祝開忠，陳濤，陳煥雄，王挺銳，鐘貞浩

骨肉瘤是臨床上常見的惡性骨腫瘤之一，也是兒童腫瘤的主要類型之一，約占兒童所有惡性腫瘤的2.4%，約占所有原發(fā)性骨腫瘤的20%[1-3]。骨肉瘤是一種發(fā)生在骨骼中的疾病，其特征為異常生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛和疲勞等特征性癥狀。當(dāng)前治療這種惡性腫瘤的一個(gè)困難是骨肉瘤對(duì)傳統(tǒng)化療的耐藥性[4-6]。盡管非轉(zhuǎn)移性骨肉瘤的診斷和治療有所改善，但轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后較差，5 年患者生存率低于20%[7]。因此，闡明骨肉瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制尤為重要，以確定新的有效的靶向治療，可能對(duì)提高骨肉瘤患者的總生存率具有重要作用。

三結(jié)構(gòu)域（tripartite motif，TRIM）家族有超過(guò)70 多個(gè)成員，其中大部分蛋白屬于E3 泛素連接酶，其共同特征是具有鋅指結(jié)構(gòu)域（RING）。這些蛋白參與了多種復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，主要包括基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞膜修復(fù)、細(xì)胞骨架重塑和腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移等[8]。TRIM 家族成員中包括TRIM13、TRIM19 和TRIM25 等，已被證明在白血病、乳腺癌和前列腺癌等腫瘤發(fā)生過(guò)程中，通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)而發(fā)揮生物學(xué)活性[9-10]。TRIM59 作為一種表面分子，研究已經(jīng)證明其與較多腫瘤的進(jìn)展相關(guān)，其致癌特征于2011 年首次被研究者發(fā)現(xiàn)并報(bào)道[11]。此外，TRIM59 也已被確定為人類腫瘤發(fā)生過(guò)程中的生物標(biāo)志物之一，主要包括乳腺癌[12]、肺癌[13]和膀胱癌[14]等。研究表明，TRIM59 的生物學(xué)活性與p53 的調(diào)控密切相關(guān)，TRIM59 與p53 作用使其發(fā)生泛素化降解從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和遷移[15]。此外，在轉(zhuǎn)基因的前列腺癌小鼠模型中，觀察到TRIM59 通過(guò)與Ras信號(hào)通路的相互作用而發(fā)揮其原癌基因功能[16]。然而，TRIM59 在人類骨肉瘤中的確切作用仍有待進(jìn)一步予以闡明。β-catenin 信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生過(guò)程中起著關(guān)鍵性的作用，研究也證明了骨肉瘤中異常激活的β-catenin 信號(hào)通路與骨肉瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[17]，然而其異常激活機(jī)制尚有待進(jìn)一步予以研究闡釋。

本研究首先證實(shí)了TRIM59 在骨肉瘤組織及細(xì)胞中高表達(dá)，下調(diào)骨肉瘤細(xì)胞中TRIM59 的表達(dá)后，其侵襲及遷移能力明顯減弱；在機(jī)制方面，本研究證實(shí)了TRIM59 通過(guò)激活β-連環(huán)蛋白（β-catenin）/轉(zhuǎn)錄因子4（transcription factor 4，TCF4）信號(hào)通路，進(jìn)而影響骨肉瘤的侵襲及遷移。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本

收集2015 年1 月—2019 年12 月由海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院收治的53 例骨肉瘤患者的腫瘤組織及其相應(yīng)的非腫瘤組織（所有非腫瘤組織距離腫瘤邊緣＞3 cm）標(biāo)本。所有標(biāo)本都經(jīng)過(guò)病理醫(yī)生診斷，且所有患者術(shù)前均未接受化療，切除的新鮮組織立即放置于液氮中儲(chǔ)存。本研究經(jīng)過(guò)海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批同意，所有患者均已簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞、試劑和儀器

骨肉瘤細(xì)胞U2-OS、MG-63、143B 及正常成骨細(xì)胞hFOB1.19 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；所有的細(xì)胞均培養(yǎng)于含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的DMEM 培養(yǎng)液中，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中進(jìn)行。所有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均培養(yǎng)6 代以后使用。

