羅 輝，何雨薇，張杏亞，阮振甜，羅瑞明，李亞蕾*

（寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

動(dòng)物宰后細(xì)胞中的線粒體不會(huì)立刻停止活動(dòng)，繼續(xù)保持活力并消耗氧。線粒體具有氧化磷酸化、參與三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循環(huán)、能量轉(zhuǎn)化和鈣離子儲(chǔ)存等代謝功能[1]。宰后畜禽肌肉轉(zhuǎn)化為食用肉需經(jīng)過(guò)一系列生理生化的熟化過(guò)程，線粒體執(zhí)行代謝功能，其中代謝酶和氧化還原酶等蛋白在其中發(fā)揮著重要作用。肉品質(zhì)形成及變化與能量物質(zhì)及伴隨產(chǎn)能生成的產(chǎn)物相關(guān)，能量基礎(chǔ)物質(zhì)對(duì)肌紅蛋白表達(dá)、分子穩(wěn)定及3 種衍生態(tài)的轉(zhuǎn)化起決定性作用[2]，無(wú)氧糖酵解過(guò)程在產(chǎn)能的同時(shí)也會(huì)產(chǎn)酸，導(dǎo)致肌肉酸化的問(wèn)題[3]。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)線粒體能量代謝調(diào)控方面進(jìn)行了一定的研究。楊玲等[4]研究細(xì)胞中線粒體蛋白ISCA2低表達(dá)對(duì)三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）代謝的影響，結(jié)果表明，線粒體蛋白ISCA2低表達(dá)后，線粒體呼吸鏈復(fù)合體中鐵硫蛋白亞基出現(xiàn)不同程度下調(diào)，鐵硫簇組裝被抑制，導(dǎo)致鐵硫蛋白功能障礙，影響線粒體復(fù)合體活性和氧化磷酸化系統(tǒng)，造成細(xì)胞能量代謝紊亂。Postnikova等[5]研究指出氧合肌紅蛋白通過(guò)與線粒體相互作用脫氧，缺氧會(huì)誘導(dǎo)多種增加能量產(chǎn)生的補(bǔ)償機(jī)制發(fā)生。Lavie等[6]研究琥珀酸脫氫酶亞基A的泛素蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin proteasome system，UPS）依賴(lài)性降解及其對(duì)線粒體能量代謝的生理影響，證明多種氧化磷酸化蛋白的轉(zhuǎn)化率依賴(lài)于UPS，線粒體能量代謝發(fā)生紊亂會(huì)造成活性氧堆積過(guò)多、電子傳遞鏈損傷、線粒體動(dòng)力學(xué)受損、生物能量失衡、線粒體鈣離子堆積等。在能量物質(zhì)對(duì)肉品質(zhì)影響的研究中，藏磊等[7]以H2O2活性氧清除劑N-乙酰-L-半胱氨酸、H2O2+腺苷一磷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）抑制劑處理的牦牛肉背最長(zhǎng)肌為對(duì)象，研究活性氧誘導(dǎo)AMPK通路對(duì)宰后牦牛肉成熟過(guò)程中糖酵解及肉品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)能量代謝與肌肉質(zhì)量及肉制品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值相關(guān)。

秦川牛作為國(guó)內(nèi)陜甘寧地區(qū)的優(yōu)勢(shì)特色畜種，近5 年來(lái)年均存欄數(shù)約300萬(wàn) 頭，年均出欄數(shù)約100萬(wàn) 頭，年均肉產(chǎn)量約50萬(wàn) t[8]，且肉質(zhì)細(xì)致、肉味濃厚、瘦肉比例高、營(yíng)養(yǎng)均衡，深受消費(fèi)者喜愛(ài)[9]。非標(biāo)記定量（label-free quantitative，LFQ）蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)不依賴(lài)于同位素標(biāo)記，該技術(shù)通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，分析蛋白酶解肽段的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行相對(duì)定量[10]。在3D蛋白質(zhì)組學(xué)根據(jù)保留時(shí)間、質(zhì)荷比（m/z）、離子強(qiáng)度3 個(gè)維度的基礎(chǔ)上，加入離子淌度作為第4維度，離子淌度主要根據(jù)離子的形狀和截面進(jìn)行分離，為復(fù)雜體系樣品的測(cè)定帶來(lái)更多可能[11-13]。為探究秦川牛肉冷藏期間能量代謝變化機(jī)理及其對(duì)肉品質(zhì)的影響。采用4D-LFQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，利用Wolfpsort軟件預(yù)測(cè)蛋白的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位，篩選線粒體定位的差異蛋白。使用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法檢測(cè)能量基本物質(zhì)一磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）等的含量，并進(jìn)行相關(guān)性分析，篩選與能量代謝相關(guān)的差異蛋白，再進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析和蛋白間相互作用（protein-protein interaction，PPI）分析。研究在不同貯藏期冷鮮牛肉中線粒體定位蛋白中能量代謝相關(guān)差異蛋白，分析所得差異蛋白涉及到的信號(hào)通路，以期從線粒體定位蛋白的表達(dá)豐度變化闡明宰后肌肉組織能量代謝障礙的機(jī)制，為進(jìn)一步探索能量代謝紊亂對(duì)肌肉肉色穩(wěn)定性和酸化的影響提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

