王麗 熊坤龍 朱長太 范琳

耐多藥肺結核(multidrug-resistant pulmonary tuberculosis，MDR-PTB)因治愈率低、費用高、不良反應大等問題，迫切需要新的提高其治愈率的治療方法[1-2]。機體感染結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)后，經(jīng)過抗原呈遞細胞(antigen-presenting cells, APC)的成熟、活化及提呈，負載抗原的APC被遷移至局部淋巴組織并提呈給T淋巴細胞，經(jīng)抗原識別、活化、增殖、分化后迅速做出相應的免疫應答反應[3]，但當T淋巴細胞持續(xù)接觸大量抗原后，就會出現(xiàn)損傷，甚至耗竭[4]。由于目前對MTB持續(xù)刺激引起肺結核患者T淋巴細胞耗竭的研究多是針對普通肺結核，即便有MDR-PTB對MTB抗原的整體免疫應答降低和免疫功能受損的研究[5-8]，也并未探討其降低原因，更少見對T淋巴細胞耗竭的報道。因此，筆者納入藥物敏感性肺結核(drug susceptible pulmonary tuberculosis，DS-PTB)和MDR-PTB兩種類型患者，探討MDR-PTB患者是否存在T淋巴細胞耗竭，以及這種耗竭狀態(tài)下機體免疫功能發(fā)生了何種變化。

對象和方法

一、研究對象遴選

1.研究對象：采用前瞻性研究的方法，選取2020年1—8月同濟大學附屬上海市肺科醫(yī)院住院治療的58例肺結核患者作為研究對象，其中，MDR-PTB患者20例(MDR-PTB組)，DS-PTB患者38例(DS-PTB組)。MDR-PTB組男性和女性分別為13例(65.0%)和7例(35.0%)，年齡范圍[中位數(shù)(四分位數(shù))]為17～58歲[33.0(29.5,40.5)歲]，并發(fā)慢性阻塞性肺疾病和支氣管擴張癥1例(5.0%)；DS-PTB 組男性和女性分別為27例(71.1%)和11例(28.9%)，年齡范圍[中位數(shù)(四分位數(shù))]為15～65歲[30.0(24.0,46.0)歲]，并發(fā)慢性阻塞性肺疾病和支氣管擴張癥1例(2.6%)；兩組上述指標比較，差異均無統(tǒng)計學意義(χ2=0.224，P=0.636；Z=0.855，P=0.398；χ2=0.221，P=0.638)。同期納入健康志愿者(HD組)20名，其中，男性16名，女性4名，年齡范圍[中位數(shù)(四分位數(shù))]為20～42歲[29.5(26.8，32.5)歲]，無任何慢性疾病、感染及其他疾病。本研究已通過同濟大學附屬上海市肺科醫(yī)院倫理委員會批準(編號：K20-024Y)。

2.病例組入組標準：病例組患者均為痰分枝桿菌培養(yǎng)陽性且菌種鑒定為MTB，體外藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)提示為耐多藥或對一線及二線抗結核藥物均敏感，未接受抗結核藥物治療者。且排除非結核分枝桿菌感染、并發(fā)免疫缺陷疾病、長期服用免疫抑制劑者，或并發(fā)惡性腫瘤、糖尿病、結核性胸膜炎、其他肺外結核或重度營養(yǎng)不良者。

二、主要儀器及試劑

選用同濟大學附屬上海市肺科醫(yī)院國家結核病重點實驗室制備的MTB標準株H37Rv為參照菌株。主要使用儀器及試劑為DxFLEX流式細胞分析儀(美國貝克曼庫爾特有限公司)；TECAN Infinite 200 PRO酶標儀[帝肯(上海)貿易有限公司]；Sorvall ST 16R離心機(美國賽默飛世爾科技公司)；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素/鏈霉素(美國Gibco公司)；人外周血淋巴細胞分離液(美國GE公司)；紅細胞裂解液(上海碧云天生物技術有限公司)；抗人CD4-FITC(555346)、抗人CD3-PerCP-Cy5.5(552852)、抗人CD8-AF700(5579450)、 抗人Tim-3-BV650(565565)、抗人IFN-γ-PE-Cy7(557844)、抗人TNF-α-APC(554514)、抗人IL-2-BV421(564164)單克隆熒光抗體，以及固定活性染料510(564406)、胞內蛋白轉運抑制劑[布雷非德素A(555029)]和杜氏磷酸緩沖液(Dulbecco’s phosphate buffered saline，D-PBS)均購自美國BD公司；同型對照IgG1抗體(562652)、抗人PD-1-BV605(329924)單克隆熒光抗體均購自美國BioLegend公司；抗人Lag-3-APC-eF780單克隆熒光抗體(47-2239-42)購自美國賽默飛世爾科技公司。

