［摘 要］ 溶瘤Ⅱ型單純皰疹病毒oHSV2是對(duì)Ⅱ型單純皰疹病毒HSV-2進(jìn)行基因改造后得到的新型溶瘤病毒。UL19基因編碼的VP5蛋白為oHSV2主要衣殼蛋白之一。在前期已經(jīng)通過(guò)GST pull-down與質(zhì)譜檢測(cè)分析確定了oHSV2的VP5蛋白為人類白細(xì)胞抗原E（HLA-E）的相互作用蛋白的基礎(chǔ)上，將HLA-E作為NK與CTL等免疫細(xì)胞表面CD94/NKG2A的強(qiáng)效抑制性配體，當(dāng)它與CD94/NKG2A結(jié)合后，NK與CTL細(xì)胞的免疫功能會(huì)受到一定程度的抑制。前期研究已證實(shí)oHSV2會(huì)在體外上調(diào)部分腫瘤細(xì)胞系表面HLA-E表達(dá)，為探究oHSV2是否通過(guò)VP5蛋白上調(diào)腫瘤細(xì)胞系表面HLA-E的表達(dá)，進(jìn)而影響HLA-E和CD94/NKG2A的結(jié)合，最終改變NK細(xì)胞的抗腫瘤能力，通過(guò)PiggyBac 轉(zhuǎn)座系統(tǒng)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)VP5蛋白的人胃腺癌細(xì)胞BGC823-VP5細(xì)胞系。所構(gòu)建的細(xì)胞系經(jīng)流式檢測(cè)單克隆細(xì)胞陽(yáng)性率在99%以上；Western Blot檢測(cè)到VP5蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)；實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記動(dòng)態(tài)細(xì)胞分析技術(shù)（RTCA Real Time Cell AnaIysis）檢測(cè)表明BGC823-VP5細(xì)胞系與親本細(xì)胞BGC823細(xì)胞生長(zhǎng)活性一致。穩(wěn)定表達(dá)VP5蛋白的人胃癌細(xì)胞BGC823-VP5細(xì)胞系的構(gòu)建，為進(jìn)一步研究oHSV2上VP5蛋白在人胃癌BGC823細(xì)胞內(nèi)影響HLA-E的表達(dá)，進(jìn)而影響免疫細(xì)胞的抗腫瘤能力奠定了基礎(chǔ)。

［關(guān)鍵詞］ 溶瘤Ⅱ型單純皰疹病毒； VP5蛋白； BGC823細(xì)胞

［中圖分類號(hào)］ R735.2" ［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］ A

溶瘤Ⅱ型單純皰疹病毒oHSV2是由Ⅱ型單純皰疹病毒（HSV-2）基因改造而來(lái)的新型溶瘤病毒，具體改造步驟是在Ⅱ型單純皰疹病毒（HSV-2）標(biāo)準(zhǔn)毒株HG52的基因組上敲除了ICP34.5和ICP47，同時(shí)在病毒基因組上插入了編碼人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（human granulocyte macrophage colony stimulating factor，hGM-CSF）的基因序列[1]。溶瘤Ⅱ型單純皰疹病毒oHSV2上VP5蛋白是由UL19基因編碼的病毒主要衣殼蛋白，屬于病毒晚期（leaky-late）表達(dá)蛋白[2]，在病毒基因組復(fù)制開始后表達(dá)，在感染復(fù)制周期中晚期最高表達(dá)[3]。

病毒感染腫瘤細(xì)胞引起HLA-E表達(dá)上調(diào)的現(xiàn)象已有文獻(xiàn)報(bào)道[4]。本團(tuán)隊(duì)前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)oHSV2會(huì)在體外上調(diào)部分腫瘤細(xì)胞系表面HLA-E的表達(dá)，且已經(jīng)通過(guò)GST pull-down與質(zhì)譜分析確定了oHSV2上由UL19基因編碼的VP5蛋白為人類白細(xì)胞抗原E（HLA-E）的相互作用蛋白。這提示了oHSV2可能通過(guò)VP5蛋白上調(diào)部分腫瘤細(xì)胞系表面HLA-E的表達(dá)，而HLA-E作為CTL細(xì)胞與NK細(xì)胞表面CD94/NKG2A的強(qiáng)效抑制性配體在腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)會(huì)影響到CTL細(xì)胞與NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性[5]。

