夏輝 趙雁林

快速、準(zhǔn)確的實驗室診斷對于發(fā)現(xiàn)結(jié)核病患者、確定有效治療方案、獲取良好治療效果，以及阻止結(jié)核病在社區(qū)中的傳播至關(guān)重要。過去十幾年，結(jié)核病新診斷技術(shù)的研發(fā)取得了顯著進展,世界衛(wèi)生組織已經(jīng)推薦了若干新型結(jié)核病診斷技術(shù)。2021年2月 18日，世界衛(wèi)生組織發(fā)布了《關(guān)于更新使用結(jié)核分枝桿菌及其耐藥性核酸擴增檢測技術(shù)的建議》(簡稱《建議》)(UpdateontheuseofnucleicacidamplificationteststodetectTBanddrug-resistantTB:rapidcommunication)[1]。此文件的發(fā)布與更新表明，在結(jié)核病及耐藥結(jié)核病的診斷領(lǐng)域又有了新的進展和更多可選擇的工具，在原來推薦的如多色半巢式熒光定量PCR、微流體芯片技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法、線性探針耐多藥及二線抗結(jié)核藥物耐藥性檢測技術(shù)等的基礎(chǔ)上[2]又提供了更多可選擇的技術(shù)和產(chǎn)品。這些技術(shù)和產(chǎn)品的實驗數(shù)據(jù)呈現(xiàn)出了較好的診斷效能，為進一步推廣應(yīng)用帶來新的前景。筆者就世界衛(wèi)生組織《建議》的產(chǎn)生背景、涉及技術(shù)的特征、性能指標(biāo)，以及我國結(jié)核病防治規(guī)劃實施中相關(guān)領(lǐng)域需要關(guān)注的問題和啟示進行闡述，供業(yè)內(nèi)人士參考。

一、背景

該文件在發(fā)布前通過系統(tǒng)綜述分析了目標(biāo)技術(shù)或產(chǎn)品的技術(shù)指標(biāo)和成本等，并根據(jù)PICO(PICO是基于循證醫(yī)學(xué)理論將信息格式化的檢索方式，為Participants, Interventions, Comparisons, Outcomes的縮寫)原則，確定技術(shù)指標(biāo)(敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值)、用途、預(yù)期達到的目的，以及與其他檢查方法的可比性及區(qū)別等。由于在系統(tǒng)綜述過程中未查詢到所列技術(shù)的成本效果分析，該《建議》中描述的成本分析主要是基于前期類似技術(shù)已發(fā)表研究結(jié)果或單一儀器或試劑的成本。該《建議》的形成是通過全球?qū)＜医M咨詢，并結(jié)合系統(tǒng)綜述中的技術(shù)指標(biāo)、成本及操作簡易程度、可接受性、公平性、可獲得性等進行綜合判斷，最終給出應(yīng)用建議。

二、推薦的產(chǎn)品技術(shù)

目前世界衛(wèi)生組織結(jié)核病診斷評估機制是為了評估各類結(jié)核病診斷技術(shù)，不再針對特定產(chǎn)品。以前世界衛(wèi)生組織在推薦使用各種產(chǎn)品和技術(shù)時往往是單個產(chǎn)品的推薦，主要是囿于當(dāng)時可用的技術(shù)種類有限。隨著生物技術(shù)產(chǎn)品的日益增多，世界衛(wèi)生組織不再推薦單一的、某一種特定產(chǎn)品，而是對技術(shù)進行了歸類，主要依據(jù)操作的復(fù)雜程度和手工操作步驟的多寡，將核酸擴增檢測技術(shù)(nucleic acid amplification tests， NAAT)進行了歸類，分別命名為低度復(fù)雜程度自動化核酸擴增檢測技術(shù)(low complexity automated NAAT))、中度復(fù)雜程度自動化核酸擴增檢測技術(shù)(moderate complexity automated NAAT)及高度復(fù)雜程度核酸雜交檢測技術(shù)(high complexity hybridization-based NAAT)。這些定義描述了技術(shù)的類型(如基于自動化的或雜交的NAAT)及操作的復(fù)雜程度(依據(jù)所需設(shè)施、設(shè)備及技術(shù)要求等區(qū)分低度、中度或高度復(fù)雜程度)。需要注意的是，該《建議》所列出的復(fù)雜程度僅作為指導(dǎo)這些技術(shù)產(chǎn)品具體應(yīng)用時所考慮的其中一種因素，其他包括但不限于診斷準(zhǔn)確性、應(yīng)用地區(qū)的結(jié)核病及耐藥結(jié)核病流行病學(xué)特征、實施層面的因素(結(jié)果報告周期、檢測通量、現(xiàn)有檢驗設(shè)施和實驗室網(wǎng)絡(luò)等)、成本，以及技術(shù)的可接受性、公平性、終端應(yīng)用的價值和用戶使用偏好等因素。

