王亞翠 孫琳 申阿東

兒童結(jié)核病存在較多漏診和誤診且死亡率相對較高，因此，兒童結(jié)核病的防控面臨著很大的挑戰(zhàn)。目前，兒童結(jié)核病診斷的傳統(tǒng)實驗室檢測方法如抗酸染色、固體培養(yǎng)或液體培養(yǎng)，敏感度低且耗時長。另外，兒童結(jié)核病大多數(shù)為原發(fā)性肺結(jié)核，標本的菌載量較低且不易采集，結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)培養(yǎng)和涂片檢查陽性率低，導(dǎo)致兒童結(jié)核病早期診治相對困難。因此，研發(fā)更加快速、敏感的檢測方法對兒童結(jié)核病的早期診斷和及時治療至關(guān)重要。

GeneXpert MTB/RIF(簡稱“Xpert”)是世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)推薦用于結(jié)核病早期診斷和利福平耐藥檢測的分子診斷技術(shù)。Xpert檢測技術(shù)具有較高的敏感度和特異度，并且能夠準確、快速檢測出MTB及其對利福平的耐藥性。因此，該技術(shù)廣泛應(yīng)用于肺結(jié)核和肺外結(jié)核的診斷。盡管Xpert檢測技術(shù)具有較高的敏感度，但是在含菌量較少的患者(如兒童結(jié)核病患者)中的檢測敏感度較低[1-2]，并且對不同類型的肺外結(jié)核標本檢測敏感度差別較大[3]。為了進一步提高Xpert檢測技術(shù)的敏感度，新一代的Xpert MTB/RIF Ultra(簡稱“Xpert Ultra”)檢測技術(shù)被研發(fā)并應(yīng)用。該檢測技術(shù)已經(jīng)開始應(yīng)用于成人結(jié)核病檢測，并且多項研究結(jié)果證明其診斷成人結(jié)核病的敏感度優(yōu)于Xpert檢測[4-8]。目前，Xpert Ultra檢測技術(shù)在兒童結(jié)核病診斷中的研究相對較少，為此，筆者對其在此方面的研究及應(yīng)用進展進行綜述。

一、Xpert Ultra與Xpert技術(shù)原理對比

2017年3月，WHO推薦使用新一代的檢測方法Xpert Ultra替代Xpert，旨在提高檢測敏感度。與Xpert相比，Xpert Ultra檢測技術(shù)的PCR擴增體系由原來的25 μl增加至50 μl，并且在Xpert檢測單個ropB目的基因的基礎(chǔ)上增加檢測2種多拷貝序列IS6110和IS1081。這些技術(shù)的改進使Xpert Ultra對MTB的檢出下限由原來的112.6 CFU/ml下降為15.6 CFU/ml，與Xpert相比敏感度提高了7倍[9-10]。此外，Xpert Ultra檢測原理由半定量半巢式循環(huán)閾值比較變?yōu)榘攵砍彩絇CR，并采用了高分辨率熔解曲線技術(shù)。改善了Xpert檢測ropB基因突變類型中“沉默突變”錯誤報陽的情況，重新設(shè)計了ropB基因的分子信標，提高了利福平耐藥相關(guān)第553位密碼子突變檢測能力，以及使Q513Q、F514F沉默突變與其他利福平耐藥相關(guān)的決定區(qū)域的突變得以區(qū)分，從而更好地區(qū)分ropB突變種類及在混合感染時檢測利福平耐藥情況。Xpert Ultra檢測技術(shù)的另一個優(yōu)勢是檢測時間明顯縮短，報陽和報陰時間由Xpert的110 min分別縮短至77 min和66 min，從而有利于患者的快速診斷和及時采取治療措施[11]。

