羅文欽，楊茹

髓母細(xì)胞瘤是兒童中最常見的腦腫瘤之一，是一種發(fā)生在小腦蚓部小細(xì)胞分化不良的惡性腫瘤[1-2]，其生物學(xué)機(jī)制尚未完全闡明。在髓母細(xì)胞瘤中，微環(huán)境的細(xì)胞分群與髓母細(xì)胞瘤預(yù)后關(guān)系的研究更是鮮有報(bào)道。本課題組前期已采用轉(zhuǎn)基因小鼠Patched＋/-髓母細(xì)胞瘤模型，研究了髓母細(xì)胞瘤發(fā)生早期Sonic hedgehog（SHH）信號通路對小腦顆粒神經(jīng)元前體細(xì)胞（granule neuron progenitor，GNP）分裂模式的調(diào)控作用[3]，并發(fā)現(xiàn)對稱不對稱分裂關(guān)鍵調(diào)控因子和抑癌基因Trim32通過結(jié)合并降解SHH信號通路中的關(guān)鍵因子Gli1[4]，從而抑制髓母細(xì)胞瘤的進(jìn)展。隨著單細(xì)胞測序技術(shù)的迅速發(fā)展，為研究腫瘤微環(huán)境的細(xì)胞分群與髓母細(xì)胞瘤的關(guān)系提供了技術(shù)支撐。

世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）將髓母細(xì)胞瘤歸類為Ⅳ級腫瘤。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基于高通量的基因測序、基因表達(dá)譜及基因拷貝數(shù)異常的分析，WHO（2016年）中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類將髓母細(xì)胞瘤分為4 種不同的亞型：SHH型、WNT型、3型（Group3）和4型（Group4）[5]。其中，SHH型髓母細(xì)胞瘤是目前研究最廣泛的一種分型，其根據(jù)SHH信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路命名[6]。有研究采用譜系追蹤技術(shù)證實(shí)，SHH型髓母細(xì)胞瘤是由特異性表達(dá)Math1基因的GNP惡性轉(zhuǎn)化而來[7-8]。GNP的增殖受SHH信號通路的調(diào)控，在小腦發(fā)育早期，浦肯野纖維細(xì)胞分泌SHH糖蛋白，與GNP表面的Patched受體結(jié)合，解除其對下游信號接收器Smoothened（SMO）蛋白的抑制作用，激活Gli家族的轉(zhuǎn)錄因子（Gli1等），促進(jìn)下游與增殖相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而誘導(dǎo)GNP大量增殖[9]。當(dāng)編碼Patched受體和SMO蛋白的基因發(fā)生突變，SHH信號通路被異常激活，可導(dǎo)致GNP惡性轉(zhuǎn)化形成髓母細(xì)胞瘤。其中，Patched基因純合突變小鼠，因神經(jīng)系統(tǒng)、心臟和其他器官缺陷，在胚胎發(fā)育期即死亡，而Patched基因雜合突變小鼠（Patched＋/-）在出生3～6個(gè)月后，14%～20%的小鼠可產(chǎn)生髓母細(xì)胞瘤，是研究髓母細(xì)胞瘤的一個(gè)重要模型。Math1基因啟動子驅(qū)動的Cre重組酶轉(zhuǎn)基因小鼠（Math1-Cre/SmoM2，M-Smo）可使SMO基因的突變特異地發(fā)生在GNP，小鼠在出生12 d（P12）后100%會發(fā)生髓母細(xì)胞瘤[10]，也是研究髓母細(xì)胞瘤的一個(gè)重要模型。

近年來，隨著單細(xì)胞RNA測序技術(shù)（singlecell RNA sequencing，scRNA-seq）的蓬勃發(fā)展，通過該技術(shù)可以從單細(xì)胞水平獲得基因表達(dá)譜，了解細(xì)胞的異質(zhì)性，發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞類型、相關(guān)細(xì)胞的標(biāo)志基因及新細(xì)胞類型的潛在功能[11-14]。有研究利用scRNA-seq技術(shù)，探索小鼠出生前后小腦細(xì)胞的差異，通過與髓母細(xì)胞瘤患者RNA表達(dá)數(shù)據(jù)的比對分析，證實(shí)腫瘤細(xì)胞在基因表達(dá)譜上更類似于小鼠出生后早期的GNP，為臨床診斷和治療提供了新的角度[15-16]。另有研究表明，M-SMO轉(zhuǎn)基因小鼠形成的髓母細(xì)胞瘤在采用SMO蛋白抑制劑維莫德吉（vismodegib）治療后，增殖活躍的顆粒神經(jīng)元前體細(xì)胞樣（GNPlike）腫瘤細(xì)胞所占的比例明顯降低，通過比較治療組和對照組的腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)差異，即可找出治療腫瘤干細(xì)胞的靶基因[10]。然而，這些髓母細(xì)胞瘤的scRNA-seq研究仍旨在探索腫瘤細(xì)胞本身，而忽視對腫瘤微環(huán)境細(xì)胞的探索。

