史少培 汪芳裕

南京醫(yī)科大學金陵臨床醫(yī)學院消化內(nèi)科(210002)

隨著工業(yè)化的發(fā)展與飲食逐漸西方化，我國炎癥性腸病(IBD)的發(fā)病率逐年升高。目前IBD的發(fā)病機制尚不明確，遺傳基因、腸道屏障受損、菌群失調(diào)等多種因素參與其發(fā)病過程。有研究結果顯示，誘發(fā)IBD的病原體并非某種單一的致病菌，而是由多種病原微生物構成的腸道細菌群落，這種微生物的聚集體稱為細菌生物膜。IBD患者腸道屏障受損，細菌易穿透黏液層直接與腸上皮接觸并定植形成生物膜，造成腸道炎癥[1]。本文就細菌生物膜的一般特征與檢測方法及其IBD中的作用作一綜述。

一、細菌生物膜概述

1. 一般特征：腸道中細菌以浮游或生物膜兩種方式生長。細菌附著于生物或非生物表面，產(chǎn)生胞外聚合物(extra-cellular polymeric substance, EPS)包裹菌落形成生物膜。生物膜成熟后會播散部分細菌至其他地方，形成新的生物膜，造成感染范圍的擴大。有研究指出，脂肪酸、氧氣、一氧化氮、鐵、蛋白酶等均可有效誘導生物膜播散，然而生物膜在腸道中的具體播散機制有待進一步研究[2]。

生物膜形成后，不同菌群可在基質(zhì)內(nèi)互相影響，彼此進行營養(yǎng)交換和信息交流。同時，基質(zhì)相當于為細菌提供了一層保護屏障，生物膜內(nèi)部的細菌對外界壓力有顯著的抵抗力，造成頑固性感染。近年研究證明，生物膜與許多腸道疾病如IBD、結腸癌、家族性腺瘤性息肉病等相關[3]。

2. 形成步驟：生物膜的形成是一個動態(tài)的過程，主要包括5個步驟：①形成生物膜的表面吸附細菌賴以附著的有機或無機營養(yǎng)物質(zhì)，形成調(diào)節(jié)膜，調(diào)節(jié)膜是覆蓋在表面由體液形成的2～10 nm厚的蛋白吸附層，其表面蛋白、糖蛋白可作為特異性受體選擇性與細菌黏附。②細菌可逆性附著。③細菌產(chǎn)生的EPS與黏附表面牢固結合，發(fā)展為不可逆性黏附。④細菌繁殖，黏附細菌分裂增殖形成的微小菌落是生物膜的基本組成單位。⑤成熟的生物膜可播散細菌至其他地方形成新的生物膜[4]。

3. 主要成分：在大多數(shù)細菌生物膜中，微生物占生物膜的10%以下，而EPS占90%以上。EPS與許多功能相關，包括黏附與聚集、保持生物膜水分和酶的活性、充當保護屏障、吸附有機物和無機離子、作為營養(yǎng)物質(zhì)來源、基因信息的交流等[5]。

IBD腸道微生態(tài)失調(diào)主要表現(xiàn)為細菌多樣性減少以及腸桿菌科細菌的增多，包括黏附性大腸埃希菌和侵襲性大腸埃希菌(AIEC)[6]。腸桿菌科細菌生物膜基質(zhì)中主要包含卷曲纖維、纖維素、1型菌毛、鞭毛蛋白、胞外DNA等，其中卷曲纖維占85%以上，是基質(zhì)的重要組成部分。

二、生物膜的檢測方法

掃描電鏡和熒光原位雜交技術(fluorescenceinsituhybridization， FISH)是目前檢測生物膜的金標準。FISH利用熒光標記的特異性DNA探針與樣本DNA雜交之后染色成像，在量化細菌數(shù)量的同時可視化觀察生物膜的立體結構，可定性、定量和相對定位分析DNA。

