC標(biāo)記的抗人CD95抗體、PE-CF594標(biāo)記的抗人CCR7抗體和FITC標(biāo)記的抗人CD45RA抗體（體積稀釋比例均為1∶50），室溫避光孵育20 min后重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測。首先圈出淋巴細(xì)胞中的CD8＋CD95＋的細(xì)胞群，以CD45RA和CCR7的表達(dá)水平區(qū)分Tscm和Teff細(xì)胞。CD8＋T細(xì)胞中的CD95、CD45RA和CCR7高表達(dá)（CD95high CD45RAhigh CCR7high）的細(xì)胞亞群為Tscm，CD95和CD45RA高表達(dá)、CCR7低表達(dá)（CD95high CD45RAhigh CCR7low）的細(xì)胞亞群為Teff。

1.6 FCM檢測不同濃度的二甲雙胍誘導(dǎo)的CAR-T細(xì)胞的凋亡率

收集各組CAR-T細(xì)胞（細(xì)胞分組及處理時間同1.5.2節(jié)），PBS洗滌后，加入PI和FITCAnnexin Ⅴ（體積比例為1∶50），室溫避光孵育15 min，直接加入適量指定溶液后上機(jī)檢測細(xì)胞的凋亡率。

1.7 二甲雙胍體外誘導(dǎo)CAR-T細(xì)胞中Tscm的富集

收集活化6和8 d后的非二甲雙胍誘導(dǎo)組（rhIL-7＋rhIL-2）和二甲雙胍誘導(dǎo)組[rhIL-7＋rhIL-21＋二甲雙胍（0.25 mmol/L）]CAR-T細(xì)胞，采用FCM法檢測CAR-T細(xì)胞記憶表型，實驗流程同1.5.2節(jié)。

1.8 非放射性細(xì)胞毒性法檢測CAR-T細(xì)胞體外對MM細(xì)胞的殺傷能力

收集活化6 d后（Day 6）的CAR-T細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞（培養(yǎng)過程及實驗分組同1.4節(jié)），以MM細(xì)胞RPMI-8226作為靶細(xì)胞，離心后計數(shù)細(xì)胞，按照效靶比3∶1、1∶1和1∶3，將效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞接種于96孔板中；分別設(shè)置效應(yīng)自發(fā)、靶細(xì)胞自發(fā)、靶細(xì)胞最大、空白對照和體積對照組，每組至少設(shè)3個復(fù)孔；培養(yǎng)體系為200 μL，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。18 h后，每孔取50 μL培養(yǎng)上清液加入酶標(biāo)板中，再加入顯色試劑顯色后用酶聯(lián)免疫檢測儀在波長490 nm處檢測的各孔細(xì)胞的D值。

1.9 體外連續(xù)多輪靶細(xì)胞刺激

收集活化6 d（Day 6）后的CAR-T細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞（培養(yǎng)過程及實驗分組同1.4節(jié)），RPMI-8226細(xì)胞作為靶細(xì)胞，以1∶1的效靶比混合接種于6孔板中，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)2 d后（Day 8），收集剩余CAR-T細(xì)胞檢測表型（實驗方法同1.5.2節(jié)）或毒性殺傷能力（實驗方法同1.8節(jié)），定義為第一輪刺激（Stim 1）；同時，將剩余的CAR-T細(xì)胞再次與新的RPMI-8226細(xì)胞按1∶1的細(xì)胞數(shù)共培養(yǎng)，2 d后收集剩余CAR-T細(xì)胞再次檢測表型或毒性殺傷能力（實驗方法同第一輪刺激），定義為第二輪刺激（Stim 2）。

