程苕莼 李 晗 李 民 羅蕾蕾 顧春燕 卞兆連&

南通大學醫(yī)學院1(226001) 南通大學附屬第三醫(yī)院消化內(nèi)科2 病理科3

背景：白細胞介素-34(IL-34)是一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子，在多種自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用。目的：探討IL-34在原發(fā)性膽汁性膽管炎(PBC)中的表達及其對肝內(nèi)炎癥和膽管損傷的影響。方法：收集26例PBC患者和10例非PBC肝血管瘤患者的肝組織標本，以免疫組化法檢測IL-34表達和定位。采用聚肌胞苷酸腹腔注射在野生型和IL-34基因敲除C57BL/6小鼠中構(gòu)建PBC模型，評價小鼠肝內(nèi)炎癥和膽管損傷情況，以real-time PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測肝組織IL-34以及相關(guān)細胞因子表達。結(jié)果：PBC患者和PBC小鼠模型肝組織IL-34表達均顯著高于相應對照組(P均<0.05)。未造模IL-34基因敲除小鼠肝臟病理學組織形態(tài)無明顯變化，造模IL-34基因敲除小鼠的門管區(qū)炎癥和膽管上皮損傷均明顯重于野生型PBC模型小鼠(P均<0.05)，肝組織促炎細胞因子白細胞介素-1β(IL-1β)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)表達較野生型PBC模型小鼠顯著增高，抗炎細胞因子IL-10和M2型巨噬細胞標志物CD163表達則較野生型PBC模型小鼠顯著降低(P均<0.05)。結(jié)論：PBC時IL-34表達增高可能通過調(diào)節(jié)細胞因子表達、誘導巨噬細胞向M2型分化緩解門管區(qū)炎癥和膽管損傷，實現(xiàn)肝內(nèi)免疫微環(huán)境的負反饋調(diào)控，從而延緩疾病進程。

原發(fā)性膽汁性膽管炎(primary biliary cholan-gitis, PBC)是一種以肝內(nèi)小葉間膽管非化膿性炎癥為主要病理特征的自身免疫性肝病[1-2]。白細胞介素(interleukins, ILs)是體內(nèi)產(chǎn)生最為廣泛的炎癥細胞因子，在免疫調(diào)節(jié)以及多種疾病的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。目前研究顯示，PBC系由環(huán)境因素作用于遺傳易感個體所引發(fā)，其發(fā)病機制復雜，炎癥介質(zhì)與免疫功能紊亂在其中發(fā)揮重要作用[1-3]。研究表明，IL-17、IL-23、IL-33等多種促炎細胞因子水平在PBC患者中顯著升高并與疾病嚴重程度呈正相關(guān)[4-6]。

IL-34廣泛存在于人體組織器官中，通過與相應受體結(jié)合，在多種自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)IL-34可促進CD4+單核細胞增殖，并可誘導巨噬細胞向M2型分化，抑制炎癥反應，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[9-10]。作為一種典型的肝臟特異性自身免疫性疾病，肝內(nèi)免疫失衡是PBC的主要發(fā)病機制[1-3，11]，IL-34作為重要的免疫調(diào)節(jié)因子，其在PBC中的表達變化是否會對PBC病程產(chǎn)生影響，目前尚無相關(guān)研究報道。本研究通過分析IL-34在PBC患者和模型小鼠肝臟中的表達情況，以及IL-34基因敲除對PBC模型小鼠肝內(nèi)炎癥和膽管損傷的影響，以期闡明IL-34在PBC中的作用和意義。

材料與方法

一、臨床樣本收集

2019年9月—2020年9月南通大學附屬第三醫(yī)院收治并確診為PBC的住院患者26例納入研究，其中男性6例，女性20例，年齡(48.5±10.5)歲。入選病例肝臟組織病理學符合PBC，同時滿足反映膽汁淤積的血清生化指標如堿性磷酸酶(ALP)升高，或血清抗線粒體抗體(AMA)或AMA-M2陽性[12]。同期10例在南通大學附屬第三醫(yī)院行肝血管瘤切除術(shù)的非PBC患者作為對照組，其中男性2例，女性8例，年齡(46.0±9.2)歲。所有研究對象均排除病毒性、酒精性、藥物性、脂肪性和遺傳性肝損傷。收集PBC患者的肝穿刺活檢標本和對照組患者的手術(shù)切除標本邊緣正常肝組織，用于IL-34表達檢測。臨床樣本收集和動物實驗均經(jīng)南通大學附屬第三醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準。

