潘若谷，李可為

膽管癌是一種起源于膽管上皮的惡性腫瘤，具有發(fā)病隱襲、進(jìn)展迅速、惡性程度高的特點(diǎn)。據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)的統(tǒng)計(jì)，膽管癌患者的5年生存率只有8%～10%。大部分經(jīng)臨床診斷的膽管癌患者均已處于中晚期，已失去了根治性手術(shù)切除的機(jī)會(huì)[1]，并且膽管癌還具有明顯的耐藥特征[2]。因此，探究膽管癌快速增殖背后的具體機(jī)制以及尋找潛在的治療靶點(diǎn)具有重要的科研和臨床意義。

NRF2是調(diào)控細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與機(jī)體的生理和病理過程[3]。眾多的研究指出，NRF2在包括肝癌、胃癌、食管癌、乳腺癌和宮頸癌等眾多惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲和增殖等過程中都發(fā)揮著十分重要的作用[4-8]。然而，縱觀近10年的研究，鮮有關(guān)于NRF2在膽管癌增殖中作用的相關(guān)報(bào)道。本研究旨在檢測(cè)NRF2在正常人體膽道組織和膽管癌組織中NRF2表達(dá)水平的差異，并通過siRNA沉默NRF2在人膽管癌細(xì)胞株RBE中的表達(dá)水平，探討NRF2表達(dá)對(duì)膽管癌細(xì)胞快速增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)

通過UALCAN數(shù)據(jù)庫（http://ualcan.path.uab.edu）檢索正常人膽道組織和膽管癌組織中NRF2 mRNA的表達(dá)水平。

1.2 細(xì)胞、試劑及儀器

人膽管癌細(xì)胞株RBE由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院膽胰外科保存并傳代，正常膽管上皮H69細(xì)胞由上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生化系保存并傳代。LipofectAMINE 2000和TRIzol試劑購自美國(guó)Invitrogen公司，tbGREEN實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，DMEM高糖培養(yǎng)液和胎牛血清購自上海源培生物科技股份有限公司；RIPA裂解液和BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒購自美國(guó)Thermo Fisher公司，CCK-8檢測(cè)試劑盒、DCFH-DA細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測(cè)探針試劑盒和鴉膽子苦醇試劑購自美國(guó)MCE公司，快速吉姆薩染色試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司；兔抗人NRF2和β-actin多克隆抗體購自美國(guó)CST公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗兔IgG購自美國(guó)Sigma公司。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)NRF2 mRNA的表達(dá)水平

分別將RBE細(xì)胞和正常膽管上皮H69細(xì)胞接種于直徑為10 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至60%～70%的融合度時(shí)收集細(xì)胞，采用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA；隨后用tbGREEN實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑檢測(cè)各組細(xì)胞中NRF2 mRNA的表達(dá)水平；反應(yīng)體積及PCR擴(kuò)增流程按試劑盒說明書中提供的流程進(jìn)行，分別以內(nèi)照參β-actin及GAPDH基因的Ct值，計(jì)算目的基因NRF2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。NRF2基因上游引物序列為5’-TCAGCGACGGAAAGAGTATGA-3’，下游引物序列為5’-CCACTGGTTTCTGACTGGATGT-3’；GAPDH基因上游引物序列為5’-GG AGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，下游引物序列為5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’；β-actin基因上游引物序列為5’-GGCATTC ACGAGACCACCTAC-3’，下游引物序列為5’-CGACATGACGTTGTTGGCATAC-3’。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)NRF2蛋白的表達(dá)水平

分別將RBE細(xì)胞和正常膽管上皮H69細(xì)胞接種于直徑為10 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至60%～70%融合度時(shí)收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液，在裂解液中充分裂解細(xì)胞后提取細(xì)胞總蛋白，并通過BCA蛋白定量試劑盒對(duì)蛋白濃度進(jìn)行檢測(cè)。2組細(xì)胞各取30 μg蛋白樣品進(jìn)行上樣，用分離膠濃度為10%的SDS-PAGE分離蛋白，隨后將分離后的蛋白通過濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。PVDF膜于含5%脫脂牛奶的封閉液中封閉1 h后，加入一抗[兔抗人NRF2及β-actin多克隆抗體（體積稀釋比例為1∶500）] 4 ℃孵育過夜，次日室溫條件下加入二抗[辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（體積稀釋比例為1∶1 000）]孵育1 h后，于凝膠成像儀下曝光顯影。