1.10 CAR-T細(xì)胞治療小鼠MM皮下移植瘤的效果

收集狀態(tài)良好的人MM細(xì)胞RPMI-8226接種于NPG小鼠的右側(cè)腋部皮下，每只小鼠接種3×106個細(xì)胞。當(dāng)腫瘤生長至體積為200～300 mm3（約14 d）時，將荷瘤小鼠被隨機(jī)分為3組，實驗分組同1.4節(jié)，每組6只。收集T細(xì)胞活化6 d后（Day 6）的UTD和CAR-T細(xì)胞（非二甲雙胍誘導(dǎo)組和二甲雙胍誘導(dǎo)組），培養(yǎng)過程及實驗分組同1.4節(jié)，分別通過尾靜脈注射輸注至3組小鼠體內(nèi)，每只小鼠尾靜脈注射的劑量為5×105個UTD或CAR-T細(xì)胞。每周測量腫瘤體積（Vtumor＝1/2×長徑×短徑2）和小鼠體質(zhì)量2～3次。當(dāng)每組小鼠腫瘤平均體積達(dá)到2 000 mm3時結(jié)束觀察，小鼠實施安樂死。CAR-T細(xì)胞注射14 d時采用頜下靜脈采血法采集少量小鼠外周血，保存于EDTA處理后的抗凝管中，使用抗人CD3、CD4和CD8抗體以及絕對計數(shù)管，檢測外周血中CD4＋T細(xì)胞和CD8＋T細(xì)胞的數(shù)量。

1.11 FCM法檢測小鼠外周血中CD8＋ T細(xì)胞和CD4＋ T細(xì)胞的數(shù)量

荷瘤小鼠尾靜脈注射CAR-T細(xì)胞14 d后，每組選取3只小鼠采集外周血。吸取20 μL PerCP標(biāo)記的抗人CD3抗體、FITC標(biāo)記的抗人CD4抗體及PE標(biāo)記的抗人CD8抗體滴加于絕對計數(shù)管管底的金屬網(wǎng)上，勿溶解微球；隨后加入50 μL外周血，渦旋混勻后室溫靜置15 min；再加入450 μL紅細(xì)胞裂解液，渦旋混勻后室溫條件下靜置15 min，即可上機(jī)檢測；最后根據(jù)說明書提供的方法計算陽性表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量。所有流式數(shù)據(jù)通過FlowJo V10軟件進(jìn)行分析。

1.12 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Graphpad Prism 8對所有實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，所有實驗均獨立重復(fù)3次，計量資料以表示。2組間比較采取獨立樣本t檢驗，多組間比較采取雙因素或單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用Bonferroni檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍體外誘導(dǎo)CAR-T細(xì)胞的最佳條件摸索

采用FCM法檢測T細(xì)胞活化6 d后（UTD組和rhIL-7＋rhIL-7組）以及Day 0、Day 1和Day 2時（見圖1A）添加二甲雙胍（0.25 mmol/L）對CAR-T細(xì)胞陽性率的影響。結(jié)果（圖1B）顯示，T細(xì)胞活化時（Day 0）和病毒感染轉(zhuǎn)入CAR時（Day 1）添加二甲雙胍會使CAR-T細(xì)胞的陽性率降低6%～10%，而在導(dǎo)入CAR 1 d后（Day 2）再加入二甲雙胍則CAR-T細(xì)胞的陽性率不受影響。因此，本研究選擇在T細(xì)胞導(dǎo)入CAR 1 d后（Day 2）加入二甲雙胍進(jìn)行誘導(dǎo)，并且3 d后（Day 5）更換培養(yǎng)液時重新加入二甲雙胍以維持培養(yǎng)體系中二甲雙胍的持續(xù)作用。

Fig.1 A: Schematic diagram of B cell maturation antigen (BCMA)-targeted chimeric antigen receptor(CAR)-T cells culture process and metformin (MET) induction.B: The effect of MET (0.25 mmol/L) on the transduction efficiency of BCMA-BBZ CAR on T cells at different time points (Day 0,Day 1 and Day 2) during the culture of CAR-T cells was detected by FCM method.Untransduced T cell (UTD): the blank control;CAR-T cells treated with cytokines [recombinant human interleukin-7 (rhIL-7)+rhIL-21]: the control.圖1 靶向BCMA CAR-T細(xì)胞的構(gòu)建及二甲雙胍誘導(dǎo)處理流程圖（A）及CAR-T細(xì)胞構(gòu)建過程中不同時間點加入二甲雙胍（0.25 mmol/L）對BCMA-BBZ CAR轉(zhuǎn)染至T細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的影響（B）

采用FCM法檢測T細(xì)胞活化6 d后，添加不同濃度（0.125、0.25和0.5 mmol/L）二甲雙胍誘導(dǎo)后對CAR-T細(xì)胞記憶表型的影響。結(jié)果（圖2A）顯示，濃度為0.125、0.25和0.5 mmol/L的二甲雙胍誘導(dǎo)后的CD8＋T細(xì)胞中的Tscm所占百分比依次升高，且0.25和0.5 mmol/L二甲雙胍誘導(dǎo)后的CD8＋T細(xì)胞中的Tscm所占百分比均明顯高于非二甲雙胍誘導(dǎo)組的細(xì)胞（P＜0.05和P＜0.01）。