激光掃描共聚焦顯微鏡(CLSM)結合熒光染料是原位觀察黏膜中生物膜的重要工具[7]。與普通熒光顯微鏡相比，CLSM可對細胞內(nèi)精細結構進行斷層掃描，具有更高的空間分辨率和圖像對比度，可形成清晰的三維圖像。一項體外實驗發(fā)現(xiàn)CLSM下可見生物膜具有多種多樣化的結構，內(nèi)部含有許多通道供細菌間進行營養(yǎng)交換和信息交流[8]。

三、生物膜與IBD的相關性

人體整個胃腸道均可形成生物膜，黏液豐富的區(qū)域微生物密度最高。腸道細菌利用凝膠狀黏液作為基質(zhì)發(fā)展成生物膜結構，同時黏液層也可作為附著于體內(nèi)的媒介[9]。腸上皮細胞分泌黏蛋白，構成黏液屏障，避免了微生物與腸上皮細胞的直接接觸。正常遠端結腸內(nèi)層黏液層致密且無菌，緊密黏附于上皮細胞；而外層的疏松黏液層包含大量細菌，但多是無害的共生菌群，不具侵入性[10]。共生菌形成的生物膜可增強與宿主的相互作用，有利于腸道穩(wěn)態(tài)[11]。

在IBD的發(fā)生、發(fā)展中，特異性黏膜生物膜通過多種途徑引起宿主腸道炎癥反應。致病菌可穿透黏液層，直接與腸上皮細胞接觸，與宿主的免疫和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)相互作用，發(fā)展成慢性黏膜炎癥[1,12]。與健康個體相比，IBD患者活檢標本中黏膜附著的生物膜檢出率明顯增高，且體外培養(yǎng)可形成更大的生物膜。Swidsinski等[13]的研究證實IBD患者腸道黏膜菌群的組成和空間結構均發(fā)生了改變。其中脆弱擬桿菌占80%以上，為IBD的特征菌群。

1. 細菌生物膜的直接促炎作用：腸道是人體微生物定植量最高的器官，其中含有豐富的革蘭陰性桿菌，如腸桿菌屬和沙門菌屬等。在腸桿菌科的生物膜中，主要成分包括卷曲纖維、纖維素、1型菌毛、胞外DNA等。這些基質(zhì)中的成分可與腸黏膜免疫系統(tǒng)相互作用，誘導IBD的發(fā)生。巨噬細胞是腸道固有免疫的重要組成部分，通過模式識別受體識別致病菌合成的保守分子模式，包括細菌胞外結構(如菌毛、鞭毛、脂多糖和肽聚糖)、卷曲纖維、1型菌毛等，可消滅潛在的致病菌。此外，微生物產(chǎn)物的模式識別受體參與激活信號轉導通路，促進吞噬作用和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生[14]。

①卷曲纖維：卷曲纖維是由腸桿菌科的共生菌和致病菌分泌至生物膜胞外基質(zhì)中的一種淀粉樣蛋白，可抵抗蛋白酶的消化作用，增強生物膜抵抗外界惡劣環(huán)境的能力。大腸埃希菌分泌卷曲纖維主要由操縱子基因csg(curli subunit genes)編碼和轉錄，而卷曲纖維的主要成分通過細菌分泌的csgA蛋白亞基自組裝而成。Bian等[15]的研究使用不同大腸埃希菌菌株感染人體巨噬細胞，發(fā)現(xiàn)表達csgA蛋白的菌株誘導巨噬細胞產(chǎn)生的炎癥因子水平均高于不表達csgA蛋白的菌株，證實csgA蛋白可刺激炎癥因子的分泌。此外，體外實驗證實大腸埃希菌在卷曲纖維表達缺失時并不能發(fā)育為成熟的生物膜，可見卷曲纖維與生物膜的成熟和播散相關[16]。