三、研究方法

分離三組研究對象外周血單個核細胞(periphe-ral blood mononuclear，PBMC)，利用流式細胞術檢測其MTB抗原特異性CD4+和CD8+T淋巴細胞表面程序性死亡受體-1(PD-1)、T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3(Tim-3)和淋巴細胞活化基因-3(Lag-3)等抑制性受體的表達水平，以及胞內細胞因子白細胞介素-2(IL-2)、γ-干擾素(IFN-γ)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的分泌水平。

1.PBMC的分離：分別采集三組研究對象肘部靜脈血各10 ml，并進行抗凝處理。利用磷酸鹽緩沖液(PBS)等量稀釋，混勻，將稀釋后的血液加至淋巴細胞分離液上層。室溫1360×g離心20 min，用毛細滴管吸取中間外周血淋巴細胞層置于新的15 ml離心管中，再室溫470×g離心6 min，洗滌細胞。棄上清，加入4 ml 紅細胞裂解液，室溫放置10 min，去除紅細胞。350×g離心6 min，洗滌2次。收集管底細胞并計數(shù)，使用RPMI 1640完全培養(yǎng)基調整細胞濃度為4×106/ml，進行表面和細胞內染色。

2.流式細胞術檢測：加入500 μl/孔單細胞懸液于24孔微孔板中。MTB刺激組另需加入H37Rv(10 μg/ml)，37 ℃培養(yǎng)72 h。染色前4 h，加入布雷非德菌素A(4 μl/ml)，混勻，在37 ℃培養(yǎng)5 h后收取細胞，4 ℃ 350×g離心洗滌5 min，棄上清，使用1 ml D-PBS重懸。加入1 μl 固定活性染料510染色10 min，4 ℃ 350×g離心洗滌 5 min。加入抗人CD4-FITC、抗人CD3-PerCP-Cy5.5、抗人CD8-AF700、抗人Lag-3-APC-eF780、抗人PD-1-BV605、抗人Tim-3-BV650等單克隆熒光抗體各2 μl(200 μl/管)，避光4 ℃孵育30 min， 4 ℃ 350×g離心洗滌5 min，棄上清。加入250 μl固定破膜液重懸細胞，避光4 ℃ 孵育20 min，離心洗滌。加入抗人IL-2-BV421、抗人IFN-γ-PE-Cy7、抗人TNF-α-APC各2 μl，避光4 ℃孵育30 min后350×g離心洗滌5 min，使用200 μl D-PBS重懸，上機檢測。

四、統(tǒng)計學處理

采用SPSS 25.0軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。偏態(tài)分布的計量資料采用“中位數(shù)(四分位數(shù))[M(Q1,Q3)]”表示，組間差異的比較采用Mann-WhitneyU檢驗(獨立樣本)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、T淋巴細胞表面抑制性受體的表達水平

MDR-PTB組CD4+和CD8+T淋巴細胞表面PD-1和Tim-3的表達水平均明顯高于DS-PTB組和HD組，但DS-PTB組與HD組間差異均無統(tǒng)計學意義。CD4+和CD8+T淋巴細胞表面的Lag-3表達水平在三組間兩兩比較的差異均無統(tǒng)計學意義，見表1。

表1 CD4+ 和CD8+ T淋巴細胞表面抑制性受體在三組研究對象中表達情況的比較 [%，M(Q1,Q3)]

二、T淋巴細胞分泌免疫效應因子情況

MDR-PTB組和DS-PTB組CD4+和CD8+T淋巴細胞內IL-2分泌水平均明顯高于HD組(P值均<0.01)；而MDR-PTB組與DS-PTB組間差異均無統(tǒng)計學意義。DS-PTB組CD4+T淋巴細胞內IFN-γ分泌水平明顯高于HD組(P<0.05)；DS-PTB 組和MDR-PTB組CD8+T淋巴細胞內IFN-γ表達水平均明顯高于HD組(P值均<0.05)，而DS-PTB組與MDR-PTB組比較差異均無統(tǒng)計學意義。DS-PTB組CD4+T淋巴細胞內TNF-α分泌水平均明顯高于MDR-PTB組和HD組(P值均<0.01)，而CD8+T淋巴細胞內TNF-α的分泌水平在三組間兩兩比較的差異均無統(tǒng)計學意義，見表2。

表2 CD4+ 和CD8+ T淋巴細胞內免疫效應因子在三組研究對象中表達情況的比較 [%，M(Q1,Q3)]