FCM法檢測結(jié)果（圖2B）顯示，濃度為0.25 mmol/L二甲雙胍誘導(dǎo)的CAR-T細(xì)胞中凋亡細(xì)胞所占百分比明顯低于0.5 mmol/L濃度組。為了減少凋亡細(xì)胞對CAR-T細(xì)胞的不利影響，因此，本研究后續(xù)選用0.25 mmol/L作為二甲雙胍體外誘導(dǎo)CAR-T細(xì)胞的濃度。

2.2 二甲雙胍體外成功誘導(dǎo)了CAR-T細(xì)胞中Tscm的富集

FCM法連續(xù)檢測T細(xì)胞活化6和8 d后CAR-T細(xì)胞中CD8＋T細(xì)胞和Tscm所占的百分比。結(jié)果（圖3）顯示，在連續(xù)培養(yǎng)的過程中，相較于只使用rhIL-7＋rhIL-21培養(yǎng)的CAR-T細(xì)胞（非二甲雙胍誘導(dǎo)組），使用二甲雙胍誘導(dǎo)的CAR-T細(xì)胞中，CD8＋細(xì)胞中Tscm所占的百分比明顯增高（P＜0.05），Teff所占的百分比略低但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。這一結(jié)果說明，體外培養(yǎng)時加入二甲雙胍能維持CAR-T細(xì)胞中CD8＋T細(xì)胞的記憶性和干性，減緩向終末分化的速度。

2.3 二甲雙胍誘導(dǎo)的CAR-T細(xì)胞在靶細(xì)胞刺激后仍維持Tscm的富集

用RPMI-8226細(xì)胞對CAR-T細(xì)胞進(jìn)行多輪刺激后檢測CAR-T細(xì)胞中Tscm的富集情況。結(jié)果（圖4A）顯示，經(jīng)第一輪和第二輪刺激后，二甲雙胍誘導(dǎo)的CAR-T細(xì)胞的CD8＋T細(xì)胞中Tscm所占百分比均高于未經(jīng)二甲雙胍誘導(dǎo)的CAR-T細(xì)胞。這一結(jié)果提示二甲雙胍的誘導(dǎo)后的CAR-T細(xì)胞在長期抗原刺激下仍能保持Tscm的富集。

非放射性細(xì)胞毒性法檢測各組CAR-T細(xì)胞對RPMI-8226細(xì)胞的殺傷能力。結(jié)果（圖4B）顯示，在RPMI-8226細(xì)胞對CAR-T細(xì)胞進(jìn)行刺激前，在不同的靶效比中，與未經(jīng)二甲雙胍誘導(dǎo)的CAR-T細(xì)胞相比，二甲雙胍誘導(dǎo)后的CAR-T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力沒有明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）；經(jīng)二甲雙胍誘導(dǎo)的Tscm富集的CAR-T細(xì)胞在經(jīng)過RPMI-8226細(xì)胞第一輪和第二輪刺激后，在不同的靶效比中，與未經(jīng)二甲雙胍誘導(dǎo)的CAR-T細(xì)胞相比，其特異性殺傷能力差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。

Fig.2 The differentiation (A) and apoptosis rate (B) of chimeric antigen receptor (CAR)-T cells induced by different concentrations (0.125,0.25 and 0.5 mmol/L) of metformin (MET) were determined by flow cytometry (FCM).CAR-T cells treated with cytokines [recombinant human interleukin-7 (rhIL-7)+rhIL-21]: the control.*P＜0.05,**P＜0.01 (n=3).圖2 FCM法檢測不同濃度二甲雙胍處理后對CAR-T細(xì)胞中的記憶細(xì)胞分化（A）和凋亡（B）的影響

Fig.3 The effects of metformin (MET) on the percentage of stem-cell memory T cell (Tscm) in CD8＋ T cells after T cell activation at Day 6 and Day 8 were detected by flow cytometry (FCM).CAR-T cells treated with recombinant human interleukin-7 (rhIL-7) and rhIL-21: the control.*P＜0.05 (n=3).圖3 FCM檢測T細(xì)胞活化第6和第8天時二甲雙胍對CD8＋干細(xì)胞性記憶T細(xì)胞比例的影響

