蘇 萌 張 斌 陳 敏 王 雷 徐桂芳 呂 瑛 鄒曉平&

南京醫(yī)科大學(xué)鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院1(210008) 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院消化內(nèi)科2

背景：研究發(fā)現(xiàn)質(zhì)子泵抑制劑(PPI)可增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的化療敏感性，抑制胃癌細(xì)胞增殖和侵襲。目的：探討PPI是否系通過影響細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)對胃癌細(xì)胞發(fā)揮化療增敏作用。方法：以不同濃度泮托拉唑處理人胃癌細(xì)胞株AGS和HGC27，CCK-8實(shí)驗檢測細(xì)胞活力，轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)合KEGG富集分析明確PPI對胃癌細(xì)胞周期的影響，流式細(xì)胞分析、real-time PCR和蛋白質(zhì)印跡法驗證細(xì)胞周期及其相關(guān)基因表達(dá)變化。利用生物信息學(xué)網(wǎng)站分析主要細(xì)胞周期相關(guān)差異表達(dá)基因在胃癌組織中的表達(dá)及其與患者預(yù)后的關(guān)系。CCK-8實(shí)驗檢測PPI聯(lián)合順鉑對轉(zhuǎn)染FOXM1過表達(dá)質(zhì)?；蚩蛰d質(zhì)粒的胃癌細(xì)胞的增殖抑制效果。結(jié)果：PPI可有效抑制胃癌細(xì)胞體外增殖。轉(zhuǎn)錄組測序和KEGG富集分析顯示經(jīng)PPI處理的胃癌細(xì)胞G2/M期相關(guān)基因FOXM1、PLK1、AURKB等表達(dá)下調(diào)，并出現(xiàn)G2/M期阻滯，上述發(fā)現(xiàn)經(jīng)流式細(xì)胞分析以及real-time PCR和蛋白質(zhì)印跡法證實(shí)。生物信息學(xué)分析顯示上述G2/M期相關(guān)基因在胃癌組織中的表達(dá)顯著上調(diào)，并與預(yù)后不良相關(guān)。PPI聯(lián)合順鉑對胃癌細(xì)胞的增殖抑制作用顯著強(qiáng)于順鉑單藥處理，但可被過表達(dá)FOXM1部分逆轉(zhuǎn)。結(jié)論：PPI可通過下調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)誘導(dǎo)G2/M期阻滯，從而增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的化療敏感性。

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，在全球癌癥統(tǒng)計中，其發(fā)病率和死亡率分居第五和第三位，包括中國在內(nèi)的東亞地區(qū)胃癌發(fā)病率普遍較高[1-2]。隨著化療藥物和化療方案的不斷優(yōu)化，晚期胃癌患者的生存期得以明顯延長，但中位生存期仍難以超過1年，多藥耐藥是胃癌患者預(yù)后不良的主要原因之一[3]。有效逆轉(zhuǎn)胃癌多藥耐藥、增強(qiáng)胃癌對化療藥物的敏感性一直是胃癌治療的難點(diǎn)和研究熱點(diǎn)。

質(zhì)子泵抑制劑(proton pump inhibitors, PPIs)作為抑酸藥，是治療胃食管反流病、消化性潰瘍等酸相關(guān)疾病的首選藥物[4]，近年發(fā)現(xiàn)其在腫瘤治療方面也具有潛在應(yīng)用價值。研究顯示PPI可通過改變細(xì)胞內(nèi)外pH值、增加細(xì)胞內(nèi)活性氧水平等發(fā)揮增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞化療敏感性、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡等作用[5-9]。本課題組之前的研究已證實(shí)PPI預(yù)處理可增強(qiáng)胃癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性，抑制胃癌細(xì)胞增殖和侵襲[10-11]。