FBS 及DMEM 培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)BI 公司。兔抗人TRIM59、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、β-catenin 和重組人TCF4 單克隆抗體，鼠抗人GAPDH（內(nèi)參照）單克隆抗體，以及辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗鼠IgG 和山羊抗兔IgG 均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。TRIM59-shRNA（shTRIM59）重組質(zhì)粒及其陰性對(duì)照（negative control，NC）-shRNA（shNC）重組質(zhì)粒均購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；shTRIM59 序列為5’-ACATTACAGGCAACCATTAAA-3’，shNC 序列為5’-AACAGTCGCGTTTGCGA CTGC-3’。轉(zhuǎn)染試劑LipofectAMINE 3000 購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司，反轉(zhuǎn)錄試劑 盒（PrimeScript RT Reagent Kit With gDNA Eraser）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒（TB Green Premix Ex Taq）均購(gòu)自日本TaKaRa 公司。TRIM59 及GAPDH基因引物由廣州銳博生物科技有限公司合成；TRIM59基因上游引物序列為5’-GGCTCTCTGTGATGTTGGVA-3’，下游引物序列為5’-TTCAAGCTGCTCTCGTA-3’；GAPDH基因上游引物序列為5’-CCTGCCG GTGACTAACCCTG-3’，下游引物序列為5’-AGTTAAAAGCAGCCCTGGTG-3’。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增儀為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品，光學(xué)顯微鏡為美國(guó)Thermo Scientific公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

裸鼠（ALB/c-nu/nu、雄性、5 周齡、體質(zhì)量為15～20 g）購(gòu)自湖南斯萊克斯景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK（湘）：2019-0004]。均飼養(yǎng)于無(wú)特定病原體（specific pathogen-free，SPF）級(jí)實(shí)驗(yàn)室。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)

收集骨肉瘤細(xì)胞和手術(shù)獲得的骨肉瘤組織標(biāo)本30 例，加入RIPA 裂解液裂解細(xì)胞，組織則先行勻漿處理，再加入RIPA 裂解液裂解組織細(xì)胞；加 入PMSF 處理后，12 000×g離心10 min 收集上清液，采用BCA 法對(duì)蛋白進(jìn)行定量。每組樣品取40 μg 蛋白加入蛋白質(zhì)緩沖液沸水浴處理10 min 使其變性后上樣，行10% SDS-PAGE 分離蛋白；將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，用含5% 脫脂牛奶的封閉液封閉處理1 h 后，加入一抗[兔抗人TRIM59 單克隆抗體和鼠抗人GAPDH（內(nèi)參照）單克隆抗體（體積稀釋比例均為1 ∶1 000）] 4 ℃孵育過(guò)夜，經(jīng)TBST 洗膜3 次后加入HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG 或山羊抗兔IgG 室溫孵育1 h，滴加電化學(xué)發(fā)光試劑，待顯影后拍照保存并分析檢測(cè)結(jié)果。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)

收集骨肉瘤細(xì)胞和手術(shù)獲得的骨肉瘤組織標(biāo)本30 例。用TRIzol 試劑裂解細(xì)胞和均漿處理后的組織，提取細(xì)胞和組織中的總RNA。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript RT Reagent Kit With gDNA Eraser）將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后，并進(jìn)一步用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒（TB Green Premix Ex Taq）進(jìn)行下一步PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，共40 個(gè)循環(huán)；引物序列見1.2 節(jié)。以2-ΔΔCt值表示各目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

新鮮的骨肉瘤及其相應(yīng)的非癌組織30 對(duì)經(jīng)10%甲醛溶液固定，石蠟包埋后進(jìn)行切片厚度為4 μm，將切片置于65 ℃的烤箱中烘烤3 h；進(jìn)行脫蠟和水化后，滴加含5%牛血清白蛋白的封閉液室溫封閉30 min；加入適量的一抗[兔抗人TRIM59 單克隆抗體（體積稀釋比例為1 ∶150）]4 ℃反應(yīng)過(guò)夜。滴加相應(yīng)的生物素標(biāo)記的二抗（工作液體積稀釋比例為1 ∶2 000）室溫孵育1 h，最后滴加HRP 標(biāo)記的鏈親和素，經(jīng)DAB 顯色后在光學(xué)顯微鏡下觀察染色情況（放大倍數(shù)為200倍）。TRIM59 主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中；根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞在總細(xì)胞中所占的百分比判定陽(yáng)性強(qiáng)度，弱陽(yáng)性（＋）為3 分，中陽(yáng)性（＋＋）為6 分，強(qiáng)陽(yáng)性（＋＋＋）為9 分。