二、實驗動物

委托北京華夏凱奇生物技術(shù)有限公司構(gòu)建IL-34基因敲除(IL-34KO)C57BL/6小鼠，經(jīng)飼養(yǎng)繁殖獲得純合子小鼠。野生型C57BL/6小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。選用6～8周齡、體質(zhì)量22～25 g的雌性小鼠進行實驗，實驗動物飼養(yǎng)于南通大學醫(yī)學院SPF級動物房。所有動物實驗均依從《實驗動物飼養(yǎng)管理和使用指南》。

三、方法

1. PBC動物模型制備：首先選取野生型和IL-34KO小鼠各10只，觀察肝臟組織病理學改變，以明確IL-34基因敲除對肝臟病理學組織形態(tài)的影響。隨后選取野生型和IL-34KO小鼠各12只，予腹腔注射5 mg/kg聚肌胞苷酸(Sigma-Aldrich?, Merck KGaA)構(gòu)建PBC模型，每周注射2次，分別于第8周、第12周腹腔注射后2 d脫頸椎處死小鼠，每一時間點兩組小鼠各6只。另選取6只野生型小鼠每周腹腔注射2次0.9% NaCl溶液作為對照組，于第8周脫頸椎處死。各組小鼠處死后取肝組織，用于后續(xù)實驗。

2. 肝組織HE染色和病理學評分：各組小鼠肝組織石蠟包埋、切片，常規(guī)HE染色，光學顯微鏡下觀察并行病理學評分。門管區(qū)炎癥評分：無改變，0分；輕度，1分；中度，2分；重度，3分；極重度，4分。膽管上皮損傷評分：無改變，0分；上皮損傷(僅細胞質(zhì)改變)，1分；上皮損傷伴細胞質(zhì)和細胞核改變，2分；非化膿性破壞性膽管炎，3分；膽管消失，4分。

3. 免疫組化檢測：臨床肝組織標本石蠟包埋、切片，二甲苯、乙醇梯度脫水，微波抗原修復；加入IL-34抗體(Abcam plc.; 1∶200)，4 ℃冰箱過夜；加入HRP耦聯(lián)二抗，室溫孵育30 min；DAB顯色，光學顯微鏡下觀察。細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為IL-34表達陽性。每張切片隨機觀察5個具有代表性的高倍視野，根據(jù)陽性細胞百分比將IL-34表達強度分為0(<25%)、1(25%～50%)、2(50%～75%)、3(>75%)四個等級。

4. 蛋白質(zhì)印跡法：收集各組小鼠肝組織，以RIPA裂解液裂解后收集總蛋白，離心、取上清液，上樣、電泳、PVDF轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗孵育過夜[IL-34抗體(Santa Cruz Biotechnology, Inc.; 1∶200)；內(nèi)參β-actin抗體(1∶5 000)]，TBST洗膜3次，二抗孵育，顯影、定影，使用ImageJ 1.8.0軟件進行圖像分析。

5. Real-time PCR：制備各組小鼠肝組織勻漿，TRIzol試劑(Thermo Fisher Scientific)提取總RNA，檢測RNA濃度和純度；參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和real-time PCR試劑盒(Takara Bio Inc.)說明書進行操作，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以之為模板行PCR擴增，檢測IL-34、IL-1β、單核細胞趨化蛋白-1(mono-cyte chemotactic protein-1, MCP-1)、IL-10、CD163 mRNA表達。PCR引物序列見表1，PCR反應條件：95 ℃ 10 s；62 ℃ 5 s，42個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA相對表達量。

