吳水發(fā) 林志強(qiáng) 洪麗綿 張清泉 陳喆鳴 陳婷婷

福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院藥劑科，福建泉州 362000

伏立康唑（Voriconazole）是第二代三氮唑類抗真菌藥物，抗菌譜廣，對(duì)曲霉菌、念珠菌、隱球菌等深部真菌感染療效顯著，常用于侵襲性真菌病的治療與預(yù)防[1-3]。伏立康唑還可用于治療耐氟康唑念珠菌、鐮刀菌屬、足放線菌屬引起的嚴(yán)重感染[4-5]。

伏立康唑血藥濃度個(gè)體差異較大，易受CYP2C19基因多態(tài)性等因素的影響[6-8]。伏立康唑主要經(jīng)CYP2C19代謝，部分經(jīng)CYP2C9和CYP3A4代謝，同時(shí)伏立康唑能抑制這3種酶的活性，藥物相互作用較復(fù)雜[9]。使用伏立康唑的患者中約15%出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)，約30%療效欠佳[10]。因此，伏立康唑在臨床應(yīng)用中有必要進(jìn)行治療藥物監(jiān)測（therapeutic drug monitoring，TDM）。本研究擬建立一種反相高效液相色譜法，用于測定人血漿中伏立康唑濃度。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

島津高效液相色譜儀（LC-20AT型）；HC-2516高速離心機(jī)（安徽中科中佳科技儀器有限公司）；25BTS萬分之一電子天平（Satorius公司）；WXH微型渦旋混合器（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；MGS-2200C氮吹儀（EYELA，日本）。

1.2 試劑與藥品

伏立康唑化學(xué)對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)100862-201903）；卡馬西平化學(xué)對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)100142-201706）；甲醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司公司，色譜純）；乙腈（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，色譜純）；水為超純水；其他試劑均為分析純?？瞻籽獫{為健康人血漿，由福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院（本院）檢驗(yàn)科提供。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Shim-pack Scepter C18-120（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（57：43，V/V）；等度洗脫；流速：1.1 ml/min；柱溫：38 ℃；LC停止時(shí)間（L）：16 min；PDA結(jié)束時(shí)間（E）：16 min；檢測波長：255 nm；進(jìn)樣量：100 μl。

1.3.2 溶液及質(zhì)控品配備 伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)品溶液：精密稱取伏立康唑10.0 mg于10 ml容量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度。量取該伏立康唑貯備液適量，用甲醇稀釋，制得一系列伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)品溶液，質(zhì)量濃度分別為 0.3125、0.625、1.25、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 和 160.0 μg/ml。

卡馬西平內(nèi)標(biāo)溶液：稱取卡馬西平10.0 mg于10 ml容量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度。量取該卡馬西平貯備液適量，用甲醇稀釋，制得一系列卡馬西平內(nèi)標(biāo)溶液，質(zhì)量濃度分別為5、20、80 μg/ml。

伏立康唑質(zhì)控（QC）血漿樣本：吸取450 μl空白血漿，加入50 μl伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)品溶液，制得伏立康唑高、中、低3個(gè)濃度QC血漿樣本，質(zhì)量濃度分別為 8、2、0.5 μg/ml。

卡馬西平QC血漿樣本：吸取450 μl空白血漿，加入50 μl卡馬西平內(nèi)標(biāo)溶液，制得卡馬西平高、中、低3個(gè)濃度QC血漿樣本，質(zhì)量濃度分別為8、2、0.5 μg/ml。

1.3.3 血漿樣品預(yù)處理 ①加入乙腈600 μl，渦旋振蕩3 min，14 500 r/min離心5 min。②取全部上清，加入乙酸乙酯∶正己烷（4 ∶ 1，V/V）500 μl，渦旋振蕩1 min，15 000 r/min離心5 min。③吸取全部上層有機(jī)相，50℃下氮?dú)獯蹈?。④殘?jiān)?00 μl流動(dòng)相復(fù)溶，渦旋振蕩3 min。14 500 r/min離心5 min。⑤取250 μl于進(jìn)樣瓶中，進(jìn)樣量100 μl。