腫瘤微環(huán)境在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，與腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和耐藥等行為密切相關(guān)[17-18]。有研究表明，腫瘤浸潤性免疫細(xì)胞如淋巴細(xì)胞能夠影響患者的預(yù)后，并且可以預(yù)測患者對化療的敏感性[19]。在髓母細(xì)胞瘤中，有研究指出SHH型腫瘤微環(huán)境較其他3種類型的腫瘤微環(huán)境可富集更多的腫瘤相關(guān)性巨噬細(xì)胞，提示這類細(xì)胞是靶向治療的關(guān)鍵對象[20]；此外，星形膠質(zhì)細(xì)胞的存在可促進(jìn)髓母細(xì)胞瘤的發(fā)生和發(fā)展[21]，上述研究皆提示，靶向干預(yù)腫瘤微環(huán)境是治療髓母細(xì)胞瘤的熱點(diǎn)。然而，當(dāng)前在髓母細(xì)胞瘤中卻依然缺乏靶向干預(yù)腫瘤微環(huán)境的有效手段，可能是因?yàn)槿狈λ枘讣?xì)胞瘤微環(huán)境的全面認(rèn)識。因此，認(rèn)識髓母細(xì)胞瘤微環(huán)境的細(xì)胞分群，有助于探討不同微環(huán)境細(xì)胞與髓母細(xì)胞瘤患者預(yù)后的關(guān)系，推測其對腫瘤發(fā)生和發(fā)展的影響，并揭示其作為靶向治療目標(biāo)的潛能。

本研究旨在整合正常小鼠和髓母細(xì)胞瘤小鼠模型，包括使用vismodegib治療腫瘤小鼠的scRNA-seq數(shù)據(jù)[10]，探討不同狀態(tài)下微環(huán)境細(xì)胞比例的變化情況。結(jié)合患者的RNA表達(dá)數(shù)據(jù)[22]進(jìn)行分析，揭示不同微環(huán)境細(xì)胞群與患者預(yù)后及臨床特征之間的關(guān)系，推測不同微環(huán)境細(xì)胞群對腫瘤發(fā)生和發(fā)展的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

用于單細(xì)胞測序的5只C57BL/6J小鼠分別為3只Patched＋/-轉(zhuǎn)基因小鼠和2只野生型（wild-type，WT）小鼠。Patched＋/-轉(zhuǎn)基因小鼠購自美國Jackson實(shí)驗(yàn)室（貨號：003081），WT小鼠購自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動物有限公司[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2018-0004]。髓母細(xì)胞瘤樣本取自Patched＋/-轉(zhuǎn)基因小鼠培育50周后形成的腫瘤，WT小鼠的小腦組織取自出生后第7天（P7）以及第11天（P11）的小鼠。本研究中使用的小鼠均飼養(yǎng)在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院無特定病原體（specific pathogenfree，SPF）級動物中心[動物飼養(yǎng)許可證號：SYXK（滬）2016-0012]。飼養(yǎng)溫度和濕度統(tǒng)一控制，所有動物實(shí)驗(yàn)方案都通過仁濟(jì)醫(yī)院動物研究倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 試劑及儀器

DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自美國Gibco公 司，2×Taq Master Mix購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。EDTA溶液、TAE緩沖液和Tris-HCl（pH值＝5.5）緩沖液購自生工生物工程（上海）股份有限公司。胰蛋白酶、膠原酶、DNA酶和淋巴細(xì)胞分離液購自中國碧云天生物技術(shù)公司。

PCR儀（型號：T100TMThermal Cycler）為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品，CO2培養(yǎng)箱（型號：Thermo3111）為美國Thermo Fish公司產(chǎn)品，冷凍離心機(jī)（型號：Centrifuge 5424R）為購自德國Eppendof公司產(chǎn)品。

10×Genomics是一個(gè)美國基因測序技術(shù)服務(wù)平臺，主要為用戶提供Chromium系統(tǒng)，以單個(gè)細(xì)胞分辨率復(fù)制數(shù)字分析，適用于基因表達(dá)譜分析、單細(xì)胞免疫分析、外顯子組測序和基因組測序等領(lǐng)域。本研究采用的10×Genomics平臺服務(wù)由晶能生物技術(shù)（上海）有限公司提供，使用的RNA測序儀是美國Illumina公司的NovaSeq 6000測序儀。