表1 Real-time PCR引物序列

四、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、PBC患者肝組織IL-34表達增強

免疫組化檢測顯示，PBC患者肝組織IL-34表達明顯增強，表達主要定位于門管區(qū)炎癥周圍肝細胞(圖1A)，在門管區(qū)炎癥細胞中亦有少量表達，相對表達量與對照組肝組織相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05；圖1B)。

兩組間比較，***P<0.001

二、PBC模型小鼠肝組織IL-34表達增高

Real-time PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測顯示，與未造模野生型小鼠相比，PBC模型小鼠肝組織 IL-34 mRNA和蛋白表達均明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05；圖2)。

三、IL-34基因敲除對小鼠肝臟病理學無影響

對野生型小鼠和IL-34KO小鼠肝組織切片行HE染色，光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)兩組肝臟小葉結(jié)構(gòu)和門管區(qū)形態(tài)相似(圖3)，表明IL-34基因敲除對小鼠肝臟病理學組織形態(tài)無影響。

四、 IL-34基因敲除加重PBC模型小鼠肝內(nèi)炎癥和膽管損傷

分別建立野生型小鼠和IL-34KO小鼠PBC模型，HE染色觀察兩組小鼠肝內(nèi)炎癥和膽管損傷情況。野生型小鼠造模8周后肝內(nèi)出現(xiàn)輕度門管區(qū)炎癥和輕度膽管上皮損傷；造模時間延長至12周，病理學進展至中度門管區(qū)炎癥和膽管上皮損傷。IL-34KO小鼠造模8周后門管區(qū)炎癥和膽管上皮損傷已達到中度，病理學評分均明顯高于同時間點野生型PBC模型小鼠，差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)；造模12周后，IL-34KO小鼠表現(xiàn)為重度門管區(qū)炎癥和膽管上皮損傷，病理學評分均明顯高于同時間點野生型PBC模型小鼠，差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05；圖4)。

**兩組間比較，P<0.01

五、IL-34基因敲除促進PBC模型小鼠肝內(nèi)促炎細胞因子表達

圖3 IL-34基因敲除對小鼠肝臟病理學無影響(HE染色)

Real-time PCR檢測顯示，造模8周后，IL-34KO PBC模型小鼠肝組織IL-1β、MCP-1 mRNA相對表達量較野生型PBC模型小鼠明顯升高，IL-10 mRNA相對表達量較野生型PBC模型小鼠明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05；圖5A)；造模12周后，兩組間IL-1β、MCP-1、IL-10表達變化趨勢與造模8周后一致，IL-34KO PBC模型小鼠CD163 mRNA相對表達量亦較野生型PBC模型小鼠明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05；圖5 B)。

兩組間比較，*P<0.05，**P<0.01

兩組間比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.000 1； ns, P>0.05

討 論

PBC是一種自身免疫性肝病, 病理學表現(xiàn)為免疫介導的膽管上皮細胞損傷、膽汁淤積和進行性肝纖維化，如未得到有效治療，最終會進展至膽汁性肝硬化。盡管PBC的主要治療藥物熊去氧膽酸被證明具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用，但仍缺乏針對其發(fā)病關(guān)鍵因素——肝內(nèi)免疫功能異常的有效治療手段[13]。作為暴露于病原體的免疫器官，肝臟中存在多種免疫細胞，形成獨特的免疫微環(huán)境，在炎癥情況下可合成各種急性期蛋白，參與機體免疫反應。研究顯示肝內(nèi)免疫耐受破壞是PBC最重要的發(fā)病機制，患者肝內(nèi)門管區(qū)大量淋巴細胞浸潤，形成膽管周圍炎，導致膽管上皮細胞凋亡增加，同時巨噬細胞吞噬凋亡小體的能力下降，進一步放大肝內(nèi)炎癥反應，導致膽管周圍炎進行性加重，最終引起進行性肝損害。多種細胞因子參與了PBC肝內(nèi)炎癥的調(diào)控，探究這些細胞因子調(diào)控肝內(nèi)免疫微環(huán)境的方式和作用機制是目前PBC肝內(nèi)免疫微環(huán)境研究的重點。