25 月齡秦川公牛 甘肅省平?jīng)鍪袥艽h旭康食品有限責(zé)任公司。

三乙基碳酸氫銨（色譜純）、尿素（色譜純）、碘代乙酰胺（色譜純）、三氟乙酸 美國(guó)Sigma公司；胰酶（Ref：V5111） 美國(guó)Promega公司；混合蛋白酶抑制劑 Calbiochem（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超聲波細(xì)胞破碎機(jī) 那艾精密儀器（上海）有限公司；CR-400便攜式色差儀 日本柯尼卡-美能達(dá)公司；205便攜式pH計(jì) 德國(guó)Testo公司；MiniVac Alpha冷凍離心機(jī)美國(guó)ScanSpeed公司；timsTOF Pro質(zhì)譜儀、NanoElute HPLC儀 德國(guó)Bruker 公司；-80 ℃超低溫冰箱美國(guó)Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

選取9 頭25 月齡生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)良好、健康無(wú)病秦川公牛。采樣前用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液對(duì)取樣工具進(jìn)行消毒處理。屠宰后修整牛胴體，用去離子水沖洗，選取背最長(zhǎng)肌，每頭牛取3 個(gè)平行，共27 個(gè)樣品。所有樣品均分割成塊狀置于聚乙烯薄膜（透氣性23.5 g/（m2·d））內(nèi)，于0～4 ℃冰箱中貯藏。樣品分為3 組，分別在貯藏0、4 d和8 d時(shí)取出，立即放入液氮中冷凍2 h，再置于-80 ℃冰箱中貯藏，待后續(xù)檢測(cè)分析使用。

1.3.2 背最長(zhǎng)肌中能量基本物質(zhì)ATP、ADP、AMP、NADH含量的測(cè)定

稱(chēng)取約50 mg樣品于EP管中，加入1 mL預(yù)冷（4 ℃）混合液（1 mmol/L乙二胺四乙酸+0.6 mol/L高氯酸），充分勻漿2 min，4 ℃、10 000×g離心10 min，取上清液500 μL，過(guò)膜后于-80 ℃冰箱中保存。參考洪平等[14]的方法采用HPLC法檢測(cè)ATP、ADP、AMP、NADH含量。色譜條件：流動(dòng)相為220 mmol/L硫酸鉀緩沖液，內(nèi)含體積分?jǐn)?shù)10%甲醇，用四丁基氫氧化銨調(diào)節(jié)pH值至6.5，等比洗脫，流速0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。

1.3.3 肉色測(cè)定

參考D’Alessandro等[15]的方法并進(jìn)行修改，采用色差儀，經(jīng)白板校對(duì)后檢測(cè)肉樣亮度（L*值）、紅度（a*值）、黃度（b*值）。測(cè)定前用濾紙吸去肉樣表面水分，每塊肉樣取3 個(gè)不同點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果取平均值。

1.3.4 pH值測(cè)定

參照左惠心[16]的方法，先將pH計(jì)用pH 4.01、6.86和9.18的緩沖溶液校對(duì)，然后順肌纖維方向插入肉樣內(nèi)部，取3 個(gè)不同點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果取平均值。

1.3.5 4 D-LFQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測(cè)蛋白含量

取適量樣品放入液氮預(yù)冷后的研缽中，加入液氮充分研磨至粉末狀。再加入樣品體積4 倍的裂解緩沖液（8 mol/L尿素+1%蛋白酶抑制劑），超聲裂解后放入低溫離心機(jī)中，4 ℃、12 000×g離心10 min，取上清液，用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。