1.3 單細(xì)胞RNA測序流程

本研究中的單細(xì)胞RNA測序流程包括單細(xì)胞懸液制備、建庫以及上機(jī)測序，詳細(xì)流程參見10×Genomics官 網(wǎng)https://www.10×genomics.com。流程如下：（1）制備單細(xì)胞懸液，將小腦組織轉(zhuǎn)移至裝有1 mL DMEM培養(yǎng)液的1.5 mL離心管中，先加入100×膠原酶和100×DNA酶15 μL，隨后加入470 μL DMEM培養(yǎng)液補(bǔ)齊至1.5 mL并蓋緊離心管，置于37 ℃培養(yǎng)箱中，期間每隔10 min上下顛倒搖晃1 min；1 h后從培養(yǎng)箱內(nèi)拿出，用200 μL槍頭輕柔吹打2～3 min，350×g離心5 min，除去上清液。隨后加入含EDTA的1 mL胰蛋白酶重懸沉淀，采用200 μL槍頭輕柔吹打使細(xì)胞散開，繼續(xù)置于37 ℃培養(yǎng)箱中消化10 min；之后350×g離心5 min，除去上清液。用600 μL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液重懸沉淀，并將槍頭插入管底，緩慢加入300 μL淋巴細(xì)胞分離液，此時(shí)離心管內(nèi)樣本分為2層，上層為細(xì)胞懸液，下層為淋巴細(xì)胞分離液，注意不要晃蕩離心管，保持液面分層。之后800×g離心20 min，注意此時(shí)需使用水平轉(zhuǎn)子，并設(shè)置離心機(jī)加速度和減速度均為2，防止上下層溶液相混。離心結(jié)束后可發(fā)現(xiàn)離心管中樣本分為3層，最下層為紅細(xì)胞和死細(xì)胞碎片，中間層是淋巴細(xì)胞分離液和少量的活細(xì)胞，最上層主要為活細(xì)胞懸液，即為實(shí)驗(yàn)需要的單細(xì)胞懸液。（2）建庫，本研究采用基于10×Genomics的ChromiumTMSingle Cell 3’ Solution進(jìn)行建庫，該方法能夠一次性分離、標(biāo)記500～10 000個(gè)單細(xì)胞，并進(jìn)行無偏的3’端基因表達(dá)信息的建庫，具有操作簡捷，分辨率高，能夠比較單個(gè)細(xì)胞間的轉(zhuǎn)錄組差異等優(yōu)點(diǎn)。（3）上機(jī)測序，構(gòu)建好的文庫通過NovaSeq 6000（Illumina）測序儀進(jìn)行測序，測序數(shù)據(jù)量為每個(gè)樣品約400 M reads。

本研究的單細(xì)胞RNA數(shù)據(jù)已上傳至基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO），具體網(wǎng)址為https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/ac-c.cgi?acc＝GSE156633。

1.4 M-SMO轉(zhuǎn)基因小鼠和髓母細(xì)胞瘤臨床標(biāo)本

M-SMO轉(zhuǎn)基因小鼠的單細(xì)胞RNA數(shù)據(jù)從GEO數(shù)據(jù)庫（GSE129730）中下載，共包括10只M-SMO轉(zhuǎn)基因小鼠形成的髓母細(xì)胞瘤樣本。10只小鼠被隨機(jī)分為2組：一組使用SMO抑制劑維莫德吉（vismodegib）進(jìn)行治療，一組使用空載體（vector）進(jìn)行對照研究。該數(shù)據(jù)庫對應(yīng)的研究已證實(shí)，與對照組相比，vismodegib治療組小鼠髓母細(xì)胞瘤中GNP-like腫瘤細(xì)胞所占百分比明顯降低，表明藥物治療對腫瘤細(xì)胞有效。

髓母細(xì)胞瘤患者的RNA表達(dá)數(shù)據(jù)從GEO數(shù)據(jù)庫（GSE124814）中下載，該數(shù)據(jù)共整合了23個(gè)數(shù)據(jù)集中SHH型的髓母細(xì)胞瘤患者的RNA表達(dá)數(shù)據(jù)，包括405例患者，臨床信息詳見表1。

表1 GEO數(shù)據(jù)庫（GSE124814）獲得的405例SHH型髓母細(xì)胞瘤患者的臨床特征Table 1 The characteristics of 405 patients with SHH medulloblastoma from Gene Expression Omnibus (GEO)dataset (GSE124814)(N＝405)

1.5 單細(xì)胞RNA數(shù)據(jù)降維分析

本研究采用R語言軟件Seurat程序包的單細(xì)胞分析流程對scRNA-seq數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行分析。（1）創(chuàng)建Seurat對象：采用Seurat程序包中Read10×函數(shù)讀取scRNA-seq數(shù)據(jù)矩陣，創(chuàng)建Seurat對 象；（2）數(shù)據(jù)質(zhì)控（quality check，QC）：采用細(xì)胞特異性表達(dá)的基因去除紅細(xì)胞等不在研究范圍內(nèi)的細(xì)胞，設(shè)置所有基因在每個(gè)細(xì)胞中總表達(dá)量的最低閾值，進(jìn)一步過濾低質(zhì)量細(xì)胞；（3）對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化（Normalize Data）：采用Seurat程序包的Normalize Data函數(shù)，對每個(gè)樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行全局縮放歸一化（globalscaling normalization），即用總表達(dá)量對每個(gè)單元格的基因表達(dá)量進(jìn)行歸一化，然后將其乘以縮放因子（默認(rèn)為10 000），對結(jié)果進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換；（4）可視化細(xì)胞分群：采用無監(jiān)督方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行降維分析，基于數(shù)據(jù)中2 000個(gè)高可變基因（highly variable genes，HVG）進(jìn)行主成分分 析（principal component analysis，PCA），設(shè)置參數(shù)“維度（dims）”為30，進(jìn)行細(xì)胞聚類分群，最后采用t分布隨機(jī)鄰域嵌入（t-distributed stochastic neighbor embedding，t-SNE）或統(tǒng)一流形逼近與投影（uniform manifold approximation and projection，UMAP）算法體現(xiàn)可視化細(xì)胞分群結(jié)果。t-SNE和UMAP算法都是將細(xì)胞分群以二維平面的形式呈現(xiàn)，分別以t-SNE_1或UMAP_1作為橫坐標(biāo)以及t-SNE_2或UMAP_2作為縱坐標(biāo)。