1.7 構(gòu)建TRIM59 基因沉默表達(dá)的骨肉瘤細(xì)胞

采用病毒感染的方法將攜帶有特異性針對(duì)TRIM59 基因的shRNA（shTRIM59）或陰性對(duì)照shRNA（shNC）的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入骨肉瘤U2-OS 細(xì)胞；并進(jìn)一步采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法（檢測(cè)流程同1.5 節(jié)）和蛋白質(zhì)印跡法（檢測(cè)流程同1.4 節(jié)）檢測(cè)感染效率。

1.8 Transwell 小室實(shí)驗(yàn)

采用基質(zhì)膠包被（每孔約50 μL，靜置30 min）Transwell 小室。將TRIM59 基因沉默表達(dá)的U2-OS 細(xì)胞以及對(duì)照組細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～36 h 后，采用0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞經(jīng)清洗后重懸細(xì)胞。計(jì)數(shù)后按2×104個(gè)/孔的密度接種于小室的上室中（每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔）；繼續(xù)培養(yǎng)48 h，取出小室并小心將未穿過(guò)小室膜的細(xì)胞拭去，用PBS 清洗后加入甲醇溶液固定細(xì)胞20 min，待細(xì)胞固定后加入0.1%結(jié)晶紫進(jìn)行染色，于光學(xué)顯微鏡下（放大倍數(shù)為100 倍）觀察細(xì)胞染色情況及形態(tài)（每組細(xì)胞觀察4 個(gè)視野）并計(jì)數(shù)。

1.9 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)

將TRIM59 基因沉默表達(dá)的U2-OS 細(xì)胞以及對(duì)照組細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底部約80%～90%時(shí)，采用相同大小的槍頭（如200 μL）進(jìn)行劃痕處理（務(wù)必保證每孔劃痕粗細(xì)均勻）；用PBS 清洗脫落下來(lái)的細(xì)胞，并加入不含血清的培養(yǎng)液于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，在倒置光學(xué)顯微鏡下（放大倍數(shù)為100 倍）觀察劃痕愈合情況，并拍照記錄和分析愈合率。

后來(lái)，母親突然中風(fēng)，脾氣變得空前煩躁，經(jīng)常扔了手邊能扔的東西后號(hào)啕大哭。那時(shí)，父親會(huì)撿起被母親扔掉的東西，重新遞到母親手邊。他買了輪椅，推著母親出門散步，十幾年如一日。

1.10 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)沉默TRIM59 基因表達(dá)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

收集TRIM59 基因沉默表達(dá)的U2-OS 細(xì)胞以及對(duì)照組細(xì)胞，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)U2-OS細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin 和Vimentin 蛋白的表達(dá)水平，檢測(cè)流程同1.4 節(jié)。一抗分別為兔抗人E-cadherin、N-cadherin 和Vimentin 單克隆抗體，以GAPDH 為內(nèi)參照。

1.11 沉默TRIM59 基因表達(dá)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞在小鼠肺轉(zhuǎn)移中的影響

收集TRIM59 基因沉默表達(dá)的U2-OS 細(xì)胞以及對(duì)照組U2-OS 細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化計(jì)數(shù)后將細(xì)胞密度調(diào)整為1×107個(gè)/mL。每組6 只小鼠，每只裸鼠通過(guò)尾靜脈注射100 μL 骨肉瘤細(xì)胞懸液；于SPF 級(jí)別的環(huán)境下進(jìn)行飼養(yǎng)，4 周后將各組裸鼠通過(guò)安樂(lè)死的方法處死，取出裸鼠肺臟，石蠟包埋后行HE 染色檢測(cè)雙肺是否存在轉(zhuǎn)移腫瘤。

1.12 TRIM59 對(duì)骨肉瘤細(xì)胞中β-catenin/TCF4信號(hào)通路活性的影響

首先采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)TRIM59 基因沉默表達(dá)的U2-OS 細(xì)胞以及對(duì)照組U2-OS 細(xì)胞中β-catenin/TCF4 信號(hào)通路相關(guān)蛋白β-catenin 和TCF4 的表達(dá)水平，檢測(cè)流程同1.4 節(jié)。一抗分別為兔抗人β-catenin 和重組人TCF4 單克隆抗體，以GAPDH 為內(nèi)參照。