該《建議》內(nèi)定義的低度復(fù)雜程度自動化核酸擴增檢測技術(shù)目前只納入了賽沛的Xpert MTB/XDR，該方法是基于10色熒光通道的多重PCR技術(shù)，需要注意的是Xpert MTB/XDR并不能直接使用原有的GeneXpert儀器平臺，需要對儀器核心模塊進行更新或者重新購買儀器。其完成檢測1份樣本約需90 min，需要手工操作的步驟非常少。此外，因世界衛(wèi)生組織于2020年10月對廣泛耐藥結(jié)核病(XDR-TB)的定義進行了修訂和更新[3]，準(zhǔn)XDR-TB (Pre-XDR-TB)定義為滿足耐多藥/利福平耐藥結(jié)核病(MDR/RR-TB)且同時對任一氟喹諾酮類藥物耐藥，XDR-TB定義為滿足MDR/RR-TB且同時對任一氟喹諾酮類藥物耐藥并至少對其他A組抗結(jié)核藥物中的一種藥物耐藥。故使用Xpert MTB/XDR并不意味著可以檢測新定義下的XDR-TB患者，該方法目前也不能檢測貝達喹啉、利奈唑胺及其他可能歸入A組的藥物。

《建議》內(nèi)定義的中度復(fù)雜程度自動化核酸擴增檢測技術(shù)目前包含4個平臺的產(chǎn)品，分別是雅培(RealTime MTB和RealTime MTB RIF/INH)、海恩生命科學(xué)(MTBDR和FluoroType MTB)、碧迪(MAXTMMDR-TB)和羅氏(MTB和MTB-RIF/INH)的產(chǎn)品技術(shù)。這些產(chǎn)品僅可用于診斷結(jié)核病、利福平及異煙肼耐藥。此處“中度復(fù)雜程度”主要依據(jù)涉及的自動化核酸提取、自動化PCR擴增、自動化結(jié)果讀取幾個步驟之間無需或只有1個移液步驟。在將檢測標(biāo)本加入到試劑盒之前，此類“自動測試”僅需初始標(biāo)本處理時的手工操作，開展此類技術(shù)的實驗室應(yīng)滿足并采取一定的生物安全防護措施并配備特定設(shè)備，此外還需要訓(xùn)練有素、操作熟練的實驗室人員來進行檢測并完成儀器維護要求等。 此類技術(shù)包含的4種產(chǎn)品雖均為自動化產(chǎn)品，但自動化程度及結(jié)果報告周期不盡相同，詳細(xì)對比情況見表1[4]。4種產(chǎn)品較之前世界衛(wèi)生組織推薦的基于手工操作和人工判讀結(jié)果的線性探針技術(shù)在操作復(fù)雜性方面有了很大改進。

表1 中等復(fù)雜程度自動化核酸擴增檢測技術(shù)不同產(chǎn)品對比情況

高度復(fù)雜程度核酸擴增雜交檢測技術(shù)目前只包含了用于吡嗪酰胺耐藥診斷的尼普洛(日本)的Genoscholar PZA-TB Ⅱ方法。其操作與結(jié)果判讀與手工線性探針技術(shù)類似，操作繁瑣，人工操作步驟多，尤其是結(jié)果判讀完全依賴人工判讀，且因吡嗪酰胺耐藥相關(guān)基因pncA突變位點散布于整個基因，缺乏明顯的集中突變區(qū)域，故需要判讀的條帶多且復(fù)雜，因此結(jié)果判讀受人為因素影響較大。