1.4 方法學(xué)考察

1.4.1 專屬性考察 分別取空白血漿、空白血漿+伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)品溶液、空白血漿+卡馬西平內(nèi)標(biāo)溶液、空白血漿+伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)品溶液+卡馬西平內(nèi)標(biāo)溶液、患者血漿+卡馬西平內(nèi)標(biāo)溶液，總體積均為 500 μl，按“1.3.3”項(xiàng)預(yù)處理，按“1.3.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析。

1.4.2 伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)曲線與最低定量限考察 伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別取450 μl空白血漿，加入50 μl伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)品溶液，使伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)品溶液終濃度分別為 0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 和 16.00 μg/ml，再各加入 50 μl質(zhì)量濃度為20 μg/ml的卡馬西平內(nèi)標(biāo)溶液。按“1.3.3”項(xiàng)預(yù)處理，按“1.3.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析。以伏立康唑峰面積（A）與卡馬西平峰面積（AI）比值即A/AI為縱坐標(biāo)，以伏立康唑濃度為橫坐標(biāo)，采用最小加權(quán)二乘法進(jìn)行線性回歸分析。

最低定量限：取0.03125 μg/ml的伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)品溶液，平行檢測5次，以考察靈敏度。

1.4.3 提取回收率考察 假設(shè)A為伏立康唑/卡馬西平高、中、低3個(gè)濃度QC血漿樣本，B為用流動(dòng)相配置成與A相同濃度的高、中、低3個(gè)濃度的伏立康唑/卡馬西平標(biāo)準(zhǔn)溶液樣本。A、B所取體積均為500 μl，每個(gè)濃度取5個(gè)樣本。按“1.3.3”項(xiàng)預(yù)處理，按“1.3.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算提取回收率。提取回收率=A峰面積/B峰面積。

1.4.4 準(zhǔn)確度和精密度考察 取伏立康唑高、中、低3個(gè)濃度QC血漿樣本各450 μl，再各加入50 μl質(zhì)量濃度為20 μg/ml的卡馬西平內(nèi)標(biāo)溶液。按“1.3.3”項(xiàng)預(yù)處理，按“1.3.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析。每個(gè)濃度取5個(gè)樣本，連續(xù)檢測3 d，計(jì)算日內(nèi)及日間精密度。

1.4.5 穩(wěn)定性考察 從3個(gè)條件進(jìn)行穩(wěn)定性考察：①室溫穩(wěn)定性：室溫放置24 h；②長期冷凍穩(wěn)定性：于-20 ℃冷凍保存3個(gè)月；③反復(fù)凍融穩(wěn)定性：反復(fù)凍融3次。取伏立康唑高、中、低3個(gè)濃度QC血漿樣本各450 μl，再各加入50 μl質(zhì)量濃度為20 μg/ml的卡馬西平內(nèi)標(biāo)溶液。按“1.3.3”項(xiàng)預(yù)處理，按“1.3.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析。每個(gè)條件每個(gè)濃度各取5個(gè)樣本，計(jì)算實(shí)測值。

1.4.6 實(shí)用性考察 以臨床實(shí)際檢測樣本為例，考察方法學(xué)的實(shí)用性。取患者血漿500 μl，加入50 μl質(zhì)量濃度為20 μg/ml的卡馬西平內(nèi)標(biāo)溶液。按“1.3.3”項(xiàng)預(yù)處理，按“1.3.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果

2.1 專屬性

伏立康唑和卡馬西平色譜峰完全分離，峰形良好，其中卡馬西平色譜峰保留時(shí)間約8.8 min，伏立康唑保留時(shí)間約13.1 min。本方法專屬性較好。見圖1。

圖1 血漿中伏立康唑和卡馬西平的高效液相色譜圖

2.2 伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)曲線與最低定量限

伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.3791x+0.0039（R2=0.9992，N=10）。伏立康唑在0.03125～16 μg/ml內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。伏立康唑最低定量限為0.03125 μg/ml。0.03125 μg/ml伏立康唑血漿樣本經(jīng)5次檢測，準(zhǔn)確度為（101.54±13.15）%，RSD為12.95%，信噪比S/N＞3，符合靈敏度要求。見圖2。