二、Xpert Ultra對兒童結(jié)核病診斷的敏感度

(一)Xpert Ultra檢測不同類型標本的敏感度

Xpert Ultra檢測不同類型臨床標本的效能不同。在兒童結(jié)核病診斷中檢測的標本類型包括痰液、胃液、支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)、鼻咽抽吸物、糞便等。目前以痰標本Xpert Ultra檢測開展的研究最多。研究表明，在呼吸道樣本中，Xpert Ultra檢測BALF的敏感度最高，胃液和痰液次之，鼻咽拭子較低[12-16]。痰液是肺結(jié)核診斷應(yīng)用最廣泛的呼吸道樣本類型。以痰標本MTB培養(yǎng)結(jié)果為金標準，Xpert Ultra檢測痰標本診斷肺結(jié)核的敏感度為58%～75%[12-13，15，17]；Meta分析結(jié)果顯示，Xpert檢測痰標本診斷肺結(jié)核的匯總敏感度約為62%[1]。Sun等[14]研究顯示，以MTB培養(yǎng)或涂片抗酸染色鏡檢結(jié)果為金標準時，Xpert Ultra檢測BALF標本診斷肺結(jié)核的敏感度可達91%。Zar等[15]研究顯示，以痰培養(yǎng)結(jié)果為金標準，Xpert Ultra檢測鼻咽抽吸物診斷肺結(jié)核的敏感度為46%。在消化道樣本中，已有很多研究報道了胃液Xpert檢測在兒童結(jié)核病診斷中的準確性[18-23]。Detjen等[1]薈萃分析顯示，Xpert檢測胃液標本診斷肺結(jié)核的匯總敏感度為66%。Sun等[16]研究顯示，以MTB培養(yǎng)結(jié)果為金標準，Xpert Ultra檢測兒童胃液標本診斷肺結(jié)核的敏感度可達87.5%。兩項研究評估了Xpert Ultra檢測兒童糞便標本診斷肺結(jié)核的臨床應(yīng)用價值。Kabir等[24]研究顯示，以痰MTB培養(yǎng)結(jié)果為金標準，Xpert Ultra檢測兒童糞便標本診斷肺結(jié)核的敏感度優(yōu)于Xpert(88.9%vs77.8%)；該研究中糞便標本Xpert Ultra陽性的檢測結(jié)果中80%為“痕量(trace)”。Liu等[25]研究顯示，Xpert Ultra檢測糞便和呼吸道樣本的一致性可達84.1%，檢測糞便樣本診斷兒童肺結(jié)核的敏感度為45.5%，與細菌學(xué)培養(yǎng)敏感度相同。一篇納入9項研究的Meta分析顯示，Xpert檢測糞便標本診斷兒童肺結(jié)核的匯總敏感度為67%[26]，與檢測痰標本的診斷敏感度(62%)相當[1]。

(二)Xpert Ultra診斷培陰涂陰結(jié)核病的敏感度

既往研究顯示，結(jié)核病患兒培養(yǎng)陽性率約為30%～40%[27]，抗酸染色鏡檢陽性率僅為6.8%[28]。因此，在兒童結(jié)核病中也會存在一定比例的培陰涂陰患者。涂陰患者也具有傳染性，約有10%～20%結(jié)核病患者的傳播來源于涂陰患者[29]，并且由于缺乏細菌學(xué)證據(jù)導(dǎo)致誤診誤治，從而使涂陰患者的病死率高達20%[30]。加強該部分患兒的早期快速診斷，對于及早診治尤為重要。目前，關(guān)于Xpert Ultra檢測技術(shù)在涂陰結(jié)核病患者中的應(yīng)用多集中于成人，Xpert Ultra診斷成人培陽涂陰肺結(jié)核患者的敏感度優(yōu)于Xpert，較Xpert提高了13%～25%[4-5，10]。Sabi等[13]研究顯示，在Xpert Ultra和Xpert診斷兒童涂陰肺結(jié)核的敏感度分別為44.4%和27.8%，Xpert Ultra的診斷敏感度明顯高于Xpert。由上述研究結(jié)果可知，Xpert Ultra診斷敏感度相對較好，有助于患兒的早期診斷和早期治療，控制疾病的進展。

(三)Xpert Ultra檢測MTB/HIV雙重感染的敏感度

結(jié)核病是艾滋病患者最常見的機會感染之一，約占20%～50%，艾滋病患者結(jié)核病發(fā)病率是正常人的30倍[31]。艾滋病并發(fā)結(jié)核病患者死亡率較高，特別是兒童患者，免疫損傷更嚴重，導(dǎo)致MTB廣泛播散、病情進展更快和臨床表現(xiàn)復(fù)雜。因此，早期診斷并及時治療對降低此類患者的死亡率至關(guān)重要。Xpert和Xpert Ultra被推薦用于MTB/HIV雙重感染的檢測。2014年WHO出版的《國家結(jié)核病規(guī)劃關(guān)于兒童結(jié)核病處理指南》建議，對疑似HIV感染的結(jié)核病患兒，Xpert可先于培養(yǎng)法和抗酸染色法作為初篩方法[32]。Meta分析顯示，Xpert診斷兒童結(jié)核病并發(fā)HIV感染的匯總敏感度為70%[1]。Sabi等[13]研究表明，Xpert Ultra檢測該類患者的敏感度更高，較Xpert增加了19%。