本次世界衛(wèi)生組織更新的《建議》雖根據(jù)復(fù)雜程度將不同的產(chǎn)品進行了大致的歸類，但每大類都包含了特定的診斷產(chǎn)品技術(shù)，不代表其他技術(shù)可以自動歸入相應(yīng)的類別，任何新的同類別產(chǎn)品技術(shù)都需要開展具體評估后追加更新到相應(yīng)的類別。

三、耐藥性檢測的藥物種類

現(xiàn)有的3種歸類法除了操作復(fù)雜程度外還區(qū)分了檢測技術(shù)的應(yīng)用范圍，如對結(jié)核分枝桿菌和抗結(jié)核藥物耐藥性的檢測。原有的世界衛(wèi)生組織推薦的技術(shù)如Xpert MTB/RIF雖然在全球應(yīng)用最廣泛，但僅能檢測利福平耐藥性。線性探針技術(shù)既有針對利福平和異煙肼的檢測產(chǎn)品，也有針對氟喹諾酮類及二線注射類藥物的耐藥性檢測產(chǎn)品，但由于線性探針技術(shù)自動化程度較低，使得應(yīng)用該技術(shù)的實驗室相對較少。

該《建議》中的低度復(fù)雜程度自動化核酸檢測技術(shù)Xpert MTB/XDR法可同時檢測異煙肼、氟喹諾酮類藥物、二線注射類藥物以及乙硫異煙胺相關(guān)的耐藥基因突變。中度復(fù)雜程度的自動化核酸擴增檢測技術(shù)目前仍僅針對結(jié)核分枝桿菌及對利福平和異煙肼的耐藥性檢測。高度復(fù)雜程度的Genoscholar PZA-TB Ⅱ僅可用于檢測吡嗪酰胺耐藥性，這也是目前唯一的一個用于檢測吡嗪酰胺耐藥性的分子生物學(xué)檢測技術(shù)。

四、三類技術(shù)的診斷效能

1． 低度復(fù)雜程度的自動化核酸擴增檢測技術(shù)診斷效能:包含3項研究的1605份樣本的系統(tǒng)綜述結(jié)果顯示，對在細(xì)菌學(xué)確診的肺結(jié)核患者，以表型藥物敏感性試驗為參考，在痰標(biāo)本中檢測異煙肼耐藥的匯總敏感度為94.2%(95%CI：89.3%～97.0%)，匯總特異度為98.0%(95%CI：95.2%～99.2%)；檢測氟喹諾酮類藥物耐藥的匯總敏感度為93.1%(95%CI:88.0%～96.1%)，匯總特異度為98.3%(95%CI：94.5%～99.5%)；檢測阿米卡星耐藥的匯總敏感度為89.1%(95%CI：80.9%～94.1%)，匯總特異度為99.5%(95%CI：96.9%～99.9%)。因乙硫異煙胺的表型藥物敏感性試驗的準(zhǔn)確性欠佳，故以inhA啟動子區(qū)測序作為檢測乙硫異煙胺耐藥性的參考標(biāo)準(zhǔn)，乙硫異煙胺耐藥檢測的匯總敏感度為96.4%(95%CI：92.2%～98.3%)，匯總特異度為100.0%(95%CI:82.5%～100.0%)。

2．中度復(fù)雜程度的自動化核酸擴增檢測技術(shù)診斷效能:包含32項研究的16 726份樣本的系統(tǒng)綜述結(jié)果顯示，以分離培養(yǎng)為標(biāo)準(zhǔn)，中度復(fù)雜程度的自動化核酸擴增檢測技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌的匯總敏感度為93.0%(95%CI：90.9%～94.7%)，匯總特異度為97.7%(95%CI：95.6%～98.8%)。以表型藥物敏感性試驗為標(biāo)準(zhǔn)，檢測利福平耐藥的匯總敏感度為96.7%(95%CI：93.1%～98.4%)，匯總特異度為98.9%(95%CI：97.5%～99.5%)；檢測異煙肼耐藥的匯總敏感度為86.4%(95%CI：82.8%～89.3%)，匯總特異度為99.2%(95%CI：98.1%～99.7%)。