大量研究認為淀粉樣蛋白可促進神經(jīng)退行性疾病的發(fā)展，并且作為損傷相關的分子模式(DAMPs)與小膠質(zhì)細胞表達的Toll樣受體(TLRs)相互作用[17]，而細菌分泌的淀粉樣蛋白有可能調(diào)節(jié)宿主與微生物的相互作用。卷曲纖維作為TLRs異源二聚體TLR1/2的配體可刺激多種細胞類型的免疫反應[5,18]。NOD樣受體(NLRP3)可激活NLRP3炎癥小體，誘導caspase-1的激活和白細胞介素1β(IL-1β)的成熟[19]。Th17細胞是組織炎癥的有效誘導劑，與許多實驗性自身免疫病的發(fā)病相關。分泌卷曲纖維的沙門菌以TLR2依賴的方式增強了Th17的免疫反應，TLR2的激活進一步誘導了IL-17A和IL-22相關的炎性反應[20]。此外，卷曲纖維可結合補體C1q，保護大腸埃希菌免受補體介導的吞噬作用，說明卷曲纖維有助于細菌的免疫逃逸，從而提高細菌的毒性[21]。值得注意的是，共生菌和致病菌表達的卷曲纖維是同源的，卷曲纖維并不作為單獨的毒力因子而起作用。Oppong等[22]研究發(fā)現(xiàn)，口服卷曲纖維可改善TNBS誘導的小鼠腸炎，且與抗TNF-α治療組結果無明顯差異。上皮細胞可對卷曲纖維產(chǎn)生反應，導致屏障功能的加強以及移位細菌的減少。目前關于腸道對卷曲纖維免疫反應的研究結果差異較大，需未來進一步研究明確具體機制。

②纖維素：細菌合成纖維素與其產(chǎn)生卷曲纖維相關。研究證實纖維素的合成是生物膜形成的主要原因，且纖維素可增強AIEC的促炎能力[14,23]。Monteiro等[24]的研究表明，當大腸埃希菌Nissle 1917缺乏纖維素時并不能黏附于上皮細胞，說明纖維素是其形成生物膜所必需的，但該研究使用的是特定的菌株，實驗結果不一定適用于其他菌株。Ellermann等[14]的研究進一步指出，細菌性纖維素可加劇AIEC誘導的IL-10-/-小鼠腸炎，并誘導Th17黏膜免疫反應，但確切的作用機制并不清楚，只能說明纖維素以一種間接機制調(diào)節(jié)宿主黏膜免疫反應，具體調(diào)控機制有待未來進一步闡明。腸道細菌性纖維素與膳食來源的纖維素難以區(qū)分，因此導致目前腸道細菌性纖維素的研究并不廣泛。

③ 1型菌毛：腸桿菌科的1型菌毛可介導細菌附著，有助于生物膜的形成[25-26]。1型菌毛由FimA亞基組成，菌毛末端的FimH黏附素可與宿主細胞直接相互作用。此外，F(xiàn)imH通過TLR4激活先天免疫系統(tǒng)，促進炎癥因子表達和中性粒細胞遷移[27]。腸上皮細胞頂端表達的癌胚抗原相關細胞黏附分子6(CEACAM6)即為一種1型菌毛受體[28]，Denizot等[29]的研究發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，感染AIEC的CEABAC10小鼠出現(xiàn)腸道屏障功能障礙，表現(xiàn)為更嚴重的結腸炎。而阻斷CEACAM6表達或感染AIEC的突變菌株(FimH缺陷)后，炎癥減輕。由此可見，CEACAM6高表達促進了AIEC以FimH依賴的方式進行定植，從而進一步介導炎癥的發(fā)生。