胃癌作為最常見的消化道癌之一，其死亡率高居消化道癌癥第一位[6]。人胃癌BGC823細(xì)胞系作為經(jīng)典的腫瘤研究細(xì)胞模型，在胃癌研究中極具代表性[7]。本研究擬在人胃癌BGC823細(xì)胞系基礎(chǔ)上構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)VP5蛋白的人胃癌細(xì)胞系，以利于進(jìn)一步探究VP5蛋白影響腫瘤細(xì)胞表面HLA-E表達(dá)進(jìn)而影響CTL細(xì)胞與NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的機(jī)制。

目前用于真核蛋白穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建的常用載體有轉(zhuǎn)座子載體與慢病毒載體[8]，本研究選擇的是轉(zhuǎn)座子載體，采用了PiggyBac 轉(zhuǎn)座質(zhì)粒系統(tǒng)。作為DNA型轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，PiggyBac轉(zhuǎn)座質(zhì)粒系統(tǒng)憑借其轉(zhuǎn)座效率高、宿主范圍廣等優(yōu)勢(shì)，已廣泛應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞真核蛋白穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建中[9]。PiggyBac 轉(zhuǎn)座質(zhì)粒系統(tǒng)需要轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒與轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒共同發(fā)揮作用。轉(zhuǎn)座酶質(zhì)?？删幋a由594個(gè)氨基酸組成的PiggyBac轉(zhuǎn)座酶，轉(zhuǎn)座酶在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)后可在轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座過(guò)程中切斷DNA使轉(zhuǎn)座子從質(zhì)粒載體中釋放出來(lái)，同時(shí)也可將宿主細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)染色體的特定位點(diǎn)剪切為粘性末端雙鏈斷口[10]。在DNA連接酶的作用下，載體質(zhì)粒會(huì)重新連接起來(lái)，連接宿主細(xì)胞染色體粘性末端雙鏈斷口，從而整合到宿主細(xì)胞染色體上[11]。本研究使用已插入U(xiǎn)L19基因（oHSV2上VP5蛋白的編碼基因）與綠色熒光蛋白（green fluorescent protein ，GFP）基因的轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒和表達(dá)轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BGC823細(xì)胞，使GFP與UL19基因整合到BGC823細(xì)胞染色體上，從而在BGC823細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)VP5蛋白。其中GFP 作為熒光標(biāo)簽蛋白，可作為細(xì)胞系篩選過(guò)程中的重要指標(biāo)[12]。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑

本實(shí)驗(yàn)使用來(lái)源于協(xié)和醫(yī)院（北京）的人胃癌細(xì)胞株；細(xì)胞培養(yǎng)使用DMEM/F12（南京森貝伽生物科技）、FBS（浙江天杭生物）；PiggyBac Dual Promoter-VP5 重組質(zhì)粒及菌種由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建并保存；Super PiggyBac Transposase（pSPBT）轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室前期改造并保存；質(zhì)粒提取使用江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒中提試劑盒；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染使用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒（Thermo Fisher Scientific）；細(xì)胞篩選用嘌呤霉素（Puro）購(gòu)自白鯊生物；PAGE凝膠快速制備試劑盒（10%）購(gòu)自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；Anti-VP5抗體購(gòu)自圣克魯斯生物技術(shù)有限公司；山羊抗兔二抗購(gòu)自proteintech。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器

二級(jí)生物安全柜 （北京東聯(lián)哈爾）， CO2培養(yǎng)箱 （Panasonic）， 體視熒光顯微鏡 （Nikon），細(xì)胞計(jì)數(shù)儀 （Thermo Fisher Scientific）， 流式細(xì)胞檢測(cè)儀 （BD）， 多功能實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞分析儀 （ACEA Biosciences Inc）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

50 mL FBS加入450 mL DMEM/F12內(nèi)混勻即為BGC823細(xì)胞培養(yǎng)用完全培養(yǎng)基；BGC823細(xì)胞于37℃，5%" CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

2.2 質(zhì)粒提取

從超低溫保存箱中取出前期保存的pPBDP-VP5與pSPBT質(zhì)粒菌種，冰上化凍后在超凈工作臺(tái)內(nèi)取15 μL質(zhì)粒菌種接種于15 mL的LB培養(yǎng)基中，加入 15 μL 抗生素，37℃，200 r/min 搖菌 14 h。質(zhì)粒提取操作按照試劑盒相應(yīng)說(shuō)明書完成。提取完成后及時(shí)測(cè)定所提質(zhì)粒DNA濃度，于-20℃冰箱保存。

2.3 細(xì)胞對(duì)嘌呤霉素敏感性實(shí)驗(yàn)