圖2 伏立康唑在空白血漿樣本中的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.3 提取回收率

伏立康唑及卡馬西平提取回收率均＞92%，方法可行。見表1。

表1 提取回收率檢測結(jié)果（，n=5，%）

表1 提取回收率檢測結(jié)果（，n=5，%）

濃度（μg/ml） 伏立康唑 卡馬西平8 95.53±9.70 94.14±6.59 2 92.53±6.45 92.13±4.71 0.5 93.33±5.37 93.72±8.33

2.4 準(zhǔn)確度和精密度

各梯度濃度日內(nèi)、日間RSD均＜10%，該方法準(zhǔn)確度和精密度符合生物樣本分析要求。見表2。

表2 測定伏立康唑血藥濃度方法學(xué)的精密度和準(zhǔn)確度（，n=5）

表2 測定伏立康唑血藥濃度方法學(xué)的精密度和準(zhǔn)確度（，n=5）

QC濃度（μg/ml）（μg/ml）RSD（%）日間濃度（μg/ml）RSD（%）日內(nèi)濃度8 7.91±0.28 3.54 7.81±0.32 4.08 2 2.02±0.18 8.86 1.91±0.17 8.99 0.5 0.51±0.05 9.94 0.49±0.05 9.98

2.5 穩(wěn)定性

3種不同穩(wěn)定性條件下，伏立康唑檢測結(jié)果穩(wěn)定性較好，RSD均＜15%。見表3。

表3 不同條件下伏立康唑在血漿中的穩(wěn)定性（，n=5）

表3 不同條件下伏立康唑在血漿中的穩(wěn)定性（，n=5）

實(shí)驗(yàn)條件（%） 實(shí)測值 RSD（%）室溫24 h 7.95±0.27 3.431.99±0.2311.460.51±0.0714.69冷凍3個(gè)月 7.83±0.182.291.92±0.178.81 0.47±0.0613.39凍融3次 7.78±0.33 4.261.86±0.2412.710.48±0.0611.95 8 μg/ml 2 μg/ml 0.5 μg/ml實(shí)測值 RSD（%） 實(shí)測值 RSD

2.6 實(shí)用性

2020年本院共檢測230個(gè)伏立康唑樣本，中位數(shù)為2.19（1.14～3.50）μg/ml。其中60.87%在1～5.5 μg/ml，21.74%低于目標(biāo)值，17.39%高于目標(biāo)值。選取其中有代表性意義的18個(gè)樣本，制成散點(diǎn)圖，分析本方法學(xué)的實(shí)用性。見圖3。

圖3 部分臨床樣本TDM結(jié)果

3 討論

3.1 預(yù)處理方法的選擇

有文獻(xiàn)[11]采取3∶1（V/V）甲醇沉淀法處理血漿樣本，該方法可使伏立康唑過度稀釋，導(dǎo)致檢測靈敏度下降。也有文獻(xiàn)[12]采用2∶1（V/V）乙腈沉淀法，再用氮?dú)獯蹈?，少許流動(dòng)相復(fù)溶，可解決伏立康唑過度稀釋的問題。但研究中發(fā)現(xiàn)，氮?dú)獯蹈珊蟮某猎须s質(zhì)太多，部分呈黏稠狀，很難徹底吹干，加入流動(dòng)相后，溶解不夠充分，且內(nèi)源性物質(zhì)濃度同時(shí)被放大，影響檢測結(jié)果。因此，本研究在采取乙腈沉淀蛋白法的基礎(chǔ)上，用萃取液（乙酸乙酯/正己烷，4∶1，V/V）萃取，再用氮吹法將上層有機(jī)相吹干，加少量流動(dòng)相復(fù)溶。通過乙腈沉淀法及萃取法，血漿樣本中的蛋白沉淀較完全，內(nèi)源性物質(zhì)去除較徹底，對(duì)目標(biāo)色譜峰干擾少，在一定程度上可降低柱壓，降低色譜柱堵塞風(fēng)險(xiǎn)，起到保護(hù)色譜柱的作用。通過氮?dú)獯蹈煞吧倭苛鲃?dòng)相復(fù)溶法，可使伏立康唑及卡馬西平高度濃縮，伏立康唑最低定量限可達(dá)0.03125 μg/ml，檢測靈敏度明顯改善[11-12]。另一方面，血樣預(yù)處理后，伏立康唑及卡馬西平提取回收率較高，本方法學(xué)具優(yōu)越性。