隨后，收集骨肉瘤143B 細(xì)胞，采用病毒感染的方法將TRIM59 過(guò)表達(dá)（overexpression，OE）重組質(zhì)粒及對(duì)照空載體（Vector）轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后采用β-catenin 信號(hào)通路抑制劑XAV939（10 μmol/L）處理TRIM59 過(guò)表達(dá)的143B 細(xì)胞24 h。采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)3 組細(xì)胞中β-catenin和TCF4 蛋白的表達(dá)水平。

最后，使用Transwell 小室及劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TRIM59 過(guò)表達(dá)和XAV939 抑制β-catenin/TCF4 信號(hào)通路活性后，143B 細(xì)胞侵襲（檢測(cè)流程同1.8 節(jié)）及遷移（檢測(cè)流程同1.9 節(jié)）能力的變化情況。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 及Prism 7 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所有的研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。癌及癌旁組織比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)；所有的實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)用表示，多組均數(shù)之間的比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨肉瘤組織及細(xì)胞中TRIM59 的表達(dá)升高

為闡明TRIM59 在骨肉瘤中的表達(dá)水平及作用，本研究首先檢測(cè)30 例人骨肉瘤組織及其癌旁正常組織中TRIM59 蛋白的表達(dá)水平。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果（圖1A）顯示，30 例骨肉瘤組織中23 例TRIM59 蛋白的表達(dá)水平明顯高于相應(yīng)的癌旁組織（P＜0.01），7 例癌組織中TRIM59蛋白的表達(dá)水平與癌旁組織無(wú)明顯差異。圖1A展示了6 例具有代表性的TRIM59 蛋白表達(dá)水平較高的病例。

進(jìn)一步采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)了30 例骨肉瘤組織中TRIM59 蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果（圖1C）同樣表明也證實(shí)了TRIM59 的表達(dá)明顯高于相應(yīng)的癌旁組織，其中腫瘤組織中TRIM59 的陽(yáng)性率為76.67%（23/30），而癌旁組織中陽(yáng)性率僅為16.67%（5/30）。

進(jìn)一步通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法（圖1D）及蛋白質(zhì)印跡法（圖1E）證實(shí)了，骨肉瘤U2-OS、MG-63 及143B 細(xì)胞中TRIM59 mRNA（P＜0.05）及蛋白的表達(dá)水平均明顯高于正常成骨細(xì)胞hFOB1.19。上述結(jié)果表明，TRIM59 在骨肉瘤細(xì)胞及組織中表達(dá)升高。

Fig.1 The expression level of tripartite motif family protein 59 (TRIM59) in osteosarcoma tissues and cells were up-regulated.A: Western blotting was used to detect the expression level of TRIM59 protein in tumor tissues (T) and adjacent-carcinoma tissues (N) (The TRIM59 protein expression level in six typical osteosarcoma tissues and adjacent-cancerous tissues was displayed) (**P＜0.01).B: The expression level of TRIM59 mRNA in osteosarcoma tissues was significantly higher than that in para-carcinoma tissues(**P＜0.01).C: The expression level of TRIM59 protein was detected by immunohistochemistry (IHC) (DAB staining,×100) (**P＜0.01).D and E: Western blotting and real-time fluorescent quantitative PCR were used to detect TRIM59 mRNA and protein expression levels in osteosarcoma U2-OS,MG-63,143B cells and normal osteoblast hFOB1.19 cells (as the control) [△P＜0.05,△△P＜0.05,the control group (n=3)].圖1 分別采用蛋白質(zhì)印跡法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法及免疫組織化學(xué)法檢測(cè)30 例骨肉瘤組織及其癌旁組織（A～C）以及骨肉瘤細(xì)胞中TRIM59 mRNA 和蛋白的表達(dá)水平（D～E）

2.2 下調(diào)骨肉瘤細(xì)胞中TRIM59 的表達(dá)水平后能抑制骨肉瘤細(xì)胞的侵襲及遷移能力

骨肉瘤的一個(gè)重要特征是其具有較高的轉(zhuǎn)移性，最近研究也證實(shí)了肺癌及胃癌中TRIM59 的表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。為了檢測(cè)TRIM59是否同樣影響骨肉瘤的轉(zhuǎn)移，本研究中采用病毒感染的方法將攜帶有shTRIM59 的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入骨肉瘤U2-OS 細(xì)胞，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 及蛋白質(zhì)印跡法驗(yàn)證其轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果提示TRIM59 mRNA（圖2A）及蛋白（圖2B）的表達(dá)水平均較對(duì)照組明顯下調(diào)（P均＜0.01）。