3．高度復(fù)雜程度的核酸擴增雜交檢測技術(shù)診斷效能：包含7項研究的964份樣本的系統(tǒng)綜述結(jié)果顯示，以表型藥物敏感性試驗為標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)菌學(xué)確診肺結(jié)核患者分離株中，檢測吡嗪酰胺耐藥的匯總敏感度為81.2%(95%CI：75.4%～85.8%)，匯總特異度為97.8%(95%CI：96.5%～98.6%)。

五、對我國結(jié)核病防治的啟示

1．基于循證醫(yī)學(xué)證據(jù)結(jié)合廣泛代表性的專家論證是科學(xué)決策的有效方法：世界衛(wèi)生組織的技術(shù)文件通常都是在系統(tǒng)文獻綜述的基礎(chǔ)上，召集有代表性的專家，根據(jù)PICO原則，確定相關(guān)指標(biāo)，并基于循證醫(yī)學(xué)證據(jù)和專家論證意見，形成具有通用性和普遍性的技術(shù)推薦意見?；谘C醫(yī)學(xué)證據(jù)的科學(xué)決策方法值得我們學(xué)習(xí)和效仿，也需要在此基礎(chǔ)上，根據(jù)具體國情制定符合我國國情的技術(shù)措施和技術(shù)對策。

2．應(yīng)用創(chuàng)新診斷工具是結(jié)核病精準(zhǔn)診斷及治療的有效手段：由過去僅能檢測抗酸桿菌的涂片鏡檢發(fā)展到可以快速準(zhǔn)確檢測結(jié)核分枝桿菌的分子生物學(xué)檢測技術(shù)，由僅能通過結(jié)果報告周期約2～3個月的表型藥物敏感性試驗到自動化針對多種藥物的分子生物學(xué)耐藥基因檢測，甚至是基因組學(xué)預(yù)測耐藥。結(jié)核病實驗室檢測技術(shù)的創(chuàng)新和進步推動了結(jié)核病的精準(zhǔn)診斷和治療方案的選擇?！督ㄗh》中的低度復(fù)雜程度的Xpert MTB/XDR法可以快速、準(zhǔn)確的提供除利福平之外其他幾種藥物的耐藥性檢測。該方法適用于縣(區(qū))級應(yīng)用，可以有效將耐藥結(jié)核病的診斷關(guān)口前移，對耐藥結(jié)核病的診斷及后續(xù)更加精準(zhǔn)的治療產(chǎn)生促進作用。而異煙肼耐藥性結(jié)果的及時獲得可以準(zhǔn)確診斷MDR-TB，而不是目前的以RR-TB替代MDR-TB。異煙肼敏感性的及時獲得對于我國預(yù)防性治療方案的選擇亦發(fā)揮作用。左氧氟沙星及莫西沙星作為MDR/RR-TB治療中的A類藥物，在組成有效治療方案及保護貝達喹啉等其他藥物發(fā)生獲得性耐藥中也發(fā)揮著作用[5-6]，乙硫異煙胺及吡嗪酰胺均歸類為治療MDR/RR-TB的C組藥物，在無法獲得其他藥品如貝達喹啉、德拉瑪尼、利奈唑胺時仍考慮使用[7]，故通過Xpert MTB/XDR-TB及快速、準(zhǔn)確地獲得氟喹諾酮類及其他藥品耐藥結(jié)果，對于更加精準(zhǔn)地制定治療方案十分有意義。精準(zhǔn)及有效治療方案的組成有助于殺滅患者體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌，對于患者個體可以提高治愈率，對于人群而言有助于減少耐藥結(jié)核病的傳播。