1.6 細(xì)胞類型識別

參閱參考文獻(xiàn)中相應(yīng)細(xì)胞的標(biāo)志基因[23]，對細(xì)胞分群進(jìn)行命名：Cd3d和Cd3e是T細(xì)胞（T cells）的標(biāo)志基因，Col1a1是成纖維細(xì)胞（fibroblasts）的標(biāo)志基因，Aqp4和aldh1l1是星形膠質(zhì)細(xì)胞（astrocytes）的標(biāo)志基因，Olig1和Olig2是少突膠質(zhì)細(xì)胞（oligodendrocytes）的標(biāo)志基因；Aif1和Cd68是小膠質(zhì)細(xì)胞（microglia）的標(biāo)志基因；Cdh5和Cldn5是內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells）的標(biāo)志基因。采用Seurat程序包中的FeaturePlot功能展示標(biāo)志基因在單細(xì)胞聚類圖中的表達(dá)情況。

1.7 微環(huán)境細(xì)胞整合分析

取生長至第7天和第11天的2只WT小鼠的小腦組織，以及3只Patch＋/-轉(zhuǎn)基因小鼠形成的髓母細(xì)胞瘤樣本，進(jìn)行scRNA-seq，并提取微環(huán)境細(xì)胞進(jìn)行降維分析。從GEO數(shù)據(jù)庫（GSE129730）下載采用vismodegib治療組以及空載體（vector）處理的對照組M-SMO轉(zhuǎn)基因小鼠腫瘤的scRNA-seq數(shù)據(jù)矩陣，并對微環(huán)境細(xì)胞進(jìn)行降維分析。對2組數(shù)據(jù)中微環(huán)境細(xì)胞的scRNA-seq數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行整合分析（integration analysis），用于綜合分析比較腫瘤與正常小腦組織中微環(huán)境細(xì)胞數(shù)量的差異，并且比較vismodegib治療組與對照組之間微環(huán)境細(xì)胞數(shù)量的差異。

1.8 基因集變異分析（gene set variation analysis，GSVA）

采用Seurat程序包對不同細(xì)胞群進(jìn)行差異表達(dá)基因分析（differential gene expression analysis，DEG），選取差異表達(dá)P＜0.05且差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）即|log2FC|＞0.25的基因，作為每種細(xì)胞類型的特異性表達(dá)基因集（gene set），分別定義為T細(xì)胞相關(guān)基因（T cell-related gene）、小膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)基因（microglia-related gene）、成纖維細(xì)胞相關(guān)基因（fibroblast-related gene）、星形膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)基因（astrocyte-related gene）、少突膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)基因（oligodendrocyterelated gene）和內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)基因（endothelial cell-related gene）；采用GSVA程序包對髓母細(xì)胞瘤患者的RNA表達(dá)數(shù)據(jù)分別計(jì)算上述基因集的基因得分，微環(huán)境細(xì)胞相關(guān)基因的GSVA得分即表示微環(huán)境相關(guān)基因的表達(dá)水平，同時(shí)也可用于表示微環(huán)境細(xì)胞的富集程度。

1.9 生存分析

采用GSVA程序包對髓母細(xì)胞瘤患者的RNA表達(dá)數(shù)據(jù)計(jì)算T細(xì)胞相關(guān)基因、小膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)基因、成纖維細(xì)胞相關(guān)基因、星形膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)基因、少突膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)基因和內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)基因的得分；使用survminer程序包的surv_cutpoint函數(shù)尋找GSVA得分的分組閾值，并根據(jù)這個(gè)閾值把GSVA得分分為得分高（high）和得分低（low）2組，最后采用Kaplan-Meier法分析2組患者的總生存（overall survival，OS）時(shí)間。

1.10 細(xì)胞比例分析

計(jì)算不同微環(huán)境細(xì)胞群中腫瘤和正常樣本的構(gòu)成比，采用χ2檢驗(yàn)比較2者之間的差異，隨后計(jì)算不同微環(huán)境細(xì)胞群中vismodegib治療組和對照組樣本的構(gòu)成比，并進(jìn)行χ2檢驗(yàn)；在SHH型髓母細(xì)胞瘤患者RNA數(shù)據(jù)中對所有微環(huán)境細(xì)胞相關(guān)基因得分進(jìn)行聚類分析，將405例患者分為A組和B組，以每一例患者RNA數(shù)據(jù)中所有微環(huán)境細(xì)胞相關(guān)基因得分的最大值對應(yīng)的微環(huán)境細(xì)胞類型作為該患者的主要微環(huán)境細(xì)胞成分，計(jì)算2組患者中主要微環(huán)境細(xì)胞類型所占的比例，使用circlize程序包制作弦狀圖展示2組患者的微環(huán)境細(xì)胞比例，并采用χ2檢驗(yàn)比較2組的細(xì)胞比例差異。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 7.00統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用χ2檢驗(yàn)比較不同分組之間的細(xì)胞比例差異；生存分析采用Kaplan-Meier法，進(jìn)行l(wèi)og-rank檢驗(yàn)；采用COX風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型進(jìn)行髓母細(xì)胞瘤患者預(yù)后的多因素分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 單細(xì)胞測序及單細(xì)胞分析流程