向上述蛋白溶液中添加二硫蘇糖醇溶液至蛋白濃度為5 mmol/L，置于56 ℃環(huán)境下還原30 min。再加入100 mmol/L碘代乙酰胺溶液使其終濃度為11 mmol/L，室溫避光環(huán)境下靜置12 min。為避免裂解液中尿素影響胰酶活力，需用四乙基溴化銨溶液將蛋白樣品溶液中尿素濃度稀釋至2 mol/L以下。按照蛋白質(zhì)量的2%添加胰酶，37 ℃酶解12 h后，再按照蛋白質(zhì)量的1%添加胰酶，37 ℃酶解4 h。酶解完成后使用C18固相萃取小柱萃取肽段。

HPLC-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)條件：流動(dòng)相A為含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸的乙腈溶液，流動(dòng)相B為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水溶液。洗脫程序：0～3 min、4%～6% A，4～70 min、6%～25% A，71～82 min、25%～32% A，83～87 min、32%～80% A，88～90 min、80%～100% A；流速300 nL/min。采用流動(dòng)相B溶解肽段，NanoElute超高效液相系統(tǒng)進(jìn)行分離。肽段分離后注入到Capillary離子源（電壓1.4 kV）中進(jìn)行電離，使用飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)肽段母離子及其二級(jí)碎片進(jìn)行檢測(cè)和分析，掃描范圍m/z100～1700。平行累積串行碎裂（parallel accumulation serial fragmentation，PASEF）模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。一級(jí)質(zhì)譜采集后進(jìn)行PASEF模式采集母離子電荷數(shù)在0～5范圍內(nèi)的二級(jí)譜圖，采集次數(shù)10 次。為避免母離子的重復(fù)掃描，串聯(lián)質(zhì)譜掃描的動(dòng)態(tài)排除時(shí)間設(shè)置為24 s。

1.3.6 數(shù)據(jù)庫(kù)搜索

使用Maxquant v1.6.6.0對(duì)實(shí)驗(yàn)中所得二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索。檢索參數(shù)設(shè)置如下：選擇Bos_taurus_9913_PR_20190915.fasta（37 948 條序列）作為數(shù)據(jù)庫(kù)，加入常見(jiàn)的污染庫(kù)消除鑒定結(jié)果中污染蛋白的影響，加反庫(kù)消除計(jì)算隨機(jī)匹配造成的假陽(yáng)性率影響；Main Search與First Search的一級(jí)母離子質(zhì)量誤差容忍度均設(shè)為40×10-6Da，二級(jí)碎片離子質(zhì)量誤差容忍度設(shè)為0.04 Da；肽段最大修飾數(shù)、漏切位點(diǎn)數(shù)和肽段最小長(zhǎng)度分別設(shè)置為5、2和7；酶切方式為T(mén)rypsin/P。固定修飾為半胱氨酸烷基化，可變修飾為蛋白N端的乙?；图琢虬彼岬难趸?。肽匹配圖譜鑒定的假陽(yáng)性率和蛋白匹配率均設(shè)置為1%。

1.3.7 生物信息學(xué)分析

用Wolfpsort軟件預(yù)測(cè)蛋白的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位，篩選出線粒體定位的豐度差異蛋白，利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.genome.jp/kegg/）檢索途徑對(duì)能量代謝相關(guān)的線粒體定位差異蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析。通過(guò)String 10.0網(wǎng)站（http://string-db.org/）繪制差異蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。運(yùn)用SPSSAU統(tǒng)計(jì)軟件分析線粒體定位差異白質(zhì)與能量代謝指標(biāo)間的Pearson相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同貯藏時(shí)間秦川牛背最長(zhǎng)肌線粒體定位差異蛋白的確定

采用4D-LFQ蛋白質(zhì)組學(xué)方法測(cè)定秦川牛宰后貯藏過(guò)程中蛋白質(zhì)組的變化，共鑒定得到1 149 種蛋白，以差異倍數(shù)大于1.2為標(biāo)準(zhǔn)，篩選鑒定出120 種豐度差異蛋白。利用Wolfpsort軟件預(yù)測(cè)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位，KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.genome.jp/kegg/）檢索途徑對(duì)能量代謝相關(guān)的線粒體定位蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，共鑒定出21 種線粒體定位的差異蛋白，具體如表1所示。