Fig.4 A: Experimental scheme for serial antigen stimulation by RPMI-8226 cells,and the effect of metformin (MET) on the percentage of stem-cell memory T cell (Tscm) in CD8＋ T cells after serial RPMI-8226 cells stimulation was determined by flow cytometry (FCM).Chimeric antigen receptor (CAR)-T cells treated with recombinant human interleukin-7 (rhIL-7) and rhIL-21: the control (n=3).B: The effect of MET on the cytotoxic activities of CAR-T cells before and after serial RPMI-8226 cells stimulation (Stim 1 and Stim 2) was tested by nonradioactive cytotoxicity assay.CAR-T cells treated with rhIL-7 and rhIL-21:the control;the untransduced T cells (UTD): the blank control (n=3).圖4 FCM法檢測二甲雙胍誘導(dǎo)對經(jīng)過連續(xù)2輪RPMI-8226細(xì)胞刺激的CAR-T細(xì)胞中CD8＋ Tscm所占比例的影響（A）以及非放射性細(xì)胞毒性法檢測RPMI-8226細(xì)胞刺激前和連續(xù)2輪刺激后二甲雙胍誘導(dǎo)對CAR-T細(xì)胞體外殺傷能力的影響（B）

2.4 二甲雙胍誘導(dǎo)的CAR-T細(xì)胞有效抑制小鼠MM移植瘤的生長

構(gòu)建小鼠MM細(xì)胞RPMI-8226皮下移植瘤模型：腫瘤細(xì)胞接種14 d后，將腫瘤平均體積約250 mm3的小鼠隨機(jī)分為3組，尾靜脈注射相應(yīng)的CAR-T細(xì)胞（圖5A），記錄小鼠腫瘤體積。結(jié)果（圖5B）顯示，相較于UTD組，二甲雙胍誘導(dǎo)的CAR-T治療組與非二甲雙胍誘導(dǎo)CAR-T治療組均能有效抑制MM移植瘤的生長（P＜0.000 1和P＜0.01），但二甲雙胍誘導(dǎo)前后的2個CAR-T治療組之間其的抑瘤效果，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。在腫瘤接種35 d后，二甲雙胍誘導(dǎo)組CAR-T細(xì)胞和非二甲雙胍誘導(dǎo)組CAR-T細(xì)胞的抑瘤率分別為83.14%和90.92%（圖5C）。此時UTD組小鼠的平均腫瘤體積超過2 000 mm3，繼續(xù)觀察剩余2組小鼠的腫瘤體積直到出現(xiàn)小鼠死亡，結(jié)果顯示雖然在UTD組小鼠死亡時二甲雙胍誘導(dǎo)組CAR-T細(xì)胞的抑瘤率略小于非誘導(dǎo)組CAR-T細(xì)胞的抑瘤率，但腫瘤細(xì)胞接種42 d后，二甲雙胍誘導(dǎo)的CAR-T治療組的抑瘤效果持續(xù)略優(yōu)于與非誘導(dǎo)CAR-T細(xì)胞組。

期間每周記錄小鼠體質(zhì)量，結(jié)果（圖5D）顯示每組之間小鼠體質(zhì)量沒有明顯變化，說明用二甲雙胍誘導(dǎo)的CAR-T細(xì)胞治療無明顯不良反應(yīng)。隨后，繼續(xù)觀察剩余治療組的小鼠生存期，結(jié)果（圖5E）顯示，二甲雙胍誘導(dǎo)的CAR-T治療組的小鼠與非二甲雙胍誘導(dǎo)的CAR-T細(xì)胞組小鼠相比具有一定的生存獲益（腫瘤細(xì)胞接種87 d后，二甲雙胍誘導(dǎo)CAR-T組1只小鼠死亡，非誘導(dǎo)組2只小鼠死亡），但2組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.5 經(jīng)二甲雙胍誘導(dǎo)的CAR-T細(xì)胞在荷瘤小鼠外周血中的存活數(shù)量增多