2. 細菌生物膜的間接促炎作用：腸黏膜細菌除直接促炎作用，還可通過產(chǎn)生基因毒素參與炎癥的發(fā)生，其中以脆弱擬桿菌腸毒素(Bacteroidesfragilisenterotoxin, BFT)與IBD和結直腸癌的相關性較為清楚。當產(chǎn)腸毒素脆弱擬桿菌(ETBF)定植于腸黏膜時，可通過激活STAT3和Th17免疫應答多種途徑促進結腸炎的發(fā)展[30-32]。此外，BFT可刺激T84等結腸細胞株中精胺氧化酶(spermine oxidase, SMO)表達持續(xù)增高，造成細胞內(nèi)活性氧含量升高和NLRP3炎癥小體的激活，這一過程與IBD的發(fā)生密切相關[33]。

BFT還可增加腸上皮細胞的通透性，使致病菌與腸上皮細胞直接接觸而誘發(fā)炎癥，而反復炎癥是IBD相關結直腸癌發(fā)生的基礎。有研究[34]發(fā)現(xiàn)，在生物膜覆蓋的腸黏膜中E-cadherin表達下調(diào)，腸上皮通透性增加，腸腔內(nèi)抗原、內(nèi)毒素等進入固有層誘發(fā)炎癥反應，而低水平E-cadherin會進一步導致下游炎癥性疾病和腫瘤相關通路的激活。由此可見，黏膜細菌可通過改變上皮細胞的通透性參與IBD相關結直腸癌的發(fā)生。

四、抗生物膜治療

生物膜是腸道細菌一種自然的生活方式，其本身并不一定是疾病的標志。對于生物膜的研究應重點關注其在疾病中的行為特征，如遠端結腸的生物膜雖然不能代表疾病的發(fā)生，但當黏附于上皮細胞的生物膜增多時應引起關注。在某些特定條件下，生物膜不需要被破壞，而部分黏附于上皮細胞的生物膜則需要被根除。越來越多的證據(jù)表明，細菌生物膜可改變腸上皮通透性，誘發(fā)持續(xù)的炎癥反應。因此推測在腸道菌群誘發(fā)IBD的過程中，生物膜的形成與疾病的發(fā)生、發(fā)展息息相關。防止生物膜的過度生長以及破壞已建立的生物膜至關重要，抗生物膜治療可能是未來治療IBD的一個新方向。目前抗生物膜策略主要包括阻止細菌黏附、防止生物膜的形成、直接殺滅細菌、破壞EPS的結構和功能等。

1. 細菌生物膜的常規(guī)治療：抗菌藥物是目前細菌感染的首選治療方法，但并不能完全根除生物膜。這是由于包裹在基質(zhì)中的細菌大部分處于“休眠”狀態(tài)，整體代謝水平下降，同時EPS中高金屬離子濃度和低pH值使抗菌藥物失活，導致細菌對抗菌藥物的敏感性下降。低劑量抗菌藥物會激活生物膜內(nèi)的細菌，促使其向外界播散，而大量證據(jù)又表明過多使用抗菌藥物會導致一系列不良反應，如宿主菌群失調(diào)、機會致病菌感染風險增加、細菌耐藥等。值得一提的是，生物膜細菌對抗菌藥物的耐藥性較浮游細胞高出1 000倍。除受上述生物膜特性影響外，生物膜耐藥性與其膜內(nèi)細菌群體感應系統(tǒng)相關，生物膜中無數(shù)細胞通過群體感應彼此以建立通信來共享信息細菌，促進病原菌對抗菌藥物耐藥性的增加。因此，群體感應系統(tǒng)抑制劑被認為是抗生物膜治療的新策略，可有效減少細菌毒力，提高抗菌療效。然而，目前群體感應系統(tǒng)調(diào)控生物膜的具體機制尚不明確，且許多抑制劑具有細胞毒性，其安全性有待未來進一步研究[35]。

2. 腸道生物膜的治療：EPS構成了細菌的直接生活環(huán)境，致密結構使抗菌藥物難以滲透至菌膜內(nèi)部的細菌，大大降低了抗菌藥物的殺菌作用。因此，靶向EPS將成為瓦解細菌生物膜的有效方法[36]。