解剖獲得Patched＋/-轉(zhuǎn)基因小鼠培育50周后形成的髓母細(xì)胞瘤和正常小鼠的小腦（WT cerebellum）組織，進(jìn)行單細(xì)胞RNA測序。對獲得的所有微環(huán)境細(xì)胞進(jìn)行降維分析，一共捕獲2 077個(gè)微環(huán)境單細(xì)胞（圖1A）。從GEO數(shù)據(jù)庫（GSE129730）中下載對M-SMO轉(zhuǎn)基因小鼠培育形成的髓母細(xì)胞瘤中的微環(huán)境細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞降維分析而獲得的1 781個(gè)微環(huán)境單細(xì)胞（圖1B）。隨后對2個(gè)微環(huán)境單細(xì)胞RNA數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行整合分析，共獲得3 859個(gè)微環(huán)境單細(xì)胞（圖1C）。由于采用的小鼠模型都是髓母細(xì)胞瘤的動物模型，因此獲得的微環(huán)境單細(xì)胞可用于描述小鼠髓母細(xì)胞瘤微環(huán)境的細(xì)胞分群情況。

Fig.1 Workflow for single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) and analysis of microenvironment.A:Workflow for tissue collection,single-cell digestion,sequencing and analysis of microenvironment in two wild-type (WT) mice cerebellum and three Patched+/- medulloblastoma mouse models.B: Analysis of microenvironment in Math1-Cre/SMOM2 (M-SMO) medulloblastoma mouse models from GSE129730 dataset.C: Integration analysis of microenvironment from two scRNA-seq datasets.圖1 小鼠髓母細(xì)胞瘤的單細(xì)胞測序流程以及微環(huán)境的單細(xì)胞分析

2.2 髓母細(xì)胞瘤小鼠模型和WT小鼠小腦組織微環(huán)境細(xì)胞圖譜

對WT小鼠的小腦組織和SHH型髓母細(xì)胞瘤小鼠模型腫瘤組織的微環(huán)境細(xì)胞進(jìn)行整合分析，共獲得3 859個(gè)細(xì)胞，降維分析結(jié)果顯示微環(huán)境細(xì)胞一共分為12個(gè)細(xì)胞群（圖2A）。根據(jù)細(xì)胞標(biāo)志基因的表達(dá)情況（圖2B），將12個(gè)細(xì)胞群分別定義為T細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。隨后的單細(xì)胞基因表達(dá)圖（Feature Plot）（圖2C）顯示，標(biāo)志基因確實(shí)特異地表達(dá)在對應(yīng)的微環(huán)境細(xì)胞類型中，Cd3d基因特異地表達(dá)在T細(xì)胞中，Col1a1基因特異地表達(dá)在成纖維細(xì)胞中，Aqp4基因特異地表達(dá)在星形膠質(zhì)細(xì)胞中，Olig1基因特異地表達(dá)在少突膠質(zhì)細(xì)胞中，Cd68基因特異地表達(dá)在小膠質(zhì)細(xì)胞中，而Cldn5基因特異地表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞中，表明細(xì)胞類型定義準(zhǔn)確。此外，分群結(jié)果中檢測到T細(xì)胞這個(gè)分群，這在以往小鼠小腦的單細(xì)胞測序研究中并未出現(xiàn)[15-16,23]。

Fig.2 Single-cell transcriptome profiling of microenvironment in Sonic Hedgehog (SHH)medulloblastoma mouse models and wild-type (WT) cerebellum.A: Uniform manifold approximation and projection (UMAP) visualization of all 3 859 microenvironmental cells from two datasets with cells colored according to the corresponding cell types;x axis and y axis indicate two dimensions.B: Dot plot for expression of marker genes in microenvironmental cell types.The color represents average expression of marker genes in each cell type,and the size indicates the proportion of cells expressing marker genes.C:Feature Plot showing the signature gene expression of each microenvironmental cell type in the form of UMAP;x axis and y axis indicate two dimensions.圖2 采用UMAP算法獲得的髓母細(xì)胞瘤小鼠模型和WT小鼠小腦微環(huán)境細(xì)胞可視化分群圖譜