表1 不同貯藏時(shí)間秦川牛背最長(zhǎng)肌線粒體定位差異蛋白篩選結(jié)果Table 1 Differentially located proteins in Longissimus dorsi muscle of Qinchuan cattle at different storage periods

2.2 不同貯藏時(shí)間秦川牛背最長(zhǎng)肌中能量基本物質(zhì)含量

如表2所示，隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，ATP含量呈極顯著或顯著下降趨勢(shì)（P＜0.01、P＜0.05），貯藏4 d時(shí)背最長(zhǎng)肌中仍含有一定量高活性的ATP酶[17]，ATP含量迅速降低，但ATP含量仍有（1.20±0.45）μmol/g，之后緩慢下降，至貯藏8 d時(shí)降低至（0.50±0.20）μmol/g，這可能是由于隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，ATP酶變性失活。ADP、AMP含量在貯藏0～8 d期間也呈極顯著或顯著下降趨勢(shì)（P＜0.01、P＜0.05），牛宰后肌肉組織中ATP進(jìn)行不可逆降解，即ATP→ADP→AMP[18]，隨著ATP含量的降低，ADP、AMP含量逐漸降低。NADH含量變化反映了細(xì)胞內(nèi)能量變化和氧化還原狀態(tài)。貯藏過(guò)程中NADH含量逐漸降低，原因可能是貯藏期間線粒體結(jié)構(gòu)受損、功能失調(diào)，呼吸功能中斷，導(dǎo)致NADH含量顯著下降。張同剛[19]研究畜禽宰后肌肉組織中NADH含量變化，結(jié)果表明貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)導(dǎo)致NADH含量逐漸降低，且貯藏7 d后幾乎無(wú)法檢測(cè)到NADH，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。該結(jié)果提示隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，牛背最長(zhǎng)肌中能量代謝發(fā)生變化，氧化還原狀態(tài)發(fā)生紊亂。

表2 不同貯藏時(shí)間秦川牛背最長(zhǎng)肌中ATP、ADP、AMP、NADH含量Table 2 Contents of ATP, ADP, AMP and NADH in Longissimus dorsi muscle of Qinchuan cattle at different storage periods μmol/g

2.3 線粒體定位差異蛋白表達(dá)豐度與能量代謝物質(zhì)含量的相關(guān)性

采用SPSSAU軟件進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，根據(jù)線粒體定位差異蛋白表達(dá)豐度與能量代謝指標(biāo)（ATP、ADP、AMP、NADH含量）的相關(guān)系數(shù)發(fā)現(xiàn)，表2中大部分差異蛋白的表達(dá)豐度與肉的能量代謝物質(zhì)含量相關(guān)，其中相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值大于0.5的蛋白有6 種（表3）。ATP5F1D、ATP5F1C表達(dá)豐度與ATP、ADP含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）；NDUFB5表達(dá)豐度與ATP、NADH含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；NDUFA6表達(dá)豐度與ATP含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與NADH含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；SUCLA2表達(dá)豐度與ADP、AMP含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與ATP、NADH含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。COX7A1表達(dá)豐度與ATP、ADP含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。表明宰后貯藏過(guò)程中，線粒體定位的6 種差異蛋白與能量代謝密切相關(guān)。

表3 線粒體定位差異蛋白表達(dá)豐度與ATP、ADP、AMP、NADH含量的Pearson相關(guān)性Table 3 Pearson correlation between mitochondrial localization differential protein expression abundance and contents of ATP, ADP,AMP and NADH

2.4 能量代謝相關(guān)的線粒體定位差異蛋白的生物信息學(xué)分析結(jié)果

圖1為與能量代謝相關(guān)的線粒體定位差異蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，該網(wǎng)絡(luò)中PPI富集的P值為1.68×10-11，聚類(lèi)系數(shù)為0.861。ATP5F1D、ATP5F1C、NDUFA6、NDUFB5、SUCLA2相互作用強(qiáng)烈，形成互作網(wǎng)絡(luò)，ATP5F1D和COX7A1存在共表達(dá)作用，圖中有4 條反應(yīng)途徑顯示豐富，主要參與TCA循環(huán)和呼吸電子傳遞、嵴的形成、通過(guò)化學(xué)滲透耦合進(jìn)行ATP合成以及通過(guò)解偶聯(lián)蛋白產(chǎn)生熱量，在代謝通路中發(fā)揮著重要作用[20]。