腫瘤細(xì)胞具有快速、持續(xù)增殖的特性，活躍的細(xì)胞周期進(jìn)程是其無限增殖的關(guān)鍵因素之一。影響細(xì)胞周期進(jìn)程也是腫瘤化療的關(guān)鍵作用機(jī)制，很多化療藥物系通過特定靶點(diǎn)影響腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)程，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。本研究以PPI處理人胃癌細(xì)胞株，采用體外實(shí)驗與生物信息學(xué)分析相結(jié)合的方法，探討PPI是否系通過影響細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞周期阻滯，從而發(fā)揮化療增敏作用，以期為闡明PPI抑制胃癌惡性生物學(xué)行為的可能作用機(jī)制提供更多理論依據(jù)。

材料與方法

一、細(xì)胞株和主要試劑

人胃癌細(xì)胞株AGS、HGC27購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，使用10% RPMI 1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，經(jīng)觀察細(xì)胞緊密排列、融合度達(dá)到80%～90%后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗。

泮托拉唑鈉(Takeda GmbH)；CCK-8細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測試劑、HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR、SYBR qPCR Master Mix(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)；TRIzol RNA分離試劑、Lipofect-amineTM3000轉(zhuǎn)染試劑(Thermo Fisher Scientific)；NEBNext?UltraTMⅡ RNA Library Prep Kit for Illu-mina?(New England Biolabs.)；細(xì)胞周期檢測試劑盒(南京福麥斯生物技術(shù)有限公司)；RIPA裂解液、蛋白質(zhì)定量試劑盒(碧云天生物)；兔抗人叉頭框蛋白M1(forkhead box M1, FOXM1)單克隆抗體、鼠抗人Polo樣激酶1(Polo-like kinase 1, PLK1)單克隆抗體、兔抗人Aurora激酶B(Aurora kinase B, AURKB)單克隆抗體、HRP標(biāo)記抗小鼠、抗兔IgG(Cell Signaling Technology, Inc.)；兔抗人周期蛋白B1(cyclin B1, CCNB1)單克隆抗體、兔抗人周期蛋白依賴性激酶1(cyclin-dependent kinase 1, CDK1)單克隆抗體(南京巴傲得生物科技有限公司)；鼠抗人β-actin單克隆抗體(Sigma-Aldrich, Merck KGaA)； pcDNA3.1-HA-FOXM1過表達(dá)質(zhì)粒為南京醫(yī)科大學(xué)鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院實(shí)驗室保存。

二、方法

1. CCK-8實(shí)驗：將2株胃癌細(xì)胞消化成細(xì)胞懸液，以每孔3 000細(xì)胞/100 μL接種于96孔板，24 h后加入不同濃度泮托拉唑，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。每一處理組設(shè)6個復(fù)孔，同時設(shè)置不予PPI處理的對照組和無細(xì)胞空白組。處理結(jié)束后棄去完全培養(yǎng)基，每孔加入100 μL含10% CCK-8的無血清培養(yǎng)基，孵育1～2 h。以酶標(biāo)儀測定各孔450 nm處吸光度值(A值)，計算細(xì)胞相對活力。細(xì)胞相對活力=(處理組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)×100%。

2. 轉(zhuǎn)錄組測序：培養(yǎng)于6孔板中的AGS、HGC27細(xì)胞分別以含相應(yīng)濃度泮托拉唑或不含泮托拉唑的完全培養(yǎng)基處理48 h，PBS洗滌3次，室溫下TRIzol試劑提取總RNA。每一樣品使用3 mg RNA作為RNA樣品制備的輸入材料，使用NEBNext?UltraTMⅡ RNA Library Prep Kit for Illumina?生成測序文庫，庫檢合格后上機(jī)測序并行KEGG通路富集分析，篩選有顯著意義的信號通路。

3. 細(xì)胞周期檢測：收集經(jīng)泮托拉唑處理48 h的胃癌細(xì)胞，同時設(shè)置不予PPI處理的對照組，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作，75%乙醇固定2 h，1 500×g離心5 min，棄去上清液，PI染色，37 ℃避光溫浴30 min，上流式細(xì)胞儀檢測。