2.3 比較不同類型樣本中微環(huán)境細(xì)胞數(shù)量的差異

對樣本來源和細(xì)胞構(gòu)成比例進(jìn)行分析。對腫瘤和正常樣本的分析結(jié)果（圖3A）顯示，T細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞只出現(xiàn)在腫瘤樣本中。此外，腫瘤較正常樣本具有更多的少突膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞（P＜0.001），具有更少的星形膠質(zhì)細(xì)胞（P＜0.001）。此外，對vismodegib治療組和空載體（vector）對照組的分析結(jié)果（圖3B）顯示，與采用空載體（vector）處理的對照組相比，采用vismodegib治療腫瘤后，T細(xì)胞群只富集在治療組的樣本中（P＜0.001），并且治療組樣本較對照組樣本具有更多的成纖維細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，及更少的內(nèi)皮細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞（P均＜0.001）。已知SHH型髓母細(xì)胞瘤小鼠模型在使用vismodegib治療后，增殖活躍的腫瘤干細(xì)胞所占比例明顯下調(diào)，表明治療有效。本研究中vismodegib治療后T細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的增加可能發(fā)揮著抑制腫瘤發(fā)生和發(fā)展的功能，而內(nèi)皮細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞所占比例下調(diào)可能發(fā)揮促進(jìn)腫瘤發(fā)生和發(fā)展的功能。

Fig.3 Comparison of the proportion of microenvironmental cell types in different types of samples.A:Uniform manifold approximation and projection (UMAP) visualization of microenvironmental cell types in different microenvironment sources (tumor vs normal);x axis and y axis indicate two dimensions.B: Bar plot showing the cell proportion of microenvironmental cell types in different microenvironment sources(tumor vs normal) [P＜0.000 1 (chi-square test)].C: UMAP visualization of microenvironmental cell types in different treatment strategies (vismodegib vs vector);x axis and y axis indicate two dimensions.D: Bar plot showing the cell proportion of microenvironmental cell types in different treatment strategies (vismodegib vs vector) [P＜0.001 (chi-square test)].圖3 采用UMAP圖展示不同來源樣本[腫瘤和正常組織的構(gòu)成比（A）以及vismodegib治療組和對照組（B）]的微環(huán)境細(xì)胞分群情況以及微細(xì)胞群的構(gòu)成比

2.4 腫瘤微環(huán)境細(xì)胞群對髓母細(xì)胞瘤患者預(yù)后的影響

為進(jìn)一步探討微環(huán)境細(xì)胞群對腫瘤發(fā)生和發(fā)展的影響，對405例SHH型髓母細(xì)胞瘤患者的RNA表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行GSVA分析，獲得微環(huán)境細(xì)胞群相關(guān)基因的GSVA得分，隨后基于GSVA得分分析患者的OS期。結(jié)果顯示，高表達(dá)小膠質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞相關(guān)基因的患者OS期較長（圖4A和4B，P均＜0.05），結(jié)合vismodegib治療后腫瘤小鼠中小膠質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞比例增加的結(jié)果，表明這2種細(xì)胞的存在可能抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。同樣地，本研究中發(fā)現(xiàn)高表達(dá)少突膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)基因患者OS期的較短（圖4C，P＝0.002 8），結(jié)合vismodegib治療后腫瘤小鼠中少突膠質(zhì)細(xì)胞比例降低的結(jié)果，表明少突膠質(zhì)細(xì)胞的存在可能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。本研究中還發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)星形膠質(zhì)細(xì)胞（圖4D）、內(nèi)皮細(xì)胞（圖4E）和T細(xì)胞相關(guān)基因（圖4F）患者的OS期并沒有出現(xiàn)明顯的差異，因此未來尚需通過進(jìn)一步的研究，探討這3個(gè)相關(guān)基因?qū)δ[瘤發(fā)生和發(fā)展的影響。

Fig.4 The correlation between microenvironmental cell type-related genes (microglia-related gene,fibroblasts-related gene,oligodendrocytes-related gene,astrocytes-related gene,endothelial cells-related gene and T cells-related gene) scores and overall survival (OS) of medulloblastoma patients was analyzed by Kaplan-Meier method.圖4 Kaplan-Meier法分析微環(huán)境細(xì)胞相關(guān)基因得分和髓母細(xì)胞瘤患者OS期的相關(guān)性

2.5 腫瘤微環(huán)境細(xì)胞富集程度與患者臨床特征之間的關(guān)系

為了探討腫瘤微環(huán)境細(xì)胞富集程度與患者臨床特征之間的關(guān)系，本研究中首先以微環(huán)境細(xì)胞相關(guān)基因的GSVA得分表示患者微環(huán)境細(xì)胞群的富集程度。通過對微環(huán)境細(xì)胞群富集程度的熱圖（圖5A）聚類分析顯示，405例患者被分為2組，A組有患者186例，B組有患者219例；A組患者主要有富集內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，B組患者主要有富集星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。對2組患者的OS期進(jìn)行分析，結(jié)果（圖5B）顯示，A組患者的預(yù)后較好，而B組患者的預(yù)后較差（P＝0.004），結(jié)合A組患者的微環(huán)境細(xì)胞富集特征（圖5A），進(jìn)一步證實(shí)成纖維細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞具有抑制腫瘤發(fā)生和發(fā)展的作用，而少突膠質(zhì)細(xì)胞在髓母細(xì)胞瘤中則可能具有促進(jìn)腫瘤發(fā)生和發(fā)展的作用。