隨后采用Transwell 小室實(shí)驗(yàn)和劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了沉默TRIM59 表達(dá)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響。結(jié)果顯示，TRIM59 表達(dá)下調(diào)后U2-OS 細(xì)胞的侵襲（圖2C）和遷移（圖2D）能力均明顯降低（P均＜0.01）。

進(jìn)一步采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)了沉默TRIM59 表達(dá)對(duì)骨肉瘤U2-OS 細(xì)胞中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白E-cadherin、N-cadherin 和Vimentin 表達(dá)水平的影響，結(jié)果（圖2E）顯示，TRIM59 表達(dá)下調(diào)后U2-OS 細(xì)胞中N-cadherin和Vimentin 蛋白的表達(dá)水平明顯下調(diào)（P均＜0.05），而E-cadherin 蛋白的表達(dá)水平明顯上調(diào)（P＜0.05）。

對(duì)小鼠肺組織的HE 染色結(jié)果（圖2F）顯示，尾靜脈注射骨肉瘤U2-OS/shNC 和U2-OS/shTRIM59 細(xì)胞后，對(duì)照組6 只小鼠中5 只發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，shTRIM59 組6 只小鼠中僅有1 只發(fā)生肺轉(zhuǎn)移。以上結(jié)果表明，下調(diào)骨肉瘤細(xì)胞中TRIM59的表達(dá)水平后其體內(nèi)外轉(zhuǎn)移的能力明顯減弱。

Fig.2 Effect of down-regulation of tripartite motif family protein 59 (TRIM59) expression level on invasion and migration abilities of osteosarcoma U2-OS cells and its possible mechanism.A-B: Western blotting and real-time fluorescent quantitative PCR were used to verify the expression levels of TRIM59 protein and mRNA in U2-OS cells transfected with shTRIM59.C-D: After down-regulated the expression level of TRIM59 in osteosarcoma U2-OS cells,Transwell assay and Wound healing experiment were used to detect its invasion and migration abilities.E: Western blottign was used to detect the expression level of epithelialmesenchymal transition (EMT)-related proteins (N-cadherin,E-cadherin and Vimentin).F: HE staining result of lung tissues in six mice (tail vein injection of shNC/U2-OS or shTRIM59/U2-OS cells).U2-OS cells were transfected with shNC.*P＜0.05,**P＜0.01,vs shNC group (n=3).圖2 下調(diào)TRIM59 表達(dá)水平對(duì)骨肉瘤U2-OS 細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響及可能的作用機(jī)制

2.3 TRIM59 通過(guò)激活β-catenin 信號(hào)通路影響骨肉瘤細(xì)胞的侵襲及遷移

有研究報(bào)道，Wnt/β-catenin 信號(hào)通路活化是一個(gè)重要的致癌過(guò)程，在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展中起著關(guān)鍵性作用[18]。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果（圖3A）顯示，下調(diào)骨肉瘤U2-OS 細(xì)胞中TRIM59 蛋白的表達(dá)水平后，β-catenin 和TCF4 蛋白的表達(dá)水平均明顯下調(diào)（P均＜0.05）；這一結(jié)果提示下調(diào)TRIM59 表達(dá)后β-catenin/TCF4 信號(hào)通路明顯被抑制。

本研究中進(jìn)一步將攜帶有TRIM59 基因的重組過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)入骨肉瘤143B 細(xì)胞中，然后采用β-catenin 信號(hào)通路抑制劑XAV939（10 μmol/L）處理24 h。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果（圖3B）表明，上調(diào)TRIM59 表達(dá)后，β-catenin 信號(hào)通路相關(guān)蛋白β-catenin 和TCF4 的表達(dá)水平均明顯上調(diào)（P均＜0.05），但在加入XAV939 抑制劑后，激活的β-catenin 信號(hào)通路相關(guān)蛋白均恢復(fù)表達(dá)水平，即表達(dá)水平下調(diào)（P均＜0.05）。最后通過(guò)Transwell 小室（圖3C）及劃痕愈合實(shí)驗(yàn)（圖3D）表明，上調(diào)TRIM59 表達(dá)后骨肉瘤細(xì)胞的侵襲及遷移能力明顯增強(qiáng)（P均＜0.05），而加入XAV939 抑制劑后，其侵襲及遷移能力恢復(fù)（P均＜0.05）。上述結(jié)果表明，TRIM59 可能通過(guò)激活β-catenin/TCF 信號(hào)通路進(jìn)而影響骨肉瘤的侵襲及遷移。