FCM法檢測經(jīng)尾靜脈注射CAR-T細(xì)胞14 d后的荷瘤小鼠外周血中CD4＋和CD8＋T細(xì)胞的數(shù)量。結(jié)果（圖5F）顯示，二甲雙胍誘導(dǎo)的CAR-T治療組的小鼠外周血中CD8＋T細(xì)胞數(shù)明顯多于二甲雙胍非誘導(dǎo)CAR-T細(xì)胞組（P＜0.05）。上述結(jié)果說明，雖然Tscm富集的CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤療效并未顯著優(yōu)于非誘導(dǎo)的CAR-T細(xì)胞，但其CD8＋T細(xì)胞在體內(nèi)存活數(shù)量明顯增多，提示從抗腫瘤持久性上，可能具有一定的生存獲益。

Fig.5 A: Schematic diagram of murine subcutaneous xenografts of multiple myeloma RPMI-8226 cells.The effect of MET-induced chimeric antigen receptor (CAR)-T cells on the tumor growth (B-C),body weight(D) and survival (E).The effect of MET-induced CAR-T cells on the number of lymphocytes in murine peripheral blood tested by flow cytometry (FCM) (F).*P＜0.05,**P＜0.01,****P＜0.000 1,vs UTD group [n=6(B-E) or n=3 (F)].圖5 NPG小鼠RPMI-8226細(xì)胞皮下移植瘤模型建立的示意圖（A），二甲雙胍誘導(dǎo)的CAR-T細(xì)胞對小鼠體內(nèi)腫瘤的抑制作用（B和C）、小鼠體質(zhì)量（D）和小鼠生存期的影響（E），F(xiàn)CM檢測二甲雙胍對小鼠外周血中淋巴細(xì)胞數(shù)量的影響（F）

3 討論

Tscm在抗腫瘤應(yīng)答的許多環(huán)節(jié)都起著非常重要的作用，Tscm具有高增殖和多向分化的特點。目前，在CAR-T細(xì)胞輸注之前將具有細(xì)胞毒性的CD8＋T細(xì)胞重編程為具有干性的細(xì)胞是細(xì)胞治療領(lǐng)域的熱點之一。大部分過繼性T細(xì)胞治療的臨床試驗均采用T細(xì)胞的集合而不是特定的T細(xì)胞亞群，所以在向患者輸注細(xì)胞治療產(chǎn)品之前，盡量提高Tscm比例非常必要。體外通過調(diào)節(jié)Notch或Wnt信號通路誘導(dǎo)Tscm富集的T細(xì)胞顯示出更強(qiáng)的抗腫瘤能力，優(yōu)于其他記憶T細(xì)胞亞群[19,23]。本研究的結(jié)果表明，二甲雙胍體外處理后的CAR-T細(xì)胞分化程度低，其Tscm亞群所占百分比升高，并且經(jīng)過體外靶細(xì)胞多輪刺激后仍能保持Tscm富集，提示二甲雙胍在體內(nèi)可能有利于CAR-T細(xì)胞的存活。

二甲雙胍促進(jìn)Tscm生成的具體機(jī)制尚未被完全闡明。在線粒體水平，二甲雙胍通過抑制ETC從而抑制氧化磷酸化，導(dǎo)致AMP水平升高及AMPK的磷酸化，激活后的AMPK能夠抑制mTOR活性[24-26]。AMPK-mTOR通路在許多生物過程中普遍存在，因此二甲雙胍的作用并不特異，其在不同細(xì)胞和不同器官中起不同作用。例如，二甲雙胍在固有和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著抑瘤作用，包括促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞向M1巨噬細(xì)胞極化、抑制骨髓來源的抑制性細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的作用、減少抗炎性細(xì)胞因子的生成和提高T細(xì)胞的應(yīng)答水平[22,27-30]。AMPK-mTOR通路也作用于T細(xì)胞代謝重編程，即將糖酵解轉(zhuǎn)化為氧化磷酸化，對于T細(xì)胞保持殺傷功能和記憶性非常重要[14,31]。AMPK激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1（peroxisome proliferatoractivated receptorγcoactivator-1，PGC-1），可以使腫瘤浸潤的細(xì)胞毒性T細(xì)胞進(jìn)行代謝重編程，增強(qiáng)線粒體功能和免疫應(yīng)答[32]。mTOR的抑制可促進(jìn)記憶T細(xì)胞形成過程中的氧化磷酸化，對維持線粒體正常功能非常關(guān)鍵[17,33-34]。上述研究結(jié)果提示，二甲雙胍可能通過激活的AMPK-mTOR通路來抑制T細(xì)胞糖酵解，從而增強(qiáng)T細(xì)胞記憶表型，然而二甲雙胍誘導(dǎo)后的CAR-T細(xì)胞的代謝改變?nèi)孕柽M(jìn)一步予以闡明。