3.2 流動(dòng)相的選擇

HPLC法測定伏立康唑血藥濃度多采用磷酸鹽緩沖液[13-16]。在色譜分析系統(tǒng)中，常使用緩沖鹽調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值。但緩沖鹽的過度使用會(huì)縮短色譜柱的使用壽命，特別是當(dāng)緩沖鹽析出時(shí)，可造成色譜柱堵塞，引起柱壓升高、柱效下降，使保留時(shí)間不穩(wěn)定或色譜峰形發(fā)生改變（裂峰、拖尾等）。緩沖液易滋生細(xì)菌，pH值易發(fā)生改變，常要求現(xiàn)配現(xiàn)用，也增加了工作量。本研究采用甲醇-水作為流動(dòng)相，配制簡單，可有效保護(hù)色譜系統(tǒng)。甲醇價(jià)格低廉且化學(xué)穩(wěn)定性較好，使色譜條件更為穩(wěn)定。研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)甲醇-水比例為57∶43（V/V），柱溫為38 ℃，流速為1.1 ml/min時(shí)，可在縮短出峰時(shí)間的同時(shí)保證良好的分離度，有效提高檢測效率。

3.3 內(nèi)標(biāo)物的選擇

內(nèi)標(biāo)物應(yīng)具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、與目標(biāo)物質(zhì)不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)、與目標(biāo)物質(zhì)極性差異大等特點(diǎn)。本研究采用卡馬西平作為內(nèi)標(biāo)物，可符合要求。研究表明，內(nèi)標(biāo)峰與樣品峰分離度大于2。研究中發(fā)現(xiàn)，卡馬西平內(nèi)標(biāo)溶液于4 ℃冰箱放置1年仍可保持較好的穩(wěn)定性。

3.4 本方法用于治療藥物監(jiān)測的意義

2020年本院共檢測230個(gè)伏立康唑樣本，只有60.87%的樣本在目標(biāo)范圍內(nèi)，進(jìn)一步說明進(jìn)行伏立康唑TDM的必要性。根據(jù)TDM結(jié)果，進(jìn)行合理的用藥建議，有效提高伏立康唑臨床應(yīng)用的有效性和安全性，進(jìn)一步說明本方法學(xué)的實(shí)用性。

研究表明[17]，當(dāng)伏立康唑未給予負(fù)荷劑量時(shí)，要在5～7 d后才能達(dá)到穩(wěn)態(tài)血藥濃度，當(dāng)給予負(fù)荷劑量時(shí)，在3～5 d后可達(dá)到穩(wěn)態(tài)血藥濃度。有劑量調(diào)整時(shí)，應(yīng)于調(diào)整后5 d復(fù)查血藥濃度[18]。國內(nèi)外多部指南均建議伏立康唑應(yīng)給予負(fù)荷劑量，并進(jìn)行TDM，在發(fā)生不良反應(yīng)、治療效果欠佳、序貫給藥、停用或增加可能引起相互作用的藥物時(shí)應(yīng)再次進(jìn)行TDM[19-20]。當(dāng)伏立康唑低于1 μg/ml時(shí)，容易導(dǎo)致治療失??；當(dāng)濃度高于5.5 μg/ml不良反應(yīng)發(fā)生率較高，包括肝毒性、視覺障礙、神經(jīng)毒性、皮疹等[21-22]。因此，普遍認(rèn)為1～5.5 mg/L是一個(gè)能最大化提高療效，同時(shí)能明顯減少不良反應(yīng)的TDM濃度范圍[23]。

TDM進(jìn)一步證實(shí)正確采血時(shí)間的重要性。1號(hào)樣本濃度為0.65 μg/ml。經(jīng)分析，該患者在使用伏立康唑第2天就采血，此時(shí)因尚未達(dá)到穩(wěn)態(tài)血藥濃度，建議第4天復(fù)查，結(jié)果為2.27 μg/ml（2號(hào)樣本）。3號(hào)樣本濃度為0.72 μg/ml，采血時(shí)間為第3天再次給藥前30 min。經(jīng)分析，該患者未予負(fù)荷劑量，給藥第3天未達(dá)到穩(wěn)態(tài)血藥濃度，建議第5天復(fù)查，結(jié)果為1.66 μg/ml（4號(hào)樣本）。5號(hào)樣本濃度為0.46 μg/ml，建議增加劑量，劑量調(diào)整后第2天復(fù)查，結(jié)果為0.79 μg/ml（6號(hào)樣本）。經(jīng)分析，該患者中途更改劑量，但劑量調(diào)整后第2天尚未達(dá)到穩(wěn)態(tài)血藥濃度，建議劑量調(diào)整后第5天復(fù)查，結(jié)果為 1.95 μg/ml（7 號(hào)樣本）。