圖1 能量代謝相關(guān)的線粒體定位差異蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 PPI network diagram of mitochondrial localization differential proteins related to energy metabolism

通過(guò)KEGG注釋代謝通路分析發(fā)現(xiàn)，6 種線粒體定位差異蛋白參與了8 條生物信號(hào)通路，差異蛋白主要富集在氧化磷酸化（bta00190）、代謝途徑（bta01100）、生熱反應(yīng)（bta04714）等相關(guān)代謝通路中。為探究秦川牛肉宰后冷藏期間能量代謝變化對(duì)其品質(zhì)的影響，本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)與ATP的產(chǎn)生和消耗密切相關(guān)的氧化磷酸化代謝通路進(jìn)行闡述。氧化磷酸化代謝通路中差異蛋白表達(dá)的變化如圖2所示。差異蛋白主要參與線粒體電子傳遞、線粒體呼吸鏈復(fù)合物I裝配、ATP生物合成等過(guò)程。根據(jù)KEGG基因名稱(chēng)可知，上調(diào)蛋白ATP5F1D為F型H+運(yùn)輸ATP酶亞基δ，ATP5F1C為F型H+運(yùn)輸ATP酶亞基γ，主要參與ATP生物合成。上調(diào)蛋白NDUFA6、下調(diào)蛋白NDUFB5均為NADH脫氫酶亞基，兩者共同參與線粒體呼吸鏈復(fù)合物I的裝配。下調(diào)蛋白COX7A1為細(xì)胞色素c氧化酶亞基7A，調(diào)控線粒體呼吸鏈復(fù)合物IV的活性。下調(diào)蛋白SUCLA2為琥珀酸-CoA合成酶[ADP形成]亞基，在ATP合成和水解過(guò)程中有重要作用。以上6 種蛋白共同參與氧化磷酸化代謝通路，影響線粒體電子的傳遞。

圖2 氧化磷酸化代謝通路中線粒體定位差異蛋白表達(dá)豐度的變化Fig.2 Variation in abundance of mitochondrial localization differentially expressed proteins in oxidative phosphorylation metabolic pathway

2.5 線粒體定位差異蛋白對(duì)能量代謝的影響機(jī)理

ATP5F1D和ATP5F1C分別為ATP合酶亞基δ和亞基γ。ATP合酶能夠利用電子梯度和相關(guān)膜電勢(shì)合成ATP，在連接質(zhì)子轉(zhuǎn)位和ATP合成過(guò)程中起重要作用[21]。F1F0型ATP合成酶是能量交換的關(guān)鍵酶[22]，由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成（圖3）：蘑菇頭部分F1位于線粒體基質(zhì)側(cè)，由5 個(gè)亞基（α3、β3、γ1、δ、ε1）組成，具有與底物結(jié)合的協(xié)調(diào)作用機(jī)制，同時(shí)具有ATP合酶的催化活性；蘑菇莖部分F0大部分嵌在線粒體內(nèi)膜中，承擔(dān)離子通道作用[23]。

圖3 ATP合酶結(jié)構(gòu)示意圖[24]Fig.3 Schematic diagram of ATP synthase structure[24]

ATP合酶可以合成也可消耗ATP。ATP合酶的γ亞基每旋轉(zhuǎn)360°的同時(shí)合成3 分子的ATP。當(dāng)ATP合酶逆向轉(zhuǎn)動(dòng)，ATP被水解成ADP和磷酸基團(tuán)（Pi），同時(shí)消耗能量將質(zhì)子從線粒體基質(zhì)反向泵入線粒體膜間隙。本研究中氧化磷酸化信號(hào)通路所涉及的差異蛋白ATP5F1D、ATP5F1C，屬于F1部分，ATP5F1D、ATP5F1C表達(dá)豐度均與ATP含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），ATP5F1D表達(dá)豐度在貯藏第4天較第0天上調(diào)了1.819 倍，貯藏第8天較第0天上調(diào)了1.516 倍，ATP5F1C表達(dá)豐度在第8天較第0天上調(diào)了1.579 倍（表1）。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，ATP5F1D、ATP5F1C表達(dá)豐度改變，導(dǎo)致關(guān)鍵酶ATP合成酶不能正常發(fā)揮其功能，細(xì)胞不能正常交換能量，這是宰后細(xì)胞能量代謝紊亂的重要機(jī)制。