IL-34 是近年新發(fā)現(xiàn)的細胞因子，主要生物學功能為誘導單核巨噬細胞增殖和分化、參與炎癥反應，具有誘導機體免疫耐受的潛能，與多種自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。本實驗采用real-time PCR、蛋白質(zhì)印跡法和免疫組化技術(shù)研究了IL-34在肝組織中的表達情況，發(fā)現(xiàn)PBC患者和模型小鼠肝組織中的IL-34表達均顯著增高，其表達主要定位于門管區(qū)周圍肝細胞和門管區(qū)內(nèi)炎癥細胞中，提示IL-34可能對門管區(qū)炎癥具有一定調(diào)控作用。進一步通過構(gòu)建IL-34基因敲除小鼠研究IL-34對PBC肝內(nèi)炎癥和膽管損傷的影響，結(jié)果顯示IL-34基因敲除在生理狀態(tài)下對肝臟病理學組織形態(tài)無影響，但在PBC模型小鼠中，IL-34基因敲除可加重門管區(qū)炎癥和膽管上皮細胞損傷，提示IL-34可能僅在PBC發(fā)病時的特定肝內(nèi)免疫微環(huán)境下發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

MCP-1作為C-C趨化因子家族成員，對單核細胞、巨噬細胞和淋巴細胞具有強趨化活性[14]，其與促炎細胞因子IL-1β能激活多種免疫細胞，通過核因子-κB(NF-κB)通路調(diào)節(jié)炎癥細胞因子、黏附分子以及其他炎癥介質(zhì)表達，參與誘導炎癥反應[15-16]，在肝內(nèi)炎癥反應的啟動和維持中發(fā)揮重要作用。CD163是M2型巨噬細胞標志物，表達于M2型巨噬細胞的細胞膜[17]。IL-10是一種重要的抗炎細胞因子，主要生理功能為抑制巨噬細胞的抗原呈遞作用以及抑制多種促炎細胞因子產(chǎn)生[18]。為驗證IL-34調(diào)控PBC肝內(nèi)免疫的可能性，本研究檢測了上述因子在野生型和IL-34基因敲除PBC模型小鼠肝組織中的表達水平，結(jié)果顯示IL-34基因敲除在PBC模型小鼠中能顯著上調(diào)IL-1β、MCP-1表達，同時下調(diào)IL-10和CD163表達，證實在PBC特定的肝內(nèi)免疫微環(huán)境下，IL-34能抑制肝內(nèi)炎癥反應，誘導巨噬細胞向M2型分化。根據(jù)既往文獻報道，IL-34在不同自身免疫性疾病中的作用并不相同。王娟[19]的研究顯示IL-34可能在過敏性紫癜的免疫應答中發(fā)揮促炎作用，是參與過敏性紫癜血管炎發(fā)生的關(guān)鍵因子之一。Zwicker等[20]的研究則發(fā)現(xiàn)結(jié)腸炎小鼠腸上皮細胞產(chǎn)生的IL-34可下調(diào)單核細胞腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和IL-1β表達，提示IL-34在炎癥性腸病中可能作為免疫調(diào)節(jié)因子減輕腸道炎癥。本研究也發(fā)現(xiàn)IL-34可能通過調(diào)控肝內(nèi)免疫微環(huán)境緩解PBC的肝內(nèi)炎癥和膽管損傷。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)PBC發(fā)病過程中肝內(nèi)IL-34表達明顯增高；IL-34基因敲除可上調(diào)促炎細胞因子表達、下調(diào)抗炎細胞因子和M2型巨噬細胞標志物表達，加重PBC模型小鼠的門管區(qū)炎癥和膽管損傷。上述結(jié)果提示，IL-34在PBC特定的免疫微環(huán)境下可能通過調(diào)節(jié)肝內(nèi)細胞因子表達、誘導巨噬細胞向M2型分化緩解PBC相關(guān)門管區(qū)炎癥和膽管損傷。因此，IL-34或可成為PBC的治療靶點，有望通過調(diào)控IL-34基因表達影響肝內(nèi)免疫微環(huán)境，實現(xiàn)PBC肝內(nèi)免疫的負反饋調(diào)控，從而延緩疾病進程。