TDM可發(fā)現(xiàn)潛在的藥物相互作用。8號(hào)樣本濃度為7.89 μg/ml，經(jīng)分析，該患者同時(shí)聯(lián)用奧美拉唑，CYP2C19為超快代謝型。奧美拉唑可競爭性抑制CYP2C19代謝酶，使伏立康唑消除減慢[24]。降低劑量后，濃度恢復(fù)到3.32 μg/ml（9號(hào)樣本）。10號(hào)樣本濃度為0.61 μg/ml，經(jīng)分析，該患者同時(shí)聯(lián)用地塞米松。伏立康唑聯(lián)用地塞米松時(shí)可使伏立康唑的清除率增加41.0%[25]。停用地塞米松后，濃度恢復(fù)到2.09 μg/ml（11號(hào)樣本）。12號(hào)樣本濃度為0.09 μg/ml，經(jīng)分析，該患者為肺結(jié)核患者，但在伏立康唑給藥前3 d已停用利福平。利福平為細(xì)胞色素P450酶強(qiáng)誘導(dǎo)劑，停藥后其肝藥酶誘導(dǎo)作用仍可持續(xù)7～10 d，甚至更長[26]。該患者停用利福平12 d后，重啟伏立康唑藥物治療方案，最終測得濃度為1.91 μg/ml（13號(hào)樣本）。

兒童伏立康唑血藥濃度個(gè)體差異比成人更明顯，影響因素更復(fù)雜，血藥濃度與劑量相關(guān)性較小，一般需要比成人更大的劑量（按體重算）[27]。14號(hào)樣本濃度為0.84 μg/ml，經(jīng)分析，該患者為5歲男孩，體重18 kg，給藥方案為100 mg，q12 h。根據(jù)說明書，伏立康唑用于2～12歲兒童，維持劑量8 mg/kg。最后調(diào)整給藥方案為150 mg，q12 h，血藥濃度升到1.88 μg/ml（15號(hào)樣本），抗感染效果明顯改善。通過伏立康唑TDM，可實(shí)現(xiàn)兒童患者的個(gè)體化給藥。

TDM可發(fā)現(xiàn)潛在的藥物不良反應(yīng)。16號(hào)樣本濃度為8.98 μg/ml，經(jīng)分析，該患者入院時(shí)肝功能正常，用伏立康唑治療后第5天谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶均升高了3倍多，同時(shí)伏立康唑谷濃度為8.98 μg/ml。伏立康唑血藥濃度≥4～6 μg/ml時(shí)，肝損傷的風(fēng)險(xiǎn)可增加4倍[28]。經(jīng)綜合考慮，建議醫(yī)生停用伏立康唑，改用卡泊芬凈，1周后轉(zhuǎn)氨酶恢復(fù)正常。17號(hào)樣本濃度為6.79μg/mL，同時(shí)患者出現(xiàn)低鉀血癥、視物模糊。經(jīng)分析，該患者出現(xiàn)低鉀血癥可能與伏立康唑濃度過高有關(guān)[29]。降低伏立康唑劑量后，復(fù)查血藥濃度為2.51 μg/ml（18號(hào)樣本），同時(shí)該患者電解質(zhì)紊亂得到糾正，視力恢復(fù)正常。

綜上所述，伏立康唑體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)復(fù)雜，個(gè)體差異較大，藥物相互作用較多，有必要進(jìn)行TDM。本方法學(xué)靈敏度高、專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，滿足開展TDM的基本要求。在方法學(xué)應(yīng)用中，解決了很多臨床實(shí)際問題，實(shí)現(xiàn)個(gè)體化給藥。