三、Xpert Ultra診斷兒童結(jié)核病的特異度

Xpert Ultra檢測在敏感度增高的同時不可避免地會引起特異度降低[33]。該檢測方法的特異度受檢測地區(qū)結(jié)核病發(fā)病率及患病人群的影響。在結(jié)核病發(fā)病率低于100/10萬的國家或地區(qū)，Xpert Ultra檢測的特異度為99%；在結(jié)核病發(fā)病率高于100/10萬的國家或地區(qū)，其檢測特異度為95%[2]。結(jié)核病發(fā)病率高的地區(qū)人群有既往結(jié)核病病史的比例高，Xpert Ultra因其檢出限較低能夠檢測到既往感染者體內(nèi)殘存少量的MTB核酸，從而導(dǎo)致其檢測特異度降低。Xpert Ultra檢測各種類型標本用于診斷兒童結(jié)核病時，其特異度較為接近，為96.9%～99.4%[12-16]，高于其在成人檢測中的特異度[4]。這可能與成人既往結(jié)核病病史比例高于兒童有關(guān)(21%vs7%)[33]。

四、Xpert Ultra在實際應(yīng)用中的要點

(一)不同類型標本檢測的處理流程及影響因素

痰液、鼻咽抽吸物、BALF的處理流程類似，加入標本處理液后振蕩并室溫孵育后，加入試劑盒進行檢測。胃液標本因為pH值較低，需要加入等體積1.5%的氫氧化鈉中和胃酸；振蕩并室溫孵育，離心后的沉淀添加標本處理液并加入試劑盒進行檢測。糞便標本因含有較多的雜質(zhì)，與其他標本處理步驟不同。待測糞便標本加入糞便處理液、標本處理液和玻璃珠振蕩混勻并室溫孵育，混合物過濾后才能加入試劑盒進行檢測。

如采集的標本10 d內(nèi)進行檢測，則建議放在2～8 ℃冷藏。如長期儲存則建議冷凍保存。在加入標本處理液之后，如不能立即處理則需要放2 ℃～8 ℃冷藏，并于4 h內(nèi)加入試劑盒進行檢測；如果加入試劑盒后，則需要在30 min內(nèi)上機檢測。標本的儲存時間是否會影響檢出率也存在一些不一致的結(jié)論。例如，Singh等[34]認為，隨著胃液儲存時間延長，Xpert檢測的陽性率也下降，在冷凍儲存650～849 d內(nèi)，其陽性率為77.1%，而超過1050 d后其陽性率降至50%。但該研究結(jié)果也提示，即使采用冷凍存放4年以上的胃液標本，其檢出率也可以達到50%。這可能與分子生物學(xué)方法較高的敏感度有關(guān)。盡管如此，在有條件的情況下，采集標本后盡快進行檢測有助于保證標本的檢出效率。

(二)不同類型樣本的選擇和聯(lián)合應(yīng)用

呼吸道樣本中以痰液、BALF、鼻咽拭子使用較多。由于痰標本采集具有無創(chuàng)性，大年齡、能夠自主咳痰兒童可優(yōu)先選擇采用痰液進行檢測。但是大多數(shù)情況下，兒童肺結(jié)核患者痰標本獲取難度大，不合格率高且含菌量較少，因此，臨床廣泛探索其他呼吸道標本用于Xpert Ultra檢測，以期提高檢出率。在符合氣管鏡檢查指征且行支氣管肺泡灌洗的結(jié)核病患兒中，BALF也是非常有效的檢測標本。但BALF的采集受醫(yī)院資源設(shè)備、醫(yī)生技術(shù)水平等多種因素的影響，在基層醫(yī)院和疾病高負擔國家和地區(qū)應(yīng)用受到一定的限制。另外，鼻咽抽吸物相對容易獲取，也可作用無痰患兒的補充樣本。