SUCLA2為琥珀酸-CoA合成酶[ADP形成]亞基，琥珀酰輔酶A合成酶（succinyl-CoA synthetase，SUCL）參與TCA，琥珀酰輔酶A在琥珀酸硫激酶作用下使高能硫酯鍵水解，將能量轉(zhuǎn)移至二磷酸鳥(niǎo)苷生成三磷酸鳥(niǎo)苷及琥珀酸，生成的三磷酸鳥(niǎo)苷可直接利用，也可將Pi轉(zhuǎn)移給ADP生成ATP[25]，琥珀酰輔酶A的水解與ATP的合成偶聯(lián)，是TCA中底物水平磷酸化的唯一代表步驟。SUCL是一個(gè)異構(gòu)二聚體，由一個(gè)固定的α亞基SUCL-α和一個(gè)底物特異性的p亞基組成，p亞基可提供核苷酸特異性并與底物琥珀酸結(jié)合[26]，由SUCLA2基因編碼的A-SUCL-β與SUCL-a結(jié)合可以合成ATP。貯藏期間SUCLA2表達(dá)豐度隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)下調(diào)。SUCLA2低表達(dá)后SUCL活性降低。本實(shí)驗(yàn)中，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，背最長(zhǎng)肌ATP、NADH含量均出現(xiàn)不同程度的降低，SUCLA2表達(dá)豐度與ATP、NADH含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），由此說(shuō)明，SUCLA2低表達(dá)造成細(xì)胞氧化磷酸化水平降低，影響能量的生成。

NDUFB5、NDUFA6為NADH脫氫酶的亞復(fù)合物亞基，NADH脫氫酶位于線粒體內(nèi)膜呼吸鏈中，催化電子從NADH傳遞給輔酶Q，是線粒體電子傳遞鏈中的復(fù)合體I，被稱(chēng)為氧化磷酸化的“入口酶”[27]。NDUFB5表達(dá)豐度與NADH含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。NDUFA6表達(dá)豐度與NADH含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。本實(shí)驗(yàn)中NDUFA6表達(dá)豐度在貯藏4 d后呈上調(diào)趨勢(shì)，第4天是第0天的1.467 倍，NDUFB5表達(dá)豐度在貯藏0～4 d期間差異不顯著，之后呈下調(diào)趨勢(shì)，貯藏第8天較第4天調(diào)整0.497 倍。NDUFB5、NDUFA6主要參與的反應(yīng)途徑為復(fù)合物I的生物發(fā)生（bta6799198）。在生成復(fù)合物I的反應(yīng)途徑中，中間產(chǎn)物II與mt-ND1/NDUFAFS/NDUFAF6復(fù)合物結(jié)合形成315 kDa亞復(fù)合物，ND2、ND3、ND6、NDUFB5結(jié)合MCIA復(fù)合物形成370 kDa亞復(fù)合物。NDUFB5、NDUFA6參與電子呼吸鏈中復(fù)合物I的裝配，楊玲等[4]研究發(fā)現(xiàn)復(fù)合體I亞基水平在貯藏8 d后出現(xiàn)不同程度的降低，亞基蛋白的低表達(dá)影響電子在線粒體呼吸鏈中的正常傳遞。在本實(shí)驗(yàn)中，隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，ATP含量快速下降，表明NDUFB5的低表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞氧化磷酸化水平下降，影響能量的釋放。