4. 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和化療藥物干預(yù)：轉(zhuǎn)染前一天將胃癌細(xì)胞在6孔板中鋪板，鋪板數(shù)量以24 h后細(xì)胞密度達(dá)到50%～70%為宜。根據(jù)試劑說明書進(jìn)行操作，分別轉(zhuǎn)染FOXM1過表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-HA-FOXM1和空載質(zhì)粒，24～72 h后更換新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗。

將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞制成懸液，以每孔3 000細(xì)胞/100 μL接種于96孔板，予2 μmol/L順鉑(cisplatin, DDP)單藥或40 μg/mL PPI+2 μmol/L DDP聯(lián)合處理48 h，同時設(shè)置不予PPI處理的對照組和無細(xì)胞空白組，CCK-8實(shí)驗檢測細(xì)胞活力。

5. Real-time PCR：TRIzol試劑提取各組胃癌細(xì)胞總RNA，超微量光度計測定RNA濃度和質(zhì)量，配置20 μL逆轉(zhuǎn)錄體系，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，行real-time PCR擴(kuò)增，操作均按試劑說明書進(jìn)行，目的基因PCR引物序列見表1。2-△△Ct法計算目的基因mRNA相對表達(dá)量。

表1 Real-time PCR引物序列

6. 蛋白質(zhì)印跡法：將RIPA裂解液、PMSF(100×)、蛋白酶抑制劑混合物(25×)以95∶1∶4的比例配制蛋白完全裂解液裂解各組胃癌細(xì)胞，低溫高速離心10 min，取上清液，BCA法定量，高溫變性樣品蛋白。蛋白上樣，行SDS-PAGE凝膠電泳(90 V 30 min, 120 V 60 min)，預(yù)冷轉(zhuǎn)膜緩沖液中200 mA 120 min轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶常溫封閉2 h，剪膜，4 ℃孵育一抗超過8 h，洗膜后室溫孵育二抗2 h，洗膜后顯影、定影。

7. 生物信息學(xué)分析：利用基因表達(dá)譜交互分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis, GEPIA)數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn/)和Kaplan-Meier Plotter(http://kmplot.com/analysis/)行細(xì)胞周期G2/M期相關(guān)基因表達(dá)水平分析和預(yù)后分析。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、PPI抑制胃癌細(xì)胞增殖

CCK-8實(shí)驗結(jié)果顯示，AGS、HGC27細(xì)胞經(jīng)PPI(>50 μg/mL)處理48 h后，細(xì)胞活力顯著受抑，PPI抑制2株胃癌細(xì)胞的50%最低抑菌濃度(IC50)分別為127 μg/mL和88 μg/mL(圖1)，表明PPI可有效抑制胃癌細(xì)胞體外增殖。

二、PPI對胃癌細(xì)胞基因表達(dá)的調(diào)控

根據(jù)相應(yīng)IC50值，分別以100 μg/mL和80 μg/mL PPI處理AGS和HGC27細(xì)胞，48 h后行轉(zhuǎn)錄組測序。AGS細(xì)胞中有9 959個基因表達(dá)發(fā)生變化，其中4 886個基因表達(dá)上調(diào)，5 073個基因表達(dá)下調(diào)；HGC27細(xì)胞有11 811個基因表達(dá)發(fā)生變化，其中5 726個基因表達(dá)上調(diào)，6 085個基因表達(dá)下調(diào)(圖2A)。對2株胃癌細(xì)胞的差異表達(dá)基因取交集，KEGG通路富集分析顯示細(xì)胞周期相關(guān)通路(調(diào)控細(xì)胞周期G2/M期轉(zhuǎn)變、DNA復(fù)制、染色體分離等)變化最為顯著(圖2B)。