1.5 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染

RBE細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至約70%融合度時(shí)，采用LipofectAMINE 2000將特異性針對(duì)NRF2基因的2條siRNA（siNRF2-1和siNRF2-2）及陰性對(duì)照（negative control，NC）siRNA（siNC）轉(zhuǎn)入RBE細(xì)胞，轉(zhuǎn)染流程按試劑盒相關(guān)說明。隨后分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（實(shí)驗(yàn)流程同1.3節(jié)）和蛋白質(zhì)印跡法（實(shí)驗(yàn)流程同1.4節(jié)）檢測(cè)siRNA的沉默效率。siNRF2-1正義鏈序列為5’-AAGUUUUUUCUGUUUUUCCAG-3’，反義鏈序列為5’-GGAAAAACAGAAAAAACUU GA-3’；siNRF2-2正義鏈序列為5’-UCAUU UUCAAUAUUAAGACAC-3’，反義鏈序列為5’-GUCUUAAUAUUGAAAAUGACA-3’；siNC

正義鏈序列為5’-UCAACUUCUGUCAGUUUG GCU-3’，反義鏈序列為5’-CCAAACUGACAG AAGUUGACA-3’。

1.6 DCFH-DA法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的含量

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的siNRF2-1組、siNRF2-2組和siNC組RBE細(xì)胞接種于96孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至合適密度后，采用DCFH-DA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的含量，實(shí)驗(yàn)流程按照試劑盒的操作說明進(jìn)行。

1.7 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的siNRF2-1組、siNRF2-2組和siNC組RBE細(xì)胞，以2 000個(gè)/孔的密度接種于96孔板中。分別于24、48、72和96 h時(shí)，加入CCK-8試劑，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀波長(zhǎng)450 nm處檢測(cè)各組細(xì)胞的D值，并計(jì)算相對(duì)生存活力表示細(xì)胞的增殖情況，具體檢測(cè)流程參閱CCK-8試劑盒流程說明。

1.8 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)

收集生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的siNRF2-1組、siNRF2-2組和siNC組RBE細(xì)胞，以500個(gè)/孔的密度接種至96孔板中。用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，7 d后更換新鮮培養(yǎng)液并繼續(xù)培養(yǎng)7 d。14 d后，除去所有培養(yǎng)液，采用快速吉姆薩染色試劑盒進(jìn)行克隆染色，具體流程按試劑盒操作說明。記錄肉眼可見的克隆數(shù)（獨(dú)立不連續(xù)的肉眼可見的克隆球）并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.9 鴉膽子苦醇對(duì)RBE細(xì)胞增殖的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RBE細(xì)胞，以4×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)分為4組，siNRF2-1組、siNRF2-2組、siNC組和siNC＋鴉膽子苦醇組；siNC組RBE細(xì)胞培養(yǎng)24 h后除去培養(yǎng)液，加入鴉膽子苦醇（100 μL/孔）。分別于24、48、72和96 h時(shí)，采用CCK-8試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖情況，實(shí)驗(yàn)流程同1.7節(jié)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism version 8.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，計(jì)量資料以表示。多組間比較采用多因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NRF2在膽管癌中高表達(dá)

通過在UALCAN數(shù)據(jù)庫中檢索并分析比對(duì)正常膽道組織（9例）和膽管癌組織（36例）中NRF2的表達(dá)情況。結(jié)果（圖1A）顯示，膽管癌組織組中NRF2的表達(dá)水平相較正常膽道組織組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)正常膽管上皮H69細(xì)胞和膽管癌RBE細(xì)胞中NRF2的表達(dá)情況。結(jié)果（圖1B和圖1C）顯示，H69細(xì)胞中NRF2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均低于RBE細(xì)胞（P均＜0.01）。這一結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中檢索獲得的結(jié)果一致，提示膽管癌細(xì)胞確實(shí)具有高表達(dá)NRF2的特點(diǎn)。