COX7A1是細(xì)胞色素c氧化酶亞基7A1，細(xì)胞色素c氧化酶位于線粒體內(nèi)膜上，處于線粒體電子傳遞鏈的末端[28]，將呼吸底物的電子經(jīng)過(guò)細(xì)胞色素系統(tǒng)直接傳遞給分子態(tài)氧，將氧還原成水。細(xì)胞色素c氧化酶活力能夠控制線粒體呼吸鏈的電子傳遞能力，從而控制線粒體偶聯(lián)的效率，以及活性氧的產(chǎn)生。細(xì)胞色素c氧化酶含有多個(gè)金屬輔因子和亞基，其中COX1、COX2和COX3亞基參與形成催化反應(yīng)中心，由細(xì)胞核基因編碼的COX4、COX5a、COX6a、COX7a和COX8等13 個(gè)亞基指導(dǎo)細(xì)胞色素c氧化酶在線粒體內(nèi)正確裝配，同時(shí)維持細(xì)胞色素c氧化酶構(gòu)象穩(wěn)定[29]。本實(shí)驗(yàn)中COX7A1表達(dá)豐度在貯藏第8天較第4天調(diào)整了0.692 倍，COX7A1的低表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞色素c氧化酶亞基缺失，質(zhì)子通道以及氧化還原中心結(jié)構(gòu)的裝配發(fā)生錯(cuò)誤，造成細(xì)胞色素c氧化酶結(jié)構(gòu)紊亂，線粒體功能缺失，不能正常傳遞質(zhì)子，氧化磷酸化受到抑制，導(dǎo)致細(xì)胞中能量轉(zhuǎn)移不能正常進(jìn)行，從而影響宰后肌肉組織的能量代謝。

2.6 秦川牛宰后由于能量代謝引起的肌肉品質(zhì)變化

2.6.1 肉色

宰后貯藏過(guò)程中，牛肉顏色會(huì)發(fā)生顯著變化。如圖4所示，L*值反映肉品的亮度，L*值在貯藏0～4 d呈上升趨勢(shì)，貯藏4～8 d呈緩慢下降趨勢(shì)。a*值反映肉品的紅度，貯藏過(guò)程中a*值極顯著降低，從第0天的23.77下降至第8天的10.27。b*值反映肉品的黃度，b*值在貯藏0～8 d呈緩慢上升趨勢(shì)，從第0天的12.46增長(zhǎng)至第8天的14.87。

圖4 不同貯藏時(shí)間秦川牛背最長(zhǎng)肌肉色的變化Fig.4 Effect of storage time of on meat color Longissimus dorsi of Qinchuan cattle

生鮮肉變色的主要原因是高鐵肌紅蛋白（methemoglobin，MetMb）的積累，因此降低MetMb含量對(duì)保持生鮮肉色澤至關(guān)重要，肌紅蛋白3 種衍生態(tài)能量大小不同，依次為脫氧肌紅蛋白（deoxy-myoglobin，DeoMb）＞MetMb＞氧合肌紅蛋白（oxy-myoglobin，OxyMb），3 種肌紅蛋白更易由能量高向能量低的狀態(tài)轉(zhuǎn)化[9,30]。MetMb到DeoMb的反應(yīng)為吸熱反應(yīng)，需要ATP參與，SUCLA2、ATP5F1D蛋白異常表達(dá)降低了細(xì)胞氧化磷酸化水平，本實(shí)驗(yàn)中背最長(zhǎng)肌ATP含量在宰后貯藏第4天時(shí)較第0天降低了88.2%，ATP含量大量減少，造成MetMb向DeoMb轉(zhuǎn)化的反應(yīng)難以進(jìn)行，從而導(dǎo)致MetMb累積，肉色發(fā)生褐變[31]。有學(xué)者研究表明，NADH的氧化速率與MetMb的形成速率有關(guān)[32]，NADH含量越高，MetMb含量積累量也就越多[33]，而隨著肌肉中MetMb含量逐漸增加，a*值呈現(xiàn)下降趨勢(shì)[34]，這與表4中a*值與NADH含量呈極顯著正相關(guān)的結(jié)果一致。NDUFA6和NDUFB5蛋白的異常表達(dá)降低了NADH脫氫酶活力，從而使NADH積累，本實(shí)驗(yàn)中背最長(zhǎng)肌NADH含量在貯藏第4天時(shí)較第0天僅降低了26.1%，NADH含量相對(duì)較高，這表明MetMb大量積累，促使肉品發(fā)生褐變。綜上可以看出，能量物質(zhì)的含量高低可以一定程度影響肉色的維持。

表4 貯藏期間秦川牛背最長(zhǎng)肌色差與能量代謝指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)Table 4 Correlation coefficients between color difference values and energy metabolism indexes of Qinchuan cattle Longissimus dorsi muscle

2.6.2 肌肉酸化

秦川牛背最長(zhǎng)肌宰后酸化程度可用pH值體現(xiàn)，如圖5所示，宰后秦川牛背最長(zhǎng)肌pH值呈“V”型變化，從第0天的6.75下降至第4天的5.38，下降了20.3%；宰后第4天到第8天僅上升了5.8%。