除外呼吸道樣本，消化道樣本中胃液和糞便也是兒童結(jié)核病診斷的重要樣本類型。兒童因其生理特點無法咳出呼吸道分泌物，而通過吞咽活動將含有MTB的分泌物吞咽入消化道，在其胃液和糞便標本中可檢測到MTB，因此，適用于排痰困難的兒童。胃液一直被國內(nèi)外推薦作為住院兒童進行病原體檢測的標本類型。例如，德國50%以上的肺結(jié)核患兒都是采用胃液MTB培養(yǎng)得以確診[35]。Meta分析和臨床研究的數(shù)據(jù)也都顯示，Xpert和Xpert Ultra檢測胃液、糞便與呼吸道標本的敏感度接近，甚至略高，均在60%以上[1，25-26]。研究顯示，消化道標本檢出的陽性率隨年齡逐漸下降[16，35]，在小于1歲患兒中檢出率最高[35]，提示胃液標本在咳痰困難的小年齡患兒中診斷價值更高。

因此，Xpert Ultra檢測技術(shù)用于兒童肺結(jié)核診斷時，首先應(yīng)考慮無創(chuàng)性痰標本和鼻咽抽吸物進行檢測。如果患兒不能自主排痰，或者痰液標本質(zhì)量無法達到檢測要求時，可選擇胃液標本。其次，糞便標本也是很好的補充標本類型，但目前仍需要進一步的驗證。在滿足纖維支氣管鏡檢查適應(yīng)證且條件允許時，可考慮BALF檢測。

Zar等[15]指出，2次鼻咽抽吸物取樣用于Xpert Ultra檢測可將其敏感度增加至54%；單次痰標本聯(lián)合單次鼻咽抽吸物進行檢測，Xpert Ultra的敏感度可高達80%；單次痰標本聯(lián)合2次鼻咽抽吸物進行檢測，Xpert Ultra的敏感度可升高至87%。雖然Xpert Ultra檢測鼻咽抽吸物的敏感度低于痰標本，但是多次取樣及聯(lián)合多種不同類型標本進行檢測也可以提高其對MTB的檢出率。因此，針對診斷困難的兒童結(jié)核病患者，尤其是培陰涂陰結(jié)核病和結(jié)核病并發(fā)HIV感染的患兒，選擇敏感度高的分子生物學(xué)方法可提高檢出率，而且多次取樣和聯(lián)合多種標本同時進行檢測也可有效提高其診斷效能。

(三)Xpert Ultra的痕量結(jié)果判讀

Xpert Ultra檢測結(jié)果在Xpert的基礎(chǔ)上增加了“痕量”這一項。“痕量”結(jié)果被認為是導(dǎo)致Xpert Ultra檢測特異度降低的主要原因，通常代表無活力的細菌，尤其在有近期結(jié)核病病史的人群中[9]。然而，由于兒童結(jié)核病患者MTB載量較低，在兒童中Xpert Ultra檢測結(jié)果為“痕量”的患者多數(shù)可診斷為結(jié)核病[13-15]。成人有結(jié)核病病史的比例高于兒童，如果將成人Xpert Ultra檢測為“痕量”患者視為陽性，則容易出現(xiàn)假陽性。為了解決這一問題，研究者將Xpert Ultra 檢測“痕量”結(jié)果給出了3種解讀方案：一是直接將該檢測結(jié)果劃分為陰性結(jié)果；二是將有結(jié)核病病史且出現(xiàn)“痕量”結(jié)果的患者視為陰性；三是重新采集標本再進行Xpert Ultra檢測，如果第2次檢測結(jié)果為陰性則視為陰性患者，如果第2次檢測結(jié)果為陽性則視為陽性患者[4]。研究表明，第1種方案的Xpert Ultra檢測特異度最高，但是以該分類分析Xpert Ultra檢測敏感度也會隨之下降；第2、3種方案在提高Xpert Ultra檢測特異度的同時也維持了相對較高的敏感度[4]。

綜上所述，Xpert Ultra檢測可以明顯提高兒童結(jié)核病患者，以及臨床難以診斷的涂陰肺結(jié)核患者、結(jié)核病并發(fā)HIV感染等載菌量較低患者的檢出率。目前，在兒童群體中Xpert Ultra檢測主要應(yīng)用于肺結(jié)核的診斷，并且當前所用標本多為呼吸道標本和胃液標本。未來，還需要評估Xpert Ultra用于肺外結(jié)核診斷的臨床應(yīng)用價值，探討其對不同類型標本的檢測效能。