Fig.3 Tripartite motif family protein 59 (TRIM59) affects the invasion and migration of osteosarcoma by activating β-catenin signaling pathway.A: The expression levels of TRIM59,β-catenin and transcription factor 4 (TCF4) proteins in osteosarcoma U2-OS cells transfected with shTRIM59 were detected by Western blotting.U2-OS cells were transfected with shNC as the control.B: The expression levels of TRIM59,β-catenin and TCF4 proteins in osteosarcoma 143B cells treated with TRIM59 overexpression(OE) recombinant plasmid (OE-TRIM59) or OE-TRIM59 combined with inhibitor XAV939 (10 μmol/L)were detected by Western blotting.C-D: Transwell assay and Wound healing experiment were used to detect invasion and migration abilities of 143B cells treated with OE-TRIM59 or OE-TRIM59 combined with inhibitor XAV939.143B cells were treated with empty vector as the control.*P＜0.05,**P＜0.01 (n=3).圖3 TRIM59 通過(guò)激活β-catenin 信號(hào)通路促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的侵襲及遷移

3 討論

骨肉瘤是青少年最常見的惡性腫瘤之一，據(jù)報(bào)道，美國(guó)每年有接近三分之一的骨肉瘤患者死亡，其中大多數(shù)是青少年，其主要原因是其惡性程度高，發(fā)現(xiàn)早期易發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移等[19-20]。因此，亟需進(jìn)一步的研究來(lái)幫助發(fā)現(xiàn)新的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物，以及更好地理解和掌握骨肉瘤發(fā)展的機(jī)制。

近年來(lái)，越來(lái)越多的修剪蛋白被研究者密切關(guān)注，據(jù)報(bào)道其對(duì)人類癌癥的進(jìn)展至關(guān)重要。例如，TRIM44和TRIM26的表達(dá)被研究者發(fā)現(xiàn)與肝癌患者的生存期密切相關(guān)[21-22]；TRIM29在膀胱癌中高表達(dá)且與預(yù)后密切相關(guān)，細(xì)胞中下調(diào)膀胱癌細(xì)胞中TRIM29的表達(dá)后期侵襲及遷移能力明顯減弱[23]。研究還表明在乳腺癌細(xì)胞中，TRIM37[24]和TRIM46[25]可以抑制癌細(xì)胞的增殖和腫瘤的生長(zhǎng)。TRIM59已被報(bào)道為多種人類癌癥的腫瘤啟動(dòng)子，包括肺癌、胃癌和宮頸癌等。ZHAN等[26]發(fā)現(xiàn)，TRIM59通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期蛋白B1（cyclin B1）/細(xì)胞分裂周期蛋白25同源蛋白C（cell division cycle 25 homolog C，CDC25C）/周 期蛋白依賴性激酶1（cyclin-dependent kinase 1，CDK1）蛋白進(jìn)而促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移和增殖。此外，有報(bào)道稱TRIM59與p53相互作用，促進(jìn)其在胃腫瘤中的泛素化和降解[15]。LI等[27]研究也證實(shí)，TRIM59在胰腺癌中高表達(dá)，其通過(guò)磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）/雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號(hào)軸調(diào)控胰腺癌的進(jìn)展。同樣，研究也證實(shí)β-catenin/TCF4信號(hào)通路異常激活與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，抑制β-catenin/TCF4信號(hào)通路的激活對(duì)腫瘤的治療具有重要意義，針對(duì)該信號(hào)通路的靶向抑制劑研究更是腫瘤領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

本研究中發(fā)現(xiàn)，TRIM59在骨肉瘤組織中mRNA和蛋白的表達(dá)水平均明顯上調(diào)。利用siRNA干擾技術(shù)沉默TRIM59表達(dá)后可抑制骨肉瘤U2-OS細(xì)胞的侵襲及遷移能力，而過(guò)表達(dá)TRIM59則可促進(jìn)U2-OS細(xì)胞的侵襲及遷移能力；隨后通過(guò)小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了TRIM59下調(diào)能夠抑制U2-OS細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。最后本研究在機(jī)制上證實(shí)了，TRIM59通過(guò)激活β-catenin信號(hào)通路進(jìn)而影響骨肉瘤的侵襲及遷移。綜上所述，本研究結(jié)果可能為骨肉瘤的靶向治療提供更多的初步理論依據(jù)。