圖5 不同貯藏時(shí)間秦川牛背最長(zhǎng)肌pH值的變化Fig.5 Changes in pH of Qinchuan cattle Longissimus dorsi during storage

如表5所示，pH值與ATP、ADP含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與NADH呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與AMP無(wú)顯著相關(guān)性。屠宰前動(dòng)物體的血液循環(huán)可以為肌肉組織提供所需氧氣，肌肉組織中糖代謝主要以有氧代謝的形式進(jìn)行；而屠宰后血液循環(huán)停止，在氧供應(yīng)不足的情況下，產(chǎn)無(wú)氧糖酵解反應(yīng)開(kāi)始活躍[3,34-35]。糖酵解在產(chǎn)生能量的同時(shí)會(huì)產(chǎn)生乳酸，導(dǎo)致肌肉pH值下降[36]。因此秦川牛宰后無(wú)氧糖酵解在產(chǎn)生ATP同時(shí)產(chǎn)生乳酸，進(jìn)一步促進(jìn)宰后牛肉的酸化。

表5 貯藏期間秦川牛背最長(zhǎng)肌pH值與能量代謝指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)Table 5 Correlation coefficients between pH and energy metabolism indexes of Qinchuan cattle Longissimus dorsi muscle

2.6.3 肌肉嫩化

消費(fèi)者在選擇牛肉時(shí)將嫩度作為判斷肉品質(zhì)的重要因素，因此嫩度在一定程度上決定了肉品價(jià)值[16]。肉的嫩度可以通過(guò)剪切力和質(zhì)構(gòu)特性反映，肉在成熟過(guò)程中嫩度的改善和質(zhì)構(gòu)的變化主要?dú)w因于肌肉肌原纖維蛋白的降解[37-38]，線粒體中的ATP是細(xì)胞凋亡過(guò)程中一個(gè)關(guān)鍵影響因素[39]，ATP的缺失會(huì)導(dǎo)致線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔的開(kāi)放和/或線粒體跨膜電位下降，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡發(fā)生[40]。細(xì)胞凋亡會(huì)引發(fā)肌肉蛋白合成和降解速率失衡，使肌肉蛋白的合成速率遠(yuǎn)低于降解速率，造成肌肉纖維蛋白含量減少，進(jìn)而使牛肉的嫩度和質(zhì)構(gòu)發(fā)生變化[41]。貯藏期間秦川牛背最長(zhǎng)肌質(zhì)構(gòu)特性與能量物質(zhì)相關(guān)系數(shù)如表6所示，ATP含量與剪切力、硬度和彈性均呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與內(nèi)聚性和咀嚼度呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。王琳琳等[42]在研究宰后牦牛細(xì)胞凋亡對(duì)肌肉內(nèi)環(huán)境與嫩度影響時(shí)也證明細(xì)胞凋亡對(duì)肌肉嫩化具有重要作用，這與Chen Lin等[43]的研究結(jié)論一致。綜上，能量物質(zhì)ATP的含量對(duì)肉品的嫩度變化具有一定影響。

表6 貯藏期間秦川牛背最長(zhǎng)肌質(zhì)構(gòu)特性與能量代謝指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)Table 6 Correlation coefficients between texture properties and energy metabolism indexes of Qinchuan cattle Longissimus dorsi muscle

3 結(jié) 論

采用4D-LFQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)宰后秦川牛肉不同貯藏時(shí)間蛋白表達(dá)豐度進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，與能量代謝相關(guān)差異表達(dá)蛋白主要為氧化還原酶類(lèi)和代謝酶類(lèi)。秦川牛肉不同貯藏時(shí)間差異表達(dá)蛋白質(zhì)對(duì)能量代謝存在不同程度的調(diào)控作用。能量物質(zhì)含量的變化對(duì)肉品質(zhì)產(chǎn)生一定影響。ATP含量的降低影響MetMb向DeoMb轉(zhuǎn)化，造成肉色褐變；肌肉酸化中糖酵解在產(chǎn)生能量的同時(shí)產(chǎn)生乳酸，導(dǎo)致肌肉酸化；ATP影響肌細(xì)胞的凋亡造成肌纖維蛋白降解，促進(jìn)肌肉嫩化。因此通過(guò)一定措施降低宰后生理活動(dòng)、減少能量消耗、降低能量的產(chǎn)生可以保證肉品質(zhì)的穩(wěn)定性。