討 論

MDR-PTB發(fā)病率的持續(xù)攀升進一步加重了結核病經(jīng)濟負擔。探討T淋巴細胞耗竭對MDR-PTB的免疫效應表達的影響，為治療MDR-PTB尋找新策略、提高治愈率提供了依據(jù)。T淋巴細胞耗竭是宿主發(fā)生慢性感染及惡性腫瘤的免疫特征之一[9-10]。在MTB感染菌量較大且時間較長時，會出現(xiàn)CD4+和CD8+T淋巴細胞耗竭，使機體處于免疫抑制狀態(tài)，不能有效清除MTB，表現(xiàn)為抑制性抗體如PD-1、Tim-3和Lag-3表達水平的升高[11-13]，這些指標的變化在慢性疾病中可作為T淋巴細胞耗竭的標記。PD-1、Tim-3和Lag-3是細胞表面上的一類抑制性分子，當人體免疫系統(tǒng)被激活時，這些免疫檢查點分子介導的抑制性通路就會被啟動，通過調控免疫反應的強度或持續(xù)時間來抑制免疫應答，降低其對周圍組織的損傷[14]。PD-1持續(xù)表達是T淋巴細胞耗竭的表現(xiàn)特征之一[15]；而Tim-3可抑制T淋巴細胞的活化，促使其失活，并且下調效應細胞因子的產(chǎn)生[16]；Lag-3則通過與其配體結合，抑制輔助性Th1細胞的活化[17]，故抑制三者的表達水平可促進T淋巴細胞的增殖[18]。

本研究通過比較MDR-PTB、DS-PTB和HD組抑制性受體表達量的變化，來觀察MDR-PTB與DS-PTB細胞受損狀態(tài)的不同，從而判斷MDR-PTB是否發(fā)生T淋巴細胞耗竭現(xiàn)象。結果發(fā)現(xiàn)，MDR-PTB患者的CD4-/CD8-PD-1和Tim-3的表達量明顯高于HD組和DS-PTB組，而DS-PTB組數(shù)值雖稍高于HD組，但差異無統(tǒng)計學意義。這提示DS-PTB組T淋巴細胞較HD組已開始出現(xiàn)受損狀態(tài)，而MDR-PTB患者已發(fā)生T淋巴細胞耗竭，且PD-1和Tim-3處于耗竭高峰狀態(tài)。但Lag-3在MDR-PTB患者中的表達量升高與其他兩組的差異均不明顯，這可能與本研究納入患者例數(shù)有限，結果不足以真實反映Lag-3的表達變化有關。

另一方面，IL-2、IFN-γ和TNF-α多由活化的T淋巴細胞分泌，在宿主對抗MTB感染的過程中起著重要作用[19-20]，常被作為分析T淋巴細胞功能的指標。研究發(fā)現(xiàn)，MDR-PTB患者外周血中的Th1和Th2細胞亞群比例失衡，可出現(xiàn)明顯抑制免疫反應和下調IFN-γ和IL-2等細胞因子分泌水平的情況[19]。另有研究認為，當IFN-γ基因缺失時也會降低宿主對MTB的抵抗能力[21]，如CD4-IFN-γ分泌能力在嚴重空洞性肺結核患者中呈下降趨勢[22]，且慢性難治性結核病患者的TNF-α也明顯低于新發(fā)患者，這些均提示IL-2、IFN-γ和TNF-α的分泌水平均與肺結核病情密切相關[23]。本研究證實并擴展了上述對于MDR-PTB患者體外低反應性的觀察。與健康組(HD組)相比，DS-PTB組患者的CD4+、CD8+T淋巴細胞釋放的IL-2、IFN-γ、TNF-α明顯增多，說明DS-PTB雖免疫受損，但仍可以對MTB感染作出快速反應，促炎癥因子迅速升高，可能與Th1對MTB發(fā)生一定程度的免疫抵抗有關。另一方面，MDR-PTB患者的T淋巴細胞釋放的CD4-TNF-α明顯低于DS-PTB患者，說明MDR-PTB患者T淋巴細胞已發(fā)生了耗竭，其抑制性受體的高表達已受到耗竭的影響；同時，CD4-IL-2和CD4-/CD8-IFN-γ的分泌水平也呈現(xiàn)下降趨勢，但差異均無統(tǒng)計學意義，這可能與不同細胞因子對MTB抗原特異性免疫應答的差異性有關。另外，本研究選取的肺結核患者在采血前均未開始有效的抗結核藥物治療，且已剔除了相關并發(fā)癥(腫瘤、糖尿病、支氣管結核、結核性胸膜炎等)、貧血以及營養(yǎng)不良患者，可認為表達情況的差異主要來源于患者對藥物的耐藥程度。

綜上，MDR-PTB患者可因持續(xù)MTB感染而出現(xiàn)T淋巴細胞耗竭，不能有效控制MTB感染進程，從而使得疾病遷延不愈。