①促進EPS解離：基質(zhì)中含有金屬陽離子(如鈣、鐵、鎂)等，參與維持基質(zhì)的穩(wěn)定性，構成了生物膜緊密連接的三維結構支架。金屬離子的螯合劑除干擾細菌生物膜的穩(wěn)定性外，還可破壞已形成的生物膜。IBD患者腸黏膜細菌培養(yǎng)形成的生物膜更大、細胞更多，且胞內(nèi)鐵濃度含量更高，而普遍觀點認為膳食補鐵會導致IBD疾病惡化和感染風險升高，推測可能是由于改變了共生菌群以及增加了腸桿菌豐度[37-38]。既往觀點認為硫化氫是黏膜防御的重要介質(zhì)，可影響?zhàn)つぱ髁?、調(diào)節(jié)碳酸氫鹽和黏液的分泌[39]。有實驗證實，硫化氫還可減少微生物鐵的攝入量以降低IBD相關生物膜的毒性，并重建黏液屏障，這一發(fā)現(xiàn)為未來靶向宿主炎癥與微生物失調(diào)提供了新的思路[40]。

②益生菌競爭性抑制：益生菌菌株可在腸黏膜表面形成非致病性生物膜，故可阻斷病原菌的黏附。大量動物實驗和臨床研究證實，益生菌可有效誘導IBD患者病情緩解。停止服用益生菌后，糞便中脫落的益生菌菌株急劇減少，推測是由于結腸多種細菌的混合菌膜通常不易滲透新的細菌，因此益生菌療效取決于具體的菌種組成及其自身性質(zhì)[41]。此外，有證據(jù)表明益生菌會干擾抗菌藥物治療后自身菌群的重建，因此未來需制定更個性化的益生菌治療方案以減少對宿主菌群穩(wěn)態(tài)的不良效應[42]。

③藥物遞送系統(tǒng)：納米遞藥系統(tǒng)近來受到廣泛關注，因其具有良好的生物相容性、持續(xù)的穩(wěn)定性、較高的載藥量和包封率，可保證足量的藥物遞送至病變部位[43]。目前實驗或臨床中應用的納米遞藥系統(tǒng)主要包括脂質(zhì)體、無極材料粒子、膠束、聚合物納米粒子等。納米遞藥系統(tǒng)具有減少近端腸道藥物損失、提高局部藥物濃度等特點，在潰瘍性結腸炎的治療中具有廣闊的前景。Tian等[44]的研究制備了由聚乙二醇-b-聚己內(nèi)酯(PEG-b-PCL)和聚己內(nèi)酯-b-聚四氨酯(PCL-b-PQAE)共組裝的一種雙功能膠束，并修飾兩性離子(含羥基的pH敏感羧基甜菜堿衍生物)。這種新型膠束不僅可靶向生物膜，而且兩性離子基團可與胞外DNA、蛋白等相互作用，瓦解生物膜的完整性，提高抗菌效能。目前納米遞藥系統(tǒng)尚未大規(guī)模投入臨床應用，隨著后續(xù)研究的深入，相信未來可發(fā)揮更大的作用。

五、展望

關于腸道菌群在IBD中的發(fā)病機制，大部分傳統(tǒng)研究限于菌種的組成和豐度，而未涉及菌群的空間結構。評估菌群與黏膜的位置關系有助于了解宿主與微生物群落間的相互作用，并指導未來IBD聯(lián)合治療的發(fā)展。目前IBD的藥物治療存在一定的局限性，尋找新的治療藥物刻不容緩，抗生物膜治療提供了一種新的選擇。然而生物膜同時參與腸道穩(wěn)態(tài)的構建，未來需研究出更具特異性的生物膜清除方法。此外，生物膜究竟是疾病的病因還是結果，是疾病的標志還是可以干預治療的潛在靶點，均需行進一步探索。