2.2 采用siRNA沉默RBE細(xì)胞中NRF2的表達(dá)水平及對(duì)RBE細(xì)胞中ROS含量的影響

為了進(jìn)一步探究NRF2對(duì)膽管癌的增殖能力是否具有重要的影響，本研究采用siRNA沉默RBE細(xì)胞中NRF2的表達(dá)水平。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（圖2A）和蛋白質(zhì)印跡法（圖2B）檢測(cè)結(jié)果顯示，siNRF2-1和siNRF2-2組RBE細(xì)胞中NRF2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均明顯下調(diào)（P均＜0.05）。這一結(jié)果提示，本研究中設(shè)計(jì)的2條siNRF2-1和siNRF2-2均能夠有效沉默RBE細(xì)胞內(nèi)NRF2基因的表達(dá)水平。

由于NRF2是氧化應(yīng)激時(shí)參與調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄和維持細(xì)胞內(nèi)ROS水平穩(wěn)定的重要轉(zhuǎn)錄因子[9]，因此細(xì)胞內(nèi)的ROS水平會(huì)伴隨NRF2表達(dá)水平的改變而發(fā)生改變。DCFH-DA法檢測(cè)結(jié)果（圖2C）顯示，當(dāng)敲低NRF2基因的表達(dá)水平后，2組RBE細(xì)胞內(nèi)ROS水平均出現(xiàn)了明顯回升（P＜0.05和P＜0.01）。這一結(jié)果進(jìn)一步說明，有效敲低RBE細(xì)胞內(nèi)NRF2的表達(dá)水平后能明顯提高細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。

Fig.1 High expression of nuclear factor E2-related factor 2 (NRF2) was observed in cholangiocarcinoma.A: The expression level of NRF2 mRNA in bile duct and cholangiocarcinoma was analyzed by UALCAN database.B: The expression level of NRF2 mRNA in normal bile duct epithelial H69 cells and cholangiocarcinoma RBE cells was detected by real-time fluorescent quantitative PCR (n=3).C: The expression levels of NRF2 protein in H69 cells and RBE cells was detected by Western blotting.*P＜0.01,***P＜0.001 (n=3).圖1 NRF2在膽管癌中高表達(dá)

2.3 NRF2是膽管癌細(xì)胞增殖的重要調(diào)節(jié)因素

在明確siRNA能夠有效敲減RBE細(xì)胞內(nèi)NRF2基因的表達(dá)水平后，本研究進(jìn)一步對(duì)NRF2對(duì)膽管癌細(xì)胞的增殖能力是否產(chǎn)生重要的影響展開研究。CCK-8法檢測(cè)結(jié)果（圖3A）顯示，伴隨NRF2表達(dá)水平的下調(diào)（siNRF2-1和siNRF2-2組RBE細(xì)胞），膽管癌細(xì)胞的增殖能力出現(xiàn)了明顯下降（P均＜0.01）。

進(jìn)一步通過平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，NRF2敲低的膽管癌細(xì)胞（siNRF2-1和siNRF2-2組RBE細(xì)胞）相較于對(duì)照組RBE細(xì)胞，其形成的克隆數(shù)量明顯減少（圖3B）。這一結(jié)果提示，沉默NRF2表達(dá)能抑制RBE細(xì)胞的增殖能力，NRF2確實(shí)對(duì)膽管癌的增殖產(chǎn)生了重要的影響。

2.4 鴉膽子苦醇能夠有效抑制膽管癌細(xì)胞的增殖

鴉膽子苦醇是一類苦木內(nèi)酯類化合物，能夠通過靶向抑制NRF2的活性而發(fā)揮抗癌作用[12]。已有研究報(bào)道，鴉膽子苦醇能夠抑制部分腫瘤的增殖[13]，但目前尚未有該藥物應(yīng)用于膽管癌治療細(xì)胞的報(bào)道。因此，本研究進(jìn)一步旨在對(duì)該藥物是否基于抑制NRF2的表達(dá)從而發(fā)揮治療膽管癌的效果展開探討。