取BGC823細(xì)胞，消化并終止后計(jì)數(shù)，以完全培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞，稀釋至細(xì)胞濃度為3×105 個(gè)/mL，以每孔0.5 mL置于24孔板中培養(yǎng)。于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d待BGC823細(xì)胞匯合度達(dá)到80%后，取出24孔板，在生物安全柜內(nèi)棄掉孔板中舊培養(yǎng)基，各培養(yǎng)孔中各換入1 mL完全培養(yǎng)基，在各孔內(nèi)分別加入1、2、3、4、5、6、7、8、9 、10 μL嘌呤霉素（1 μg/μL），每個(gè)濃度3次重復(fù)。輕輕搖晃孔板，將孔板內(nèi)抗生素與培養(yǎng)基搖晃均勻后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，期間每日觀察記錄細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)與存活細(xì)胞比例，每2日對(duì)24孔板中培養(yǎng)基進(jìn)行更換并加入對(duì)應(yīng)體積嘌呤霉素。最后于加入嘌呤霉素后第6天確定細(xì)胞系篩選過(guò)程中的嘌呤霉素最合適濃度。

2.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

取BGC823細(xì)胞，消化終止后計(jì)數(shù)，將細(xì)胞以每孔1.5×105個(gè)鋪于24孔板中。細(xì)胞放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h待孔板內(nèi)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%后，取出24孔板，在生物安全柜內(nèi)棄掉24孔板內(nèi)舊培養(yǎng)基，每孔換入新培養(yǎng)基。將pPBDP-VP5質(zhì)粒與pSPBT按質(zhì)量比為5∶1轉(zhuǎn)染BGC823細(xì)胞。轉(zhuǎn)染完成后，輕輕晃動(dòng)孔板使轉(zhuǎn)染體系與培養(yǎng)基混合均勻，于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后在體視熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞發(fā)光率。

2.5 嘌呤霉素篩選

轉(zhuǎn)染48 h后，取出BGC823細(xì)胞，在生物安全柜內(nèi)棄去24孔板內(nèi)舊培養(yǎng)基，每孔換入1 mL新培養(yǎng)基，并按照BGC823細(xì)胞對(duì)嘌呤霉素敏感性實(shí)驗(yàn)所確定的最合適嘌呤霉素濃度加入嘌呤霉素。放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，期間每日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)與細(xì)胞發(fā)光率，每2 日更換24孔板內(nèi)培養(yǎng)基與嘌呤霉素。嘌呤霉素篩選至24孔板內(nèi)細(xì)胞發(fā)光率達(dá)到50%后在生物安全柜內(nèi)消化細(xì)胞，終止消化后吹勻細(xì)胞，計(jì)數(shù)，使用完全培養(yǎng)基稀釋至10 個(gè)/mL。將稀釋后細(xì)胞轉(zhuǎn)入96孔板中（每孔100 μL），放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后取出96孔板，在顯微鏡下觀察96孔板內(nèi)細(xì)胞并記錄只生長(zhǎng)有單個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)孔。繼續(xù)培養(yǎng)至單個(gè)細(xì)胞增殖為細(xì)胞團(tuán)后，體視顯微鏡挑選發(fā)光單克隆細(xì)胞團(tuán)，并將單克隆細(xì)胞轉(zhuǎn)移至24孔板內(nèi)，放入培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。待24孔板中細(xì)胞匯合度達(dá)到80%后消化細(xì)胞，終止消化后轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。

2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞GFP表達(dá)

取BGC823-VP5細(xì)胞與BGC823細(xì)胞消化并終止后離心，用PBS重懸并稀釋細(xì)胞至2×105個(gè)/mL。以BGC823細(xì)胞為對(duì)照，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)BGC823-VP5細(xì)胞GFP的表達(dá)率。

2.7 Western Blot檢測(cè)細(xì)胞VP5表達(dá)

取BGC823-VP5細(xì)胞與BGC823細(xì)胞分別鋪于6孔板，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 d后取出，棄去孔板內(nèi)培養(yǎng)基，使用RIPA（強(qiáng)）裂解液4℃裂解細(xì)胞，4℃離心裂解后細(xì)胞收獲總蛋白，使用蛋白上樣緩沖液100℃變性蛋白。變性后蛋白通過(guò)蛋白膠電泳分離，使用半干轉(zhuǎn)印槽將SDS-PAGE內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)印至NC膜（電壓15 V，20 min）。采用含有5% 脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h，一抗室溫孵育1 h，二抗室溫孵育1 h。使用ECL顯色液顯色。

2.8 實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞分析儀（RTCA）檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖活性