本研究中的荷瘤小鼠模型實驗結(jié)果顯示，二甲雙胍誘導(dǎo)的CAR-T細(xì)胞能夠顯著抑制腫瘤生長，并保持更高的外周血CD8＋T細(xì)胞的存活，且能帶來一定程度的生存期受益，這一研究說明二甲雙胍能在保持CAR-T殺傷功能的同時延長CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的存活時間。然而本研究中也發(fā)現(xiàn)，在人MM免疫缺陷小鼠皮下移植瘤模型中，給予靶向BCMA的二代CAR-T細(xì)胞進(jìn)行治療，二甲雙胍誘導(dǎo)獲得的Tscm富集的CAR-T細(xì)胞雖能顯著抑制腫瘤生長，甚至清除腫瘤，但與誘導(dǎo)前的CAR-T細(xì)胞相比，未能顯示出更強(qiáng)的抗腫瘤能力，尤其在CAR-T細(xì)胞輸注的初期，二甲雙胍誘導(dǎo)后的CAR-T細(xì)胞抑瘤效果反而不及對照組。究其原因可能是二甲雙胍除了誘導(dǎo)Tscm產(chǎn)生外，在培養(yǎng)過程中也會導(dǎo)致CAR-T細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而可能影響CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤作用，但二甲雙胍對T細(xì)胞的作用仍需進(jìn)一步深入研究。雖然二甲雙胍體外可誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的Tscm，但這種誘導(dǎo)產(chǎn)生的Tscm可能與人體內(nèi)自然生成的Tscm功能上仍存在差異；即使未經(jīng)二甲雙胍誘導(dǎo)，CAR-T細(xì)胞中仍存在一定比例的Tscm，且具有顯著的抑瘤效果，由此推測本研究所使用的動物模型中，Tscm起效的比例可能存在一定的閾值，在此范圍內(nèi)CAR-T細(xì)胞抑瘤效果差異不顯著，但本研究數(shù)據(jù)仍然顯示Tscm富集的CAR-T細(xì)胞治療后的小鼠外周血中的CD8＋T細(xì)胞存活數(shù)量顯著增多，且治療的小鼠具有一定的生存獲益。因此，后續(xù)有必要針對不同靶點、不同腫瘤負(fù)荷、不同腫瘤模型來進(jìn)一步深入研究。

本研究中主要發(fā)現(xiàn)，在體外一定濃度的二甲雙胍可以誘導(dǎo)CAR-T細(xì)胞更多地分化為Tscm表型。有研究表明，二甲雙胍能延長部分腫瘤合并糖尿病患者的生存期[35]，且對腫瘤免疫微環(huán)境有積極地調(diào)節(jié)作用，因此推測體內(nèi)實驗中如果將二甲雙胍與CAR-T細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用于治療，是否也可誘導(dǎo)Tscm的富集進(jìn)而增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤能力？此外，也有研究報道，在動物實驗中口服高濃度二甲雙胍可抑制T細(xì)胞的增殖，對T細(xì)胞過繼治療產(chǎn)生不利影響[36]。因此，后續(xù)探究的重點是進(jìn)一步明確體內(nèi)不同濃度二甲雙胍對T細(xì)胞分化和功能的不同作用，探索聯(lián)合口服二甲雙胍是否能增強(qiáng)Tscm富集的CAR-T細(xì)胞的療效。

綜上，本研究提供了一種體外可以誘導(dǎo)Tscm富集的方式，證明了二甲雙胍體外可以誘導(dǎo)CAR-T細(xì)胞產(chǎn)生更多Tscm亞群，經(jīng)Tscm富集型CAR-T細(xì)胞治療后的荷瘤小鼠具有一定的生存優(yōu)勢，且外周血中CD8＋T細(xì)胞的存活數(shù)量顯著增多。整個實驗過程中未觀察到明顯不良反應(yīng)。本研究有望為更優(yōu)的CAR-T細(xì)胞制備提供一種新的途徑，具有一定的理論指導(dǎo)價值。