《建議》中的低度復(fù)雜程度及中度復(fù)雜程度的自動化核酸擴增檢測技術(shù)將有助于其更快地在結(jié)核病防治規(guī)劃中的高質(zhì)量擴展。

3.多種創(chuàng)新工具的出現(xiàn)需要因地施策和應(yīng)用：世界衛(wèi)生組織將在2021年更新的《結(jié)核病整合指南模塊3診斷-結(jié)核病快速檢測》中發(fā)布關(guān)于檢測結(jié)核病和耐藥結(jié)核病的核酸擴增檢測技術(shù)的最新政策指南。雖然《建議》中所列技術(shù)均未獲得我國相關(guān)部門的批準(zhǔn)，我們也需要提前考慮如何有效地在結(jié)核病防治規(guī)劃中應(yīng)用這些技術(shù)或同類技術(shù)，不同的地區(qū)可根據(jù)本地異煙肼及氟喹諾酮類藥物的耐藥率、疾病負(fù)擔(dān)、不同層級的實驗室能力及設(shè)施等制定適宜的策略。若兩種藥物的耐藥率較高，則迫切需要加強基于自動化核酸擴增檢測技術(shù)的廣泛應(yīng)用，可以考慮在縣(區(qū))級應(yīng)用Xpert MTB/XDR。相反，若耐藥率低，則在經(jīng)費有限的情況下短期內(nèi)可維持現(xiàn)有診斷流程，即在地市級采用快速耐藥基因檢測方法檢測MDR/RR-TB，后續(xù)用表型藥物敏感性試驗方法檢測其他藥物耐藥。在地市級使用這些技術(shù)，仍然存在標(biāo)本轉(zhuǎn)運延誤、診斷延誤、患者失訪等風(fēng)險，因此要加強如標(biāo)本轉(zhuǎn)運、患者管理、結(jié)果反饋等配套措施的建立和有效運行。但從結(jié)核病控制的角度，還是應(yīng)盡快推廣應(yīng)用這些自動化的核酸擴增耐藥檢測技術(shù)，盡可能提供快速準(zhǔn)確的耐藥性診斷。

實施層面各地需要相應(yīng)的政策支持，如各地物價的申請、醫(yī)保政策的支持等。對于使用Xpert MTB/RIF的地方，使用Xpert MTB/RIF時，除了試劑成本外，亦需要進行重新更換模塊及校準(zhǔn)[8]。若引入新的中度復(fù)雜程度自動化核酸擴增檢測技術(shù)，需要新的設(shè)施、設(shè)備和試劑，實驗室人員和臨床醫(yī)生培訓(xùn)，以及新的質(zhì)量保證系統(tǒng)等。

4．開展基礎(chǔ)與實施性研究進一步創(chuàng)新和改善診斷工具：《建議》中的幾種技術(shù)雖在呼吸道樣本中顯示出較高的敏感度，但在不同國家、區(qū)域和不同臨床標(biāo)本中的性能，在HIV感染者和兒童中的效能，在肺外樣本中的診斷效能尚未進行大范圍評估[9-10]，在我國更是缺乏相應(yīng)研究和數(shù)據(jù)。

一些突變頻率較低的位點并沒有納入作為異煙肼及氟喹諾酮類藥物耐藥檢測的靶標(biāo)序列[9，11]，可能在某些區(qū)域造成較低的敏感度。目前尚無基于分子生物學(xué)的貝達喹啉、德拉瑪尼等新藥的耐藥檢測技術(shù)，需要進一步開展基礎(chǔ)研究和應(yīng)用型研究以創(chuàng)新及改善現(xiàn)有診斷工具。

中度復(fù)雜程度的4種產(chǎn)品迫切需要補充對其他藥物的耐藥性檢測。用于吡嗪酰胺耐藥檢測的高度復(fù)雜程度核酸擴增雜交技術(shù)的操作仍過于復(fù)雜，仍需提升自動化水平。

我國同等功能的技術(shù)，需要范圍更廣的評估和驗證，從而推動我國自主知識產(chǎn)權(quán)產(chǎn)品技術(shù)的進一步發(fā)展和應(yīng)用。