CCK-8法檢測(cè)結(jié)果（圖4A）顯示，相較于siNC組，siNC＋鴉膽子苦醇組RBE細(xì)胞的增殖能力被明顯抑制（P＜0.01）；但與siNRF2-1組和siNRF2-2組細(xì)胞相比，siNC＋鴉膽子苦醇組RBE細(xì)胞的活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；這一結(jié)果提示，鴉膽子苦醇能抑制RBE細(xì)胞的增殖。

Fig.2 Effect of silencing nuclear factor E2-related factor 2 (NRF2) gene in cholangiocarcinoma RBE cells by siRNA and the effect on reactive oxygen species (ROS) content in RBE cells.A: The expression level of NRF2 mRNA in RBE cells transfected with siRNA targeting NRF2 gene (siNRF2-1 and siNRF2-2) was detected by real-time quantitative PCR.B: The expression level of NRF2 protein in RBE cells transfected with siNRF2-1 and siNRF2-2 was detected by Western blotting.C: The ROS level in RBE cells transfected with siNRF2-1 and siNRF2-2 was detected by DC-FHDA method.RBE cells transfected with negative control siRNA (siNC) were taken as the control.*P＜0.05,**P＜0.01 (n=3).圖2 siRNA有效沉默膽管癌RBE細(xì)胞中NRF2基因的表達(dá)水平及對(duì)RBE細(xì)胞中ROS含量的影響

Fig.3 The proliferation of RBE cells with silencing of nuclear factor E2-related factor 2 (NRF2) gene was detected by CCK-8 (A) and plate clone formation experiment (B),respectively.siNRF2-1 and siNRF2-2:RBE cells were transfected with siRNA targeting NRF2 gene (siNRF2-1 and siNRF2-2);RBE cells transfected with negative control siRNA (siNC) were taken as the control.**P＜0.01 (n=3).圖3 分別采用CCK-8法（A）和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)（B）檢測(cè)沉默NRF2基因表達(dá)對(duì)膽管癌RBE細(xì)胞增殖能力的影響

實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)結(jié)果（圖4B）顯示，相較于siNC組，siNC＋鴉膽子苦醇組RBE細(xì)胞中NRF2 mRNA的表達(dá)水平明顯下調(diào)（P＜0.01）。

進(jìn)一步采用DCFH-DA法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的水平，結(jié)果（圖4C）顯示，相較于siNC組，siNC＋鴉膽子苦醇組RBE細(xì)胞中ROS的含量明顯提高（P＜0.01）。這一結(jié)果提示，鴉膽子苦醇能有效提高RBE細(xì)胞內(nèi)的ROS含量。綜合上述結(jié)果，本研究認(rèn)為鴉膽子苦醇能夠通過抑制膽管癌細(xì)胞RBE內(nèi)NRF2的表達(dá)水平從而發(fā)揮抑制膽管癌細(xì)胞增殖的效果。

Fig.4 Effects of brusatol on proliferation and reactive oxygen species (ROS) content of cholangiocarcinoma RBE cells.A: The proliferation of RBE cells was detected by CCK-8 method.B: The expression level of nuclear factor E2-related factor 2 (NRF2) mRNA in RBE cells was detected by realtime fluorescent quantitative PCR.C: The restoration of cellular ROS was detected by DC-FHDA assay.siNC: RBE cells were transfected with negative control siRNA;siNRF2-1 and siNRF2-2: RBE cells were transfected with siRNA targeting NRF2 gene;siNC+brusatol: RBE cells were transfected with siNC combined with brusatol.**P＜0.01 (n=3).圖4 鴉膽子苦醇對(duì)膽管癌RBE細(xì)胞增殖及ROS含量的影響