選擇GFP陽(yáng)性率在99%以上的BGC823-VP5-3細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)活性檢測(cè)。分別取BGC823-VP5-3細(xì)胞與BGC823細(xì)胞消化終止后計(jì)數(shù)，使用培養(yǎng)基分別稀釋細(xì)胞密度至1×105個(gè)/mL，以100 μL每孔鋪于RTCA專用16孔板，將RTCA放入培養(yǎng)箱內(nèi)以每5 min一次的頻率監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，共監(jiān)測(cè)72 h[13]。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 BGC823細(xì)胞對(duì)嘌呤霉素敏感性實(shí)驗(yàn)

以1～10 μg/μL為嘌呤霉素濃度范圍刺激BGC823細(xì)胞，觀察細(xì)胞存活率并制作細(xì)胞生存曲線。由圖1可知，嘌呤霉素刺激細(xì)胞后6 d內(nèi)細(xì)胞全部死亡的最低嘌呤霉素濃度為5 μg/μL，故采用5 μg/μL的嘌呤霉素濃度作為細(xì)胞系篩選濃度。

3.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

在體視熒光顯微鏡下觀察BGC823細(xì)胞轉(zhuǎn)染pPBDP-VP5質(zhì)粒與pSPBT質(zhì)粒48 h后細(xì)胞GFP表達(dá)水平。如圖2所示，在顯微鏡下可觀察到大量綠色細(xì)胞團(tuán)，表明轉(zhuǎn)染成功，外源基因在BGC823細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。

3.3 單克隆細(xì)胞挑選擴(kuò)培

轉(zhuǎn)染后細(xì)胞經(jīng)濃度為5 μg/μL的嘌呤霉素篩選3 周后，稀釋挑選單克隆細(xì)胞于96孔板中培養(yǎng)。細(xì)胞在96孔板中培養(yǎng)72 h后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)與GFP表達(dá)，培養(yǎng)7 d后在熒光顯微鏡下可觀察到明顯單克隆細(xì)胞團(tuán)。圖3為熒光顯微鏡下單克隆細(xì)胞及由單克隆細(xì)胞生長(zhǎng)所得單克隆細(xì)胞團(tuán)。

3.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)BGC823-VP5細(xì)胞GFP表達(dá)

選擇3株BGC823-VP5（BGC823-VP5-1、BGC823-VP5-2、BGC823-VP5-3）單克隆細(xì)胞系將細(xì)胞以PBS稀釋至2×105個(gè)/mL后，以BGC823為對(duì)照流式檢測(cè)BGC823-VP5單克隆細(xì)胞純度與GFP表達(dá)。流式結(jié)果顯示，3株BGC823-VP5細(xì)胞系GFP陽(yáng)性率均達(dá)到99.9%，表明GFP在BGC823-VP5細(xì)胞系內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)（圖4）。

3.5 Western Blot檢測(cè)BGC823-VP5細(xì)胞VP5蛋白表達(dá)

BGC823-VP5與BGC823細(xì)胞全細(xì)胞裂解產(chǎn)物中加入蛋白上樣緩沖液后，經(jīng)高溫變性，PAGE膠電泳分離蛋白。Western Blot結(jié)果顯示：在BGC823-VP5細(xì)胞中存在VP5蛋白，在BGC823細(xì)胞中未檢到VP5蛋白（圖5）。

3.6 實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記動(dòng)態(tài)細(xì)胞分析技術(shù)（RTCA）檢測(cè)BGC823-VP5細(xì)胞生長(zhǎng)活性

RTCA檢測(cè)BGC823-VP5與BGC823細(xì)胞的生長(zhǎng)活性。結(jié)果顯示，在72 h內(nèi)，BGC823-VP5細(xì)胞的細(xì)胞指數(shù)（cell index）均高于BGC823細(xì)胞，表明外源基因的插入并未降低BGC823細(xì)胞生長(zhǎng)活性（圖6）。

4 結(jié)束語(yǔ)

根據(jù)抗原性差異，單純皰疹病毒可分為Ⅰ型和Ⅱ型，其中Ⅰ型主要感染口、唇的皮膚粘膜及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而Ⅱ型主要與外生殖器感染和新生兒感染有關(guān)。目前以Ⅰ型單純皰疹病毒為載體的溶瘤病毒產(chǎn)品T-Vec已在2015年上市，而以Ⅱ型單純皰疹病毒為載體的溶瘤病毒產(chǎn)品也已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。

NKG2A作為自然殺傷細(xì)胞受體家族2中的抑制性受體，是NK細(xì)胞表面優(yōu)先表達(dá)的跨膜蛋白之一，主要表達(dá)在NK細(xì)胞表面和部分T細(xì)胞表面。在免疫細(xì)胞表面， NKG2A與CD94分子（NK細(xì)胞表面膜蛋白）以二硫鍵連接形式形成的異質(zhì)二聚體復(fù)合物NKG2A/CD94。