三、PPI通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞G2/M期阻滯

流式細(xì)胞分析顯示，AGS、HGC27細(xì)胞分別經(jīng)100 μg/mL和80 μg/mL PPI處理48 h后，均發(fā)生明顯的G2/M期阻滯(P均<0.05；圖3A)。對轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)G2/M期相關(guān)基因FOXM1、PLK1、AURKB、CCNB1、CDK1表達(dá)水平均有不同程度的下調(diào)。以real-time PCR和蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行驗證，結(jié)果證實(shí)上述基因在AGS、HGC27細(xì)胞中的表達(dá)可被PPI顯著抑制(P均<0.05；圖3B、3C)，表明PPI可通過抑制細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞G2/M期阻滯。

四、G2/M期相關(guān)基因在胃癌中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系

利用GEPIA數(shù)據(jù)庫提取癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCGA)數(shù)據(jù)庫STAD(stomach adenocarcinoma)隊列中的胃癌組織基因表達(dá)數(shù)據(jù)(n=408)和TCGA、基因型-組織表達(dá)數(shù)據(jù)庫(Geno-type-Tissue Expression, GTEx)中的正常胃上皮組織基因表達(dá)數(shù)據(jù)(n=211)。與正常胃上皮組織相比，胃癌組織中G2/M期相關(guān)基因FOXM1、PLK1、AURKB表達(dá)均明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05；圖4A)。

利用Kaplan-Meier Plotter分析FOXM1、PLK1、AURKB基因表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系，總生存期(overall survival, OS)和無進(jìn)展生存期(progression-free survival, PFS)分析分別納入875例和640例胃癌患者，結(jié)果顯示，除FOXM1高、低表達(dá)組間OS無明顯差異外，上述基因高表達(dá)者預(yù)后均明顯差于低表達(dá)者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05；圖4B)。

圖1 PPI處理48 h后胃癌細(xì)胞相對活力(CCK-8實(shí)驗)

A：AGS、HGC27細(xì)胞經(jīng)PPI處理后轉(zhuǎn)錄組測序火山圖；B：2株胃癌細(xì)胞差異表達(dá)基因取交集后KEGG通路富集分析氣泡圖

兩組間比較，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.000 1; ns, P>0.05

五、過表達(dá)FOXM1逆轉(zhuǎn)PPI對胃癌細(xì)胞的化療增敏作用

AGS、HGC27細(xì)胞轉(zhuǎn)染FOXM1過表達(dá)質(zhì)粒3 d后，以蛋白質(zhì)印跡法驗證轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示與轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的對照組相比，轉(zhuǎn)染FOXM1過表達(dá)質(zhì)粒的胃癌細(xì)胞中FOXM1蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(圖5A)。

轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒和FOXM1過表達(dá)質(zhì)粒的胃癌細(xì)胞經(jīng)2 μmol/L DDP單藥或40 μg/mL PPI+2 μmol/L DDP聯(lián)合處理48 h后，CCK-8實(shí)驗結(jié)果顯示，與DDP單藥處理相比，PPI+DDP聯(lián)合處理對胃癌細(xì)胞活力的抑制作用更為顯著，而過表達(dá)FOXM1基因可部分逆轉(zhuǎn)此種增殖抑制作用(圖5B)，表明過表達(dá)FOXM1能逆轉(zhuǎn)PPI對胃癌細(xì)胞的化療增敏作用。

兩組間比較，*P<0.05

兩組間比較，**P<0.01，***P<0.001

討 論

胃癌是一個全球性的健康問題，全世界每年有100余萬人被新診斷為胃癌。在過去50年中，盡管胃癌發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)有所下降，但在世界大部分地區(qū)，胃癌仍然保持著75%的高病死率[12]。

近年來，有關(guān)PPI抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展的文獻(xiàn)陸續(xù)發(fā)表。研究顯示PPI預(yù)處理可通過抑制液泡-H+-ATP酶(vacuolar-H+-ATPase, V-H+-ATP酶)表達(dá)和活性、提高細(xì)胞外和溶酶體細(xì)胞器pH值、增加化療藥物在胞質(zhì)內(nèi)的停留時間、抑制自噬等機(jī)制提高腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性[6,13-15]；此外，PPI還可通過影響游離脂肪酸合成抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16]。在幽門螺桿菌(Helicobacterpylori, Hp)相關(guān)胃癌中，PPI可通過抑制MAPK ERK1/2信號通路抑制Hp介導(dǎo)的腫瘤血管生成[17]。