隨后對所有患者臨床特征進(jìn)行分析。結(jié)果（圖5C）顯示，B組中具有更多的未成年患者（＜18歲）（P＜0.001），并且組織病理學(xué)上更多地表現(xiàn)為大細(xì)胞和間變型（large cell and anaplastic，LCA）（P＜0.001）。根據(jù)以往報(bào)道[24-25]，青少年患者組織病理學(xué)常表現(xiàn)為LCA型，而LCA型患者的臨床預(yù)后極差，這可能進(jìn)一步佐證了為何B組患者預(yù)后更差的結(jié)論。

Fig.5 The correlation between enrichment level of microenvironmental cell types and the clinical characteristics of patients with medulloblastoma.A: Heatmap showing the gene set variation analysis (GSVA)scores indicating the enrichment level of microenvironmental cell types in human SHH medulloblastoma patients from Gene Expression Omnibus (GEO): GSE124814 with annotation of characteristics including age,histology,metastatic stage and gender.B: Survival curves of Group A and Group B were analyzed by Kaplan-Meier method (log-rank test).C: Bar plot showing the proportion of clinical characteristics in Group A and Group B (chi-square test).LCA: Large cell and anaplastic;MBEN: Medulloblastoma with extensive nodularity;NOS: No-molecular study;M1: Distant metastasis;M0: Without metastasis.圖5 腫瘤微環(huán)境細(xì)胞富集程度與髓母細(xì)胞瘤患者臨床特征之間的關(guān)系

2.6 腫瘤微環(huán)境細(xì)胞共同調(diào)控髓母細(xì)胞瘤的發(fā)生和發(fā)展

腫瘤微環(huán)境細(xì)胞通過相互作用共同調(diào)控腫瘤發(fā)生和發(fā)展的進(jìn)程，為探討微環(huán)境細(xì)胞群對髓母細(xì)胞瘤患者的共同調(diào)控機(jī)制，將每位患者GSVA得分的最大值對應(yīng)的細(xì)胞類型定義為患者具有的主要微環(huán)境細(xì)胞成分，對A組和B組患者的主要微環(huán)境細(xì)胞成分進(jìn)行組成分析（圖6A），結(jié)果顯示A組患者主要包含小膠質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，相反B組患者主要包含少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞（P＜0.001），與圖5A的結(jié)果一致。相關(guān)性分析結(jié)果（圖6B）顯示，小膠質(zhì)細(xì)胞，成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的相關(guān)性更高（r均＞0.8），而少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的相關(guān)性更高（r均＞0.4），提示不同細(xì)胞群之間是共同調(diào)控腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程的。結(jié)合生存分析結(jié)果，小膠質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞可能是通過相互作用共同抑制腫瘤的進(jìn)展，因此A組患者的預(yù)后較好。盡管少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)性很高，但是當(dāng)富集為星形膠質(zhì)細(xì)胞時(shí)，患者OS期之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；由此推測，可能是由于少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮了促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的作用，從而揭示了B組患者預(yù)后較差的原因。

COX多因素風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析結(jié)果（表2）顯示，少突膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)基因的GSVA得分是髓母細(xì)胞瘤患者生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其得分越高，患者的OS期越短[風(fēng)險(xiǎn)比（hazard ratio，HR）＝1.601，95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）為1.011～127.829，P＝0.049]；此外協(xié)變量中，發(fā)生轉(zhuǎn)移也是患者OS期的危險(xiǎn)因素。相反，成纖維細(xì)胞相關(guān)基因的GSVA得分越高（表3），患者的OS期越長（HR＝0.066，95%CI為0.013～0.331，P＜0.001）；協(xié)變量中，腫瘤不發(fā)生轉(zhuǎn)移是患者OS期的保護(hù)因素。綜上所述，提示當(dāng)腫瘤微環(huán)境富集少突膠質(zhì)細(xì)胞時(shí)，腫瘤更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，反之當(dāng)腫瘤微環(huán)境富集成纖維細(xì)胞時(shí)，腫瘤則不易發(fā)生轉(zhuǎn)移。

表3 多因素COX風(fēng)險(xiǎn)模型分析成纖維細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)基因得分與髓母細(xì)胞瘤患者OS期的相關(guān)性Table 3 Multivariate COX proportional-hazards model analysis of the relationship between fibroblast-,microglia-and endothelial cell-related gene scores and the overall survival (OS) of patients with medulloblastoma

Fig.6 The co-effects of microenvironmental cell types on the progression of medulloblastoma.A: The proportion of microenvironmental cell types in Group A and Group B (patients with medulloblastoma having annotations colored according to the corresponding cell types (chi-square test).B: The correlation between microenvironmental cell types based on cell type-related gene scores.圖6 腫瘤微環(huán)境細(xì)胞在腫瘤發(fā)生過程中的共同作用

表2 多因素COX風(fēng)險(xiǎn)模型分析星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)基因得分與髓母細(xì)胞瘤患者OS期的關(guān)系Table 2 MultivariateC OX proportional-hazards model analysis of the relationship between astrocyte-and oligodendrocyte-related gene scores and the overall survival (OS) of patients with medulloblastoma