人類白細(xì)胞抗原E（HLA-E）作為NK細(xì)胞表面抑制性受體CD94/NKG2A分子的唯一配體，廣泛表達(dá)于各類癌細(xì)胞表面，并通過(guò)結(jié)合CD94/NKG2A受體抑制NK細(xì)胞的激活[14]。本團(tuán)隊(duì)前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)oHSV2會(huì)在體外上調(diào)人胃癌BGC823細(xì)胞表面HLA-E的表達(dá)，并通過(guò)GST pull-down與質(zhì)譜技術(shù)證實(shí)了oHSV2上VP5蛋白為HLA-E的相互作用蛋白。

目前已有研究表明，人巨細(xì)胞病毒（HCMV）在感染腫瘤細(xì)胞后可上調(diào)腫瘤細(xì)胞表面HLA-E表達(dá)，其主要作用機(jī)制是通過(guò)病毒糖蛋白UL40所產(chǎn)生的肽段與HLA-E結(jié)合[15]。oHSV2在體外上調(diào)腫瘤細(xì)胞表面HLA-E表達(dá)的機(jī)制尚未明確，為研究oHSV2是否通過(guò)VP5蛋白上調(diào)人胃癌BGC823細(xì)胞表面HLA-E表達(dá)，使用PiggyBac 轉(zhuǎn)座質(zhì)粒系統(tǒng)與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將UL19基因插入BGC823細(xì)胞染色體上，通過(guò)嘌呤霉素篩選獲得成功表達(dá)GFP與VP5蛋白的單克隆細(xì)胞系。使用Western Blot與流式分別驗(yàn)證GFP與VP5蛋白在BGC823-VP5中表達(dá)。使用RTCA技術(shù)證實(shí)BGC823-VP5與BGC823細(xì)胞生長(zhǎng)活性一致。

本研究所構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)VP5蛋白的BGC823-VP5細(xì)胞系為研究oHSV2在體外上調(diào)腫瘤細(xì)胞表面HLA-E表達(dá)的機(jī)制提供了合適的細(xì)胞模型，同時(shí)此細(xì)胞系穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白，為后續(xù)探究VP5蛋白在小鼠動(dòng)物模型內(nèi)影響HLA-E表達(dá)及NK細(xì)胞抗腫瘤能力奠定了基礎(chǔ)。

［ 參 考 文 獻(xiàn) ］

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Construction of BGC823 Cell Line Stably Expressing VP5Protein of Herpes Simplex Virus Type Ⅱ

XIAO Xiong， ZHAO Xiaotong，LI Le， ZHOU Qin， WANG Yang， HU Han， LIU Binlei

（School of Food and Biological Engin.， Hubei Univ. of Tech.， Wuhan 430068， China）

Abstract： Oncolytic herpes simplex virus type Ⅱ oHSV2 is a new type of oncolytic virus obtained by genetic modification on the basis of herpes simplex virus type Ⅱ HSV-2. VP5 protein encoded by UL19 gene is one of the main capsid proteins of oHSV2. Our team has determined that VP5 protein of oHSV2 is the interaction protein of human leukocyte antigen E （HLA-E） through GST pull down and mass spectrometry detection and analysis in the early stage. HLA-E is a potent inhibitory ligand of CD94/NKG2A on the surface of CTL cells and NK cells. When it binds with CD94/NKG2A， the immune function of CTL cells and NK cells will be inhibited. On the basis of previous studies that have confirmed that oHSV2 can up regulate the expression of HLA-E on the surface of some tumor cell lines in vitro， in order to explore whether oHSV2 can up regulate the expression of HLA-E on the surface of tumor cell lines through VP5 protein， thereby affecting the binding of HLA-E and CD94/NKG2A， and ultimately changing the anti-tumor ability of NK cells， a human gastric adenocarcinoma cell line BGC823-VP5 stably expressing VP5 was constructed through PiggyBac transposition system. The positive rate of monoclonal cells in the constructed cell line was more than 99% by flow cytometry; Western Blot detected VP5 protein expression in cells; RTCA Real Time Cell AnaIysis showed that the growth activity of BGC823-VP5 cell line was consistent with that of its parent cell BGC823. The construction of a human gastric cancer cell line BGC823-VP5 stably expressing VP5 lays a foundation for exploring the effect of VP5 protein on oHSV2 on the expression of HLA-E in tumor cells and thus on the anti-tumor activity of NK cells.

Keywords： oncolytic herpes simplex virus type Ⅱ; VP5 protein; BGC823 cells

［責(zé)任編校： 張 眾］