本課題組前期也針對PPI抑制胃癌進(jìn)行了一系列研究，相繼證明PPI可通過影響胃癌中低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)的表達(dá)和分布抑制胃癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18]；PPI可靶向STAT3、V-H+-ATP酶/mTOR/HIF-1α、Akt/GSK-3β/β-catenin等信號通路以及通過逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)提高胃癌的化療敏感性[10,19-20]；PPI還可通過STAT3依賴的方式調(diào)節(jié)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)基因啟動子區(qū)活性以抑制其表達(dá)，進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞侵襲[11]。但迄今尚未就PPI對胃癌細(xì)胞周期的影響進(jìn)行深入研究。

細(xì)胞周期阻滯是抑制腫瘤細(xì)胞增殖的關(guān)鍵策略之一，尋找并抑制其中的關(guān)鍵靶點(diǎn)有助于為腫瘤治療和預(yù)防提供新思路。本研究利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)篩選經(jīng)PPI處理的胃癌細(xì)胞的差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)調(diào)控細(xì)胞周期G2/M期的關(guān)鍵基因FOXM1、PLK1、AURKB、CCNB1、CDK1表達(dá)受抑，且對差異表達(dá)基因的KEGG富集分析也提示PPI處理可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞G2/M期阻滯。CCNB1和CDK1是參與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)程的關(guān)鍵蛋白已為大量研究所確認(rèn)。PLK1參與有絲分裂和胞質(zhì)分裂的各個環(huán)節(jié)，在細(xì)胞周期G2/M期進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。AURKB可通過磷酸化PLK1介導(dǎo)染色體的精確分離[21-22]。FOXM1可通過促進(jìn)G2/M期轉(zhuǎn)變促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程[23-24]。本研究流式細(xì)胞分析證實(shí)PPI可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯，應(yīng)用real-time PCR和蛋白質(zhì)印跡法對轉(zhuǎn)錄組測序差異表達(dá)譜進(jìn)行驗證，也證實(shí)了PPI作用于胃癌細(xì)胞可顯著抑制上述調(diào)控G2/M期進(jìn)程的重要分子表達(dá)。進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析提示胃癌組織中FOXM1、PLK1、AURKB基因表達(dá)顯著高于正常胃上皮組織，且其高表達(dá)與預(yù)后不良顯著相關(guān)。綜合上述研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXM1、PLK1、AURKB可能是PPI誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯，進(jìn)而抑制胃癌進(jìn)展的關(guān)鍵靶點(diǎn)。既往研究顯示抑制PLK1、AURKB表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提高胃癌細(xì)胞對DDP的化療敏感性[25-26]，但未見抑制FOXM1是否會影響DDP對胃癌化療效果的報道。為此，本研究對抑制FOXM1的化療增敏作用進(jìn)行了驗證，結(jié)果顯示過表達(dá)FOXM1可部分逆轉(zhuǎn)PPI聯(lián)合DDP對胃癌細(xì)胞增殖活性的抑制作用，表明PPI可通過抑制FOXM1表達(dá)增強(qiáng)其化療敏感性。

綜上所述，細(xì)胞周期相關(guān)基因FOXM1、PLK1、AURKB等在胃癌細(xì)胞中高表達(dá)并與預(yù)后不良相關(guān)；PPI可通過下調(diào)上述細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯，從而增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的化療敏感性。PPI作為臨床常用藥物，具有較好的安全性[27]，因此有望作為一種新的胃癌化療增敏藥物在胃癌臨床治療中發(fā)揮作用。本研究結(jié)果為PPI抑制胃癌惡性生物學(xué)行為的研究積累了更多的理論依據(jù)。