3 討論

髓母細(xì)胞瘤是兒童中最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的16%～25%[26]。目前治療髓母細(xì)胞瘤的方式首選手術(shù)治療，術(shù)后輔以放化療。然而過度放、化療對兒童其他器官的損害極大，腫瘤遠(yuǎn)期生存率仍然很差[27]。所以，探索影響髓母細(xì)胞瘤發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制，以尋求新的治療方向，顯得尤為迫切。

許多研究已經(jīng)表明，腫瘤微環(huán)境細(xì)胞在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要作用。SHARMA等[28]發(fā)現(xiàn)，肝癌中腫瘤相關(guān)性巨噬細(xì)胞可通過分泌細(xì)胞因子等方式與腫瘤細(xì)胞相互作用，從而拮抗腫瘤的生長。然而，小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的巨噬細(xì)胞群，其對腫瘤發(fā)生和發(fā)展的影響仍存在爭議[18]。其他研究表明，腫瘤微環(huán)境細(xì)胞可預(yù)測腫瘤對治療的敏感性。GOODEN等[19]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞如CD3＋T細(xì)胞的比例增加時(shí)，患者的預(yù)后更好，提示這些患者對治療更敏感。MAYNARD等[29]發(fā)現(xiàn)，化療敏感的肺癌患者中，T細(xì)胞的比例高于化療耐受的患者，提示T細(xì)胞的存在可改善患者的預(yù)后。因此，靶向干預(yù)腫瘤微環(huán)境細(xì)胞可能有助于抑制腫瘤的進(jìn)展，改善腫瘤患者的預(yù)后。

本研究通過對正常小鼠和腫瘤小鼠微環(huán)境的scRNA-seq數(shù)據(jù)的整合分析，首次描述了髓母細(xì)胞瘤小鼠模型中可能存在的微環(huán)境細(xì)胞類型，并首次比較了腫瘤和正常小鼠、腫瘤小鼠治療組和對照組之間微環(huán)境細(xì)胞的數(shù)量變化。隨后分析微環(huán)境細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)水平和患者預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的富集可改善患者的預(yù)后。此外，患者的臨床特征分組也顯示，富集這2類細(xì)胞的分組患者預(yù)后更好，結(jié)合細(xì)胞相關(guān)性分析結(jié)果，提示這兩類細(xì)胞可能起到共同抑制腫瘤進(jìn)展的作用。已有研究表明[30]，成纖維細(xì)胞可增強(qiáng)膀胱癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力，從而促進(jìn)膀胱癌的進(jìn)展。而本研究結(jié)果顯示，成纖維細(xì)胞可改善髓母細(xì)胞瘤患者的預(yù)后，多因素COX風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)一步顯示成纖維細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)水平及腫瘤不發(fā)生轉(zhuǎn)移均為患者OS期的保護(hù)因素，可見成纖維細(xì)胞可能阻礙髓母細(xì)胞瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移，從而抑制其進(jìn)展。作為小腦中巨噬細(xì)胞的主要類型，小膠質(zhì)細(xì)胞與腫瘤相關(guān)性巨噬細(xì)胞的作用一致，即能夠抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。本研究還發(fā)現(xiàn)少突膠質(zhì)細(xì)胞的存在，可導(dǎo)致患者的預(yù)后較差，并促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移，這在以往的報(bào)道中較少出現(xiàn)。

近年來有關(guān)髓母細(xì)胞瘤的scRNA-seq研究已經(jīng)詳細(xì)地描述了腫瘤細(xì)胞之間的異質(zhì)性，并通過結(jié)合患者RNA表達(dá)數(shù)據(jù)分析，闡明了不同腫瘤細(xì)胞分群對患者預(yù)后的影響[15-16]。然而，是這些研究都忽視了對微環(huán)境細(xì)胞的分析，因此本研究首次利用小鼠scRNA-seq數(shù)據(jù)著重探討微環(huán)境細(xì)胞在不同狀態(tài)下的數(shù)量變化，包括比較腫瘤和正常小鼠、腫瘤小鼠治療組和對照組的細(xì)胞數(shù)量變化的情況。為了進(jìn)一步研究不同微環(huán)境細(xì)胞分群對患者預(yù)后的影響，本研究還從GEO數(shù)據(jù)庫（GSE124814）中下載了整合23個(gè)數(shù)據(jù)集中共405例SHH型髓母細(xì)胞瘤患者的RNA表達(dá)數(shù)據(jù)及臨床資料進(jìn)行分析，最終結(jié)果提示成纖維細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞對患者預(yù)后有顯著影響，表明這3類細(xì)胞在髓母細(xì)胞瘤的靶向干預(yù)治療中具有重要意義，但關(guān)于這3類細(xì)胞調(diào)控髓母細(xì)胞瘤發(fā)生和發(fā)展的具體功能和機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。

綜上所述，腫瘤微環(huán)境中的成纖維細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞可改善患者的預(yù)后，抑制髓母細(xì)胞瘤的發(fā)生和發(fā)展；而少突膠質(zhì)細(xì)胞可使患者的預(yù)后更差，促進(jìn)髓母細(xì)胞瘤的進(jìn)展。因此，靶向干預(yù)這3類細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制，可能有助于抑制腫瘤的進(jìn)展，改善腫瘤患者的預(yù)后。