3 討論

膽管癌是一類源自膽管上皮的惡性腫瘤，具有發(fā)病隱襲、惡性程度高、進(jìn)展迅速的特點(diǎn)[1,12]。有研究顯示，膽管癌的治療主要包括手術(shù)治療和化學(xué)藥物治療[13]，由于被臨床診斷的患者大多處于中晚期和晚期且常伴有肝內(nèi)轉(zhuǎn)移從而失去了手術(shù)切除的機(jī)會(huì)，因此化學(xué)藥物治療成為了眾多膽管癌患者的重要治療方式之一[14]。然而，由于膽管癌的異質(zhì)性極強(qiáng)，因此對(duì)以吉西他濱為一線治療藥物的化療方案表現(xiàn)出了人群的耐藥效應(yīng)[15]。因此，闡明膽管癌增殖的重要調(diào)控因素并探索開發(fā)新的治療策略對(duì)攻克膽管癌具有很重要的意義。

NRF2是一種氧化應(yīng)激條件下起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子，能夠在受到ROS刺激時(shí)啟動(dòng)眾多抗氧化反應(yīng)元件（antioxidative response elements，ARE）的轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮抵抗氧化應(yīng)激的重要作用[16]。通常情況下，NRF2通過與KEAP1形成復(fù)合體并降解的形式而處于低表達(dá)狀態(tài)[9]。既往的研究大量文獻(xiàn)報(bào)道提示，包括肝癌、胃癌、肺癌和乳腺癌在內(nèi)的眾多類型腫瘤中都檢測(cè)到了NRF2表達(dá)水平增高或被異常激活[3,17-19]，然而膽管癌中NRF2的表達(dá)是否發(fā)生改變卻鮮有報(bào)道。本研究中發(fā)現(xiàn)，膽管癌中NRF2的表達(dá)水平與其他腫瘤出現(xiàn)了類似的升高現(xiàn)象，這意味著NRF2可能也在膽管癌中發(fā)揮著重要的作用。由于NRF2是細(xì)胞控制氧化還原平衡的重要環(huán)節(jié)，因此當(dāng)腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)NRF2的表達(dá)水平增高時(shí)也通常會(huì)伴有細(xì)胞內(nèi)ROS水平的顯著降低。ROS作為一類性質(zhì)極其活潑同時(shí)又廣泛參與細(xì)胞生命活動(dòng)的小分子物質(zhì)同樣會(huì)對(duì)相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)生重要的影響[8,20]。本研究發(fā)現(xiàn)，在膽管癌RBE細(xì)胞內(nèi)NRF2表達(dá)水平高表達(dá)的情況下，其細(xì)胞內(nèi)ROS的含量明顯減低，這與之前本課題組的推測(cè)是相符的。同時(shí)，大量的研究指出ROS能夠?qū)Ω伟?、胃癌和食管癌等惡性腫瘤的增殖產(chǎn)生抑制作用，由此推測(cè)降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平可能也對(duì)膽管癌細(xì)胞的增殖產(chǎn)生了一定的促進(jìn)作用，由于本研究著眼于鴉膽子苦醇與NRF2之間的相互作用是否能夠改善膽管癌的進(jìn)展，因此并未對(duì)下降的細(xì)胞內(nèi)ROS水平是否對(duì)膽管癌的增殖產(chǎn)生了影響進(jìn)行探索，相關(guān)研究會(huì)在未來進(jìn)一步予以完善。

鴉膽子苦醇是近年來新被發(fā)現(xiàn)的一種抗癌藥物，因其能夠靶向NRF2從而發(fā)揮抗腫瘤生長(zhǎng)的作用[21]。ZHOU等[10]研究發(fā)現(xiàn)，鴉膽子苦醇能夠有效抑制胰腺癌的進(jìn)展、PARK等[22]則發(fā)現(xiàn)，鴉膽子苦醇能夠強(qiáng)力抑制結(jié)腸癌的進(jìn)展。本研究中發(fā)現(xiàn)，鴉膽子苦醇同樣能夠通過靶向抑制NRF2的表達(dá)從而抑制膽管癌的增殖并有效提高了膽管癌細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，具有作為治療膽管癌的新臨床治療方案的可能。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)膽管癌具有高表達(dá)NRF2的特點(diǎn)并且NRF2的高表達(dá)是膽管癌強(qiáng)增殖能力的重要原因。鴉膽子苦醇能夠通過抑制膽管癌細(xì)胞內(nèi)NRF2的表達(dá)從而發(fā)揮抑制膽管癌增殖的作用，具有應(yīng)用于